蒼術(shù)揮發(fā)油和蒼術(shù)醇提物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的改善作用及其效果比較

林 雄,瞿領(lǐng)航,許 靜,劉春蓮,李水清,劉艷菊,2

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥炮制教研室，湖北 武漢 430065；2.湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430065）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因未明的慢性非特異性腸道炎癥，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和黏液膿血便等。目前，治療UC的藥物包括氨基水楊酸類藥物、糖皮質(zhì)激素類藥物、免疫抑制劑、抗生素、益生菌和生物制劑等，但長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生較大毒副作用［1］。UC與中醫(yī)學(xué)中的“泄瀉”、“久痢”和“休息痢”等病相對(duì)應(yīng)［2］。中藥對(duì)UC治療表現(xiàn)出多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)和多靶點(diǎn)調(diào)控的特點(diǎn)。近年來(lái)，中藥治療UC顯現(xiàn)良好療效，且副作用小。

蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)或北蒼術(shù)的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，稱為“術(shù)”，味苦溫，主風(fēng)寒濕痹死?。?］。蒼術(shù)是中醫(yī)臨床常用中藥，現(xiàn)代藥理研究［4］表明：蒼術(shù)具有抗胃潰瘍、抗菌、抗病毒和增強(qiáng)免疫等作用。在胃腸道疾病治療方面，蒼術(shù)對(duì)于改善濕阻中焦、脘腹脹滿和泄瀉等癥狀效果明顯。中醫(yī)古籍記載，蒼術(shù)具有治療泄瀉、久痢等病癥的功效，如《丹溪心法》載有“泄瀉，有濕、火、氣虛、痰積。濕用四苓散加蒼術(shù)，甚者蒼白二術(shù)同加，炒用燥濕兼滲泄”。蒼術(shù)揮發(fā)油和醇提物在抗炎和腸道屏障保護(hù)等方面作用較強(qiáng)。研究［5-6］顯示：蒼術(shù)揮發(fā)油能夠通過(guò)抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β） 和 白 細(xì) 胞 介 素6（interleukin-6，IL-6）等表達(dá)而改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，可通過(guò)保護(hù)腸道屏障而改善腸易激綜合征。蒼術(shù)醇提物可通過(guò)抑制蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/核 因 子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用來(lái)改善胃潰瘍，焦蒼術(shù)醇提物較其水提物抗腹瀉作用更強(qiáng)［7-8］。然而，目前關(guān)于蒼術(shù)對(duì)UC動(dòng)物模型治療作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。相較于蒼術(shù)揮發(fā)油，蒼術(shù)醇提物中除含揮發(fā)油類脂溶性成分外，還含有水溶性成分。本研究以UC小鼠為模型，對(duì)蒼術(shù)揮發(fā)油和醇提物2種提取物進(jìn)行藥效研究，探討其對(duì)UC模型小鼠癥狀的改善作用，并確定最佳有效部位。旨在挖掘蒼術(shù)的潛在功效，為擴(kuò)大其臨床用藥和新藥開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SPF級(jí)BALB/c小鼠，雄性，40只，體質(zhì)量18～22 g，由三峽大學(xué)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017-0012。小鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，自由進(jìn)食和飲水，環(huán)境溫度為（22±2）℃，濕度為（55±5）%，12 h光照和12 h黑暗循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。蒼術(shù)采自湖北省英山縣，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊紅兵教授鑒定為菊科蒼術(shù)屬植物茅蒼術(shù)的干燥根莖；葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司，柳氮磺吡啶腸溶片購(gòu)自上海信誼天平藥業(yè)有限公司，無(wú)水乙醇和吐溫80購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，隱血試劑盒和髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，通用型組織固定液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，TRIzol購(gòu)自安迪福諾生物科技有限公司，Q RT SuperMix for qPCR和SYBR qPCR Master Mix購(gòu) 自 南 京 諾 唯贊生物科技股份有限公司，TNF-α、IL-6單克隆抗體和IL-1β多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。病理切片機(jī)購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司，NIKON ECLIPSE CI型正置熒光顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司，1580R型離心機(jī)購(gòu)自韓國(guó)Gene Company Limited公司，Nano-600型超微量核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自上海嘉鵬科技有限公司，qTOWER3 G型PCR儀 購(gòu)自德國(guó)Analytik Jena AG公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物制備稱取DSS試劑3.5 g，純水溶解制得3.5% DSS溶液。稱取蒼術(shù)飲片200 g，經(jīng)打粉，水蒸氣蒸餾法制得蒼術(shù)揮發(fā)油，密封后置于－20℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。蒼術(shù)揮發(fā)油得率=（揮發(fā)油質(zhì)量/飲片質(zhì)量）×100%。經(jīng)計(jì)算蒼術(shù)揮發(fā)油得率為5%。取適量蒼術(shù)揮發(fā)油，加入1%（W/V）吐溫80，純水溶解制得18.5 g·L－1（生藥量369 g·L－1）蒼術(shù)揮發(fā)油。稱取蒼術(shù)飲片200 g，經(jīng)打粉，80%乙醇超聲提取，過(guò)濾，濾液旋蒸濃縮并真空干燥后得蒼術(shù)醇提物浸膏，置于－20℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩Ｉn術(shù)醇提物得率=（醇提物質(zhì)量/飲片質(zhì)量）×100%。經(jīng)計(jì)算蒼術(shù)醇提物得率為30%。取適量蒼術(shù)醇提物，加入1%（W/V）吐溫80，純水溶解制得110.7 g·L－1（生藥量369 g·L－1）蒼術(shù)醇提物。稱取柳氮磺吡啶0.25 g，純水溶解制得25 g·L－1柳氮磺吡啶。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組造模40只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、蒼術(shù)揮發(fā)油組、蒼術(shù)醇提物組和柳氮磺吡啶組，每組8只。自第1天起，正常組小鼠自由飲用純水，其余各組小鼠自由飲用3.5% DSS溶液，每2 d更換一次純水和新配制的DSS溶液［9］。蒼術(shù)揮發(fā)油組、蒼術(shù)醇提物組和柳氮磺吡啶組小鼠自 第2天 起 均 按10 mL·kg－1灌胃給藥，每 日1次，共7 d。依據(jù)現(xiàn)版《中國(guó)藥典》［3］規(guī)定蒼術(shù)飲片用量為3～9 g，以成人體質(zhì)量60 kg用藥劑量為9 g計(jì)，按照小鼠與人劑量換算系數(shù)12.3計(jì)算，飲片給藥劑量為1.845 g·kg－1，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)并結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果［10］，以2倍劑量即3.690 g·kg－1為給藥劑量，同時(shí)計(jì)算出蒼術(shù)揮發(fā)油組給藥劑量為0.185 g·kg－1，蒼術(shù)醇提物組給藥劑量為1.107 g·kg－1，柳氮磺吡啶組給藥劑量為0.250 g·kg－1。

1.4 測(cè)量各組小鼠體質(zhì)量和計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分自實(shí)驗(yàn)第1天起，每天于相同時(shí)間段內(nèi)，稱量并記錄各組小鼠體質(zhì)量，計(jì)算各組小鼠體質(zhì)量變化率，觀察并記錄各組小鼠大便性狀及便血情況，按照隱血試劑盒說(shuō)明檢測(cè)小鼠大便隱血情況，按參考文獻(xiàn)［11］計(jì)算DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（表1）。體質(zhì)量變化率=（起始體質(zhì)量－實(shí)驗(yàn)當(dāng)天體質(zhì)量）/起始體質(zhì)量×100%，DAI評(píng)分=體質(zhì)量變化評(píng)分+大便性狀評(píng)分+隱血或血便評(píng)分。

表1 各組小鼠DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 DAI score standard of mice in various groups

1.5 測(cè)量各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和計(jì)算脾臟系數(shù)末次給藥后處死小鼠，取小鼠結(jié)腸和脾臟。直尺測(cè)量結(jié)腸自然長(zhǎng)度，并拍照。濾紙吸干脾臟外表面血液，稱量并記錄小鼠脾臟質(zhì)量。脾臟系數(shù)=小鼠脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

1.6 檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織MPO活性冰生理鹽水清洗結(jié)腸，剪取約1 cm遠(yuǎn)端結(jié)腸，置于4%多聚甲醛中固定48 h以上，其余部分裝入離心管中，于－80℃條件下保存?zhèn)溆?。稱取適量?jī)龃娼Y(jié)腸組織，按照MPO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)結(jié)腸組織MPO活性，單位為U·g－1組織濕重。

1.7 HE染色觀察各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)取多聚甲醛固定的結(jié)腸組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋和組織切片后，HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)、黏膜、杯狀細(xì)胞、絨毛排列和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等形態(tài)表現(xiàn)并拍照。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平稱取適量?jī)龃娴慕Y(jié)腸組織，加入1 mL TRIzol，4℃下研磨，加入200 μL三氯甲烷，震蕩后靜置；取離心后上清液，加入500 μL異丙醇，渦旋后靜置；棄上清，加入75%乙醇，渦旋后離心，棄上清，提取總RNA。加入適量DEPC水溶解RNA，采用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度和濃度，按照Q RT SuperMix for qPCR試劑盒說(shuō)明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA按照SYBR qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。PCR引物由北京擎科生物科技有限公司提供，以β-actin為內(nèi)參。β-actin上 游 引 物 為5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，下 游 引 物 為5′-TTTGATGTCACGCACGATTT-3′，長(zhǎng) 度224 bp；TNF-α上 游 引 物 為5′-TATGGCTCAGGGTCCAACTC-3′，下 游 引 物 為5′-GCTCCAGTGAATTCGGAAAG-3′， 長(zhǎng) 度140 bp；IL-1β上游引物為5′-TCCAGGATGAGGACATGAGCAC-3′，下 游 引 物 為5′-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3′，長(zhǎng) 度105 bp；IL-6上 游 引 物 為5′-AGACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGA-3′，下 游 引 物 為5′-GCCACTCCTTCTGTGACTCCAGC-3′，長(zhǎng) 度146 bp。采 用2－ΔΔCt法計(jì)算各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平。

1.9 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子陽(yáng)性表達(dá)情況各組小鼠結(jié)腸組織石蠟塊切片脫蠟后抗原修復(fù)，4℃一抗和二抗孵育，顯色并采用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水并封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6陽(yáng)性表達(dá)情況，其中藍(lán)色為細(xì)胞核，棕黃色為相應(yīng)炎癥因子的陽(yáng)性表達(dá)。

1.10 阿利新藍(lán)-過(guò)碘酸-雪夫（alcian blue-periodic acid-Schiff，AB-PAS）染色觀察各組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)各組小鼠結(jié)腸組織石蠟塊切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后，采用AB染色液染色，過(guò)碘酸溶液浸泡并加入Schiff試劑反應(yīng)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)，酸性黏液物質(zhì)呈藍(lán)色，糖原和中性黏液物質(zhì)呈紅色。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠體質(zhì)量、DAI評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度、脾臟系數(shù)、結(jié)腸組織中MPO活性和結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量和DAI評(píng)分與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量自第5天降低，第7和8天明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，蒼術(shù)揮發(fā)油組、蒼術(shù)醇提物組和柳氮磺吡啶組小鼠第7和8天體質(zhì)量均升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。與正常組比較，模型組小鼠DAI評(píng)分第4～8天升高（P＜0.05）；與模型組比較，蒼術(shù)揮發(fā)油組、蒼術(shù)醇提物組和柳氮磺吡啶組小鼠DAI評(píng)分第6～8天明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 各組小鼠體質(zhì)量Tab.2 Body weights of mice in various groups (n=8，±s，m/g）

表2 各組小鼠體質(zhì)量Tab.2 Body weights of mice in various groups (n=8，±s，m/g）

*P＜0.05 compared with normal group.

Group Normal Model Atractylodes rhizome oil Atractylodes ethanol extract Sulfasalazine Body weight（t/d）1 21.35±1.08 21.75±1.19 21.66±0.72 21.46±1.47 21.56±0.29 2 21.61±1.28 22.08±1.09 21.61±0.97 21.45±1.97 21.92±0.25 3 21.63±1.51 22.32±1.05 21.77±0.48 22.25±2.24 22.20±0.12 4 22.11±1.60 22.60±1.01 21.01±1.24 22.29±2.35 21.98±0.22 5 22.60±1.39 22.47±1.29 20.94±1.09 22.38±2.02 22.12±0.31 6 22.70±1.36 21.57±1.36 21.09±1.01 21.94±2.28 21.74±0.39 7 22.89±1.41 20.38±1.47*20.65±0.97 21.19±2.51 21.31±0.73 8 22.91±1.49 18.97±1.59*20.21±1.13 20.10±2.89 20.22±0.68

表3 各組小鼠DAI評(píng)分Tab.3 DAI scores of mice in various groups (n=8，±s）

表3 各組小鼠DAI評(píng)分Tab.3 DAI scores of mice in various groups (n=8，±s）

*P＜0.05 compared with normal group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Normal Model Atractylodes rhizome oil Atractylodes ethanol extract Sulfasalazine DAI（t/d）1 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2 0.00±0.00 0.57±0.53 0.43±0.54 0.50±0.93 0.00±0.00 3 0.00±0.00 1.00±0.82 0.14±0.38 0.13±0.35 0.00±0.00 4 0.00±0.00 2.00±0.82*1.29±1.11 0.63±0.52 1.00±1.56 5 0.17±0.41 2.71±1.38*1.71±1.38 1.13±1.13 1.50±1.92 6 0.00±0.00 5.29±2.50*2.43±2.23△2.88±3.31△2.50±3.11△7 0.00±0.00 7.71±1.80*1.29±2.98△2.38±2.93△2.75±4.19△8 0.00±0.00 11.00±1.41*5.43±2.94△7.00±2.67△5.50±3.87△

2.2 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、脾臟系數(shù)和MPO活性與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短（P＜0.05）；與模型組比較，蒼術(shù)揮發(fā)油組、蒼術(shù)醇提物組和柳氮磺吡啶組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加（P＜0.05）。與正常組比較，模型組小鼠脾臟系數(shù)明顯增大（P＜0.05）；與模型組比較，蒼術(shù)揮發(fā)油組、蒼術(shù)醇提物組和柳氮磺吡啶組小鼠脾臟系數(shù)明顯減小（P＜0.05）。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，蒼術(shù)揮發(fā)油組、蒼術(shù)醇提物組和柳氮磺吡啶組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、脾臟系數(shù)和MPO活性Tab.4 Colon lengths,spleen coefficients and MPO activities of mice in various groups (n=8，±s）

表4 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、脾臟系數(shù)和MPO活性Tab.4 Colon lengths,spleen coefficients and MPO activities of mice in various groups (n=8，±s）

*P＜0.05 compared with normal group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Normal Model Atractylodes rhizome oil Atractylodes rhizome ethanol extract Sulfasalazine Colon length(l/cm)8.97±0.70 5.70±0.27*6.30±0.49△6.48±0.48△6.83±0.75△Spleen coefficient 3.43±0.20 4.40±0.55*3.60±0.30△3.64±0.28△3.72±0.80△MPO activity[λB/(U·g－1)]0.63±0.22 2.17±0.25*1.60±0.22△1.48±0.12△1.39±0.12△

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)正常組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完好，黏膜完整，杯狀細(xì)胞和絨毛排列整齊，無(wú)明顯水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層厚薄均勻適中，無(wú)異常。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)明顯被破壞，杯狀細(xì)胞和絨毛排列不整齊或缺失，有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且肌層明顯增厚。與模型組比較，蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)損傷得到改善，黏膜較完整，杯狀細(xì)胞及絨毛排列較均勻，但仍有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層增厚未得到明顯改善；蒼術(shù)醇提物組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)更接近于正常組，黏膜完整，杯狀細(xì)胞及絨毛排列較整齊，炎性浸潤(rùn)明顯減少，肌層厚薄適中；柳氮磺吡啶組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜較為完整，杯狀細(xì)胞排列均勻，無(wú)明顯絨毛減少或缺失，無(wú)明顯炎性浸潤(rùn)，肌層基本無(wú)異常。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×100）Fig.1 Pathomorphology of colon tissue of mice in various groups（HE，×100）

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子mRNA表達(dá)水平RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，蒼術(shù)揮發(fā)油組、蒼術(shù)醇提物組和柳氮磺吡啶組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與蒼術(shù)揮發(fā)油組比較，蒼術(shù)醇提物組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 mRNA in colon tissue of mice in various groups(n=8，±s）

表5 各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平Tab.5 Expression levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 mRNA in colon tissue of mice in various groups(n=8，±s）

*P＜0.05 compared with normal group；△P＜0.05 compared with model group;#P＜0.05 compared with Atractylodes rhizome oil group.

Group Normal Model Atractylodes rhizome oil Atractylodes rhizome ethanol extract Sulfasalazine TNF-α 1.00±0.31 2.63±0.16*1.54±0.16△1.22±0.16△#1.06±0.21△IL-1β 1.00±0.51 5.69±1.36*2.89±0.96△2.72±1.05△#2.36±0.70△IL-6 1.00±0.16 53.03±15.26*2.31±0.74△1.40±0.86△#4.17±1.23△

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子陽(yáng)性表達(dá)情況免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6陽(yáng)性表達(dá)增加；與模型組比較，蒼術(shù)揮發(fā)油組、蒼術(shù)醇提物組和柳氮磺吡啶組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6陽(yáng)性表達(dá)減少。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×100）Fig.2 Expressions of inflammatory factors in colon tissue of mice in various groups（Immunohistochemistry，×100）

2.6 各組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)明顯減少；與模型組比較，蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)增多，蒼術(shù)醇提物組和柳氮磺吡啶組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)明顯增多。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞（AB-PAS,×100）Fig.3 Goblet cells in colon tissue of mice in various groups（AB-PAS,×100）

3 討 論

UC作為炎癥性腸道疾病，其發(fā)病率逐年上升［12］。目前，關(guān)于UC的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。UNGARO等［1］報(bào)道：UC受遺傳、免疫、感染、環(huán)境和飲食等多種因素綜合影響，致使患者腸黏膜屏障受損，免疫平衡失調(diào)，腸道局部潰瘍進(jìn)而發(fā)展為UC。炎癥反應(yīng)是UC發(fā)生發(fā)展中的重要表征，同時(shí)患者腸道屏障受到嚴(yán)重破壞。MPO由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生并釋放，炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)會(huì)有大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，MPO可作為中性粒細(xì) 胞 的 標(biāo) 志 物 來(lái) 評(píng) 價(jià)UC的 嚴(yán) 重 程 度［13］。UC患 者腸黏膜通透性增加，細(xì)菌或抗原侵入黏膜固有層，激活免疫細(xì)胞，釋放大量炎性因子，包括TNF-α和IL-1β等，導(dǎo)致細(xì)胞間的緊密連接受損，屏障功能缺陷，進(jìn)而發(fā)生炎癥反應(yīng)［14］。IL-6過(guò)表達(dá)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞電解質(zhì)紊亂，皮內(nèi)細(xì)胞腫脹，腸道通透性增強(qiáng)。IL-6表達(dá)水平可作為UC炎癥反應(yīng)評(píng)判程度參考［15］。本研究選擇TNF-α、IL-1β和IL-6為炎癥評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞含大量的黏液顆粒，在腸黏膜表層形成一層致密的黏液層，與其他細(xì)胞共同維持腸道穩(wěn)態(tài)［16］。炎癥因子的釋放導(dǎo)致杯狀細(xì)胞和黏液層損傷，腸道黏膜屏障破壞，杯狀細(xì)胞及其分泌物形成的黏液層在維持腸道屏障中起到 重 要 作 用［17］。ALIPOUR等［18］研 究 表 明：UC患者結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)明顯減少，黏液層嚴(yán)重破壞。蒼術(shù)長(zhǎng)于燥濕健脾，臨床多用于治療胃腸道疾病，能夠防治胃腸道疾病，與UC病因病機(jī)相符［19］。

研究［5，20］表明：茅蒼術(shù)及其麩炒品對(duì)胃潰瘍大鼠具有明顯的抗炎作用，可下調(diào)IL-6等炎性因子和炎性介質(zhì)的表達(dá)。蒼術(shù)素能夠通過(guò)抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等表達(dá)，抑制大鼠空腸上皮組織炎癥［21］。蒼術(shù)炮制品能夠恢復(fù)結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)損傷，抑制杯狀細(xì)胞數(shù)減少，維持腸道黏膜完整性，對(duì)腸道損傷具有保護(hù)作用［8］。目前關(guān)于蒼術(shù)對(duì)DSS誘導(dǎo)UC模型小鼠的治療作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型是目前病理和生理狀態(tài)最接近人體的小鼠模型，其癥狀和組織學(xué)改變與人類結(jié)腸炎相似［9］。DSS誘導(dǎo)的UC小鼠會(huì)出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、腹瀉和結(jié)直腸出血等癥狀，與結(jié)直腸變薄和縮短、腸系膜淋巴結(jié)及脾臟增大有關(guān)。DSS誘導(dǎo)UC小鼠結(jié)腸組織形態(tài)表現(xiàn)包括杯狀細(xì)胞和絨毛排列混亂，隱窩結(jié)構(gòu)混亂，炎性細(xì)胞侵入固有層和黏膜下層等。本研究結(jié)果顯示：UC小鼠體質(zhì)量降低，出現(xiàn)腹瀉、隱血或便血癥狀，DAI評(píng)分升高，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，脾臟系數(shù)增大，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，結(jié)腸組織損傷和腸道屏障破壞等，造模成功。蒼術(shù)揮發(fā)油或蒼術(shù)醇提物干預(yù)后，UC小鼠體質(zhì)量降低減緩，腹瀉、隱血或便血癥狀減輕，結(jié)腸長(zhǎng)度縮短和脾臟系數(shù)增大被抑制，表明蒼術(shù)揮發(fā)油和蒼術(shù)醇提物能夠有效改善UC。本研究結(jié)果顯示：UC小鼠給予蒼術(shù)揮發(fā)油或醇提物后結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)損傷得到恢復(fù)，結(jié)腸組織MPO活性和炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)下調(diào)，表明炎性反應(yīng)被一定程度抑制；AB-PAS染色顯示：杯狀細(xì)胞數(shù)增多，表明腸道屏障被有效保護(hù)。綜上所述，蒼術(shù)揮發(fā)油和醇提物均能改善UC小鼠癥狀，在同等劑量條件下，蒼術(shù)醇提物對(duì)UC小鼠改善作用更強(qiáng)。

本研究從蒼術(shù)的中醫(yī)主治功能出發(fā)，探討其對(duì)類似“泄瀉”和“久痢”等癥的UC的治療作用。本研究結(jié)果表明：蒼術(shù)能夠明顯改善UC癥狀，且蒼術(shù)醇提物對(duì)UC癥狀的改善作用更好，從現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明蒼術(shù)對(duì)UC的治療作用，挖掘蒼術(shù)臨床上的潛在功能，為其新藥開(kāi)發(fā)提供參考。