增齡性肌肉減少癥小鼠肌肉組織抗氧化能力的特點

郭 丹,溫 旭,吳丹妮,王秦玉,劉珊珊,季鐸淳,王力可,王 丹,董 營,于春艷

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)附屬醫(yī)院超聲診斷科，吉林 吉林 132000）

肌肉減少癥（肌少癥）由于機體骨骼肌質(zhì)量和力量逐漸喪失，導(dǎo)致患者跌倒、骨折、肢體殘疾和死亡等不良事件的發(fā)生，造成其生活質(zhì)量下降，給家庭和社會帶來較大的負(fù)擔(dān)。既往研究［1］中，關(guān)于肌少癥的定義已經(jīng)演變?yōu)榘ㄅc年齡相關(guān)的骨骼肌功能喪失。近期研究［2-3］表明：線粒體可調(diào)節(jié)年齡依賴性的身體衰退和肌肉內(nèi)穩(wěn)態(tài)，線粒體穩(wěn)態(tài)在維持線粒體功能和骨骼肌功能中發(fā)揮重要作用。線粒體在提供能量的同時會產(chǎn)生大量氧自由基，活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成和抗氧化劑之間的動態(tài)平衡與線粒體功能穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。BORI等［4］認(rèn)為：線粒體功能紊亂對肌少癥疾病發(fā)展至關(guān)重要，但骨骼肌線粒體抗氧化能力特點尚不明確，抗氧化與肌減少癥之間關(guān)系的分子基礎(chǔ)尚未完全闡明。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過與靶基因啟動子中的抗氧化應(yīng)答元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合，在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Nrf2及其靶基因與調(diào)控線粒體功能有關(guān)［5-6］。研究［7］表明：通過恢復(fù)Nrf2活性能夠防止因衰老導(dǎo)致的肌肉和心臟功能障礙。Nrf2缺乏能夠促進(jìn)衰老腓腸肌自噬的增加，是肌少癥發(fā)生的潛在機制［8］。然而，Nrf2抗氧化途徑在以氧化代謝為主的肌肉中的作用及其機制目前尚未完全闡明。

本研究利用C57/6J小鼠，觀察其增齡性肌肉組織中ROS水平和Nrf2 mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化，檢測Nrf2依賴的抗氧化途徑相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，探討以氧化代謝為主的肌肉組織增齡后抗氧化應(yīng)激的特點，闡明ROS生成和抗氧化間的動態(tài)平衡在增齡性肌少癥中的作用，為預(yù)防或延緩年齡相關(guān)肌少癥的發(fā)生發(fā)展提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SPF級雄性C57BL/6J小鼠24只，體質(zhì)量18～20 g（北京華阜康股份有限公司），動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0004，飼養(yǎng)于通風(fēng)和安靜的環(huán)境中，定時喂食，自由飲水。Nrf2和GAPDH單克隆抗體（美國Proteintech公司），過氧化物酶體增殖子活化受 體γ共 激 活 因 子1α（peroxisome proliferatorsactivated receptor γ coactivator-1 alpha，PGC-1α）、Nrf2及 抗 氧 化 應(yīng) 激 基 因Nqol、Cat、Gclc、Sod1、Sod2和GAPDH引物由上海生工生物有限公司合成，TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），PureLink RNA mini試劑盒（美國Ambion公司），預(yù)混型逆轉(zhuǎn)錄試劑（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司），實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測試劑盒CFX96（美國Bio-Rad公司），ROS檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。蛋白質(zhì)電泳裝置、轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和蛋白濃度分析儀（美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（德國Analytikjena分析儀器公司）。

1.2 HE染色觀察各組小鼠比目魚肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)24只小鼠隨機分為3月齡組（3 M組）、12月齡組（12 M組）和22月齡組（22 M組）。采用10%水合氯醛麻醉各組小鼠，剪開胸廓，暴露心臟，將灌注針頭經(jīng)左心室刺入主動脈，止血鉗固定，剪開右心房，生理鹽水快速灌注沖洗直至肝臟變白，采用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）灌注固定，取出各組小鼠完整比目魚肌，置于4%多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)脫水、透明、包埋和切片制作石蠟切片，HE染色后封片，Olympus顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 各組小鼠骨骼肌質(zhì)量指數(shù)（skeletal muscle mass index，SMI）計算采用分析天平稱量各組小鼠體質(zhì)量和比目魚肌質(zhì)量，計算SMI。SMI=小鼠比目魚肌質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.42′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針法檢測各組小鼠肌肉組織中ROS水平稱取20 mg新鮮比目魚肌組織，按10mL·g－1RIPA組 織 裂 解 液 裂 解，取200 μ L勻 漿，4℃、12 000 g離心10 min，棄沉淀，按照ROS檢測試劑盒說明書，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入90 μL組織勻漿上清液和1 mmol·L－1DCFH-DA 10 μL，37℃溫箱孵育30 min，于488 nm和535 nm波長處檢測組織 勻 漿 中2′，7′-二 氮 熒 光 素 （2′，7′-dichlorofluorescein，DCF）熒光分布。以相對熒光強度代表ROS水平。

1.5 RT-qPCR法檢測各組小鼠肌肉組織中PGC-1α、Nrf2和抗氧化基因mRNA表達(dá)水平取凍存比目魚肌組織（30±10）mg，加入液氮充分研磨，采用TRIzol試劑提取總RNA，PureLink RNA mini試劑盒純化，Nanodrop分光光度計NP-1 000測定260 nm和280 nm波長處吸光度（A）值，計算樣本總RNA濃度并評估其純度。采用預(yù)混型逆轉(zhuǎn)錄試劑，將總RNA（1 μ g）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，0.5 μg cDNA采用RT-qPCR試 劑盒進(jìn)行PCR擴增，CFX96 RT-qPCR檢測系統(tǒng)檢測，PCR引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃、10 min預(yù)變性；95℃、15 s，60℃、1 min，40個循環(huán)；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA表達(dá)水平。ΔCt=目的基因Ct值－GAPDH Ct值。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of PCR

1.6 Western blotting法檢測各組小鼠肌肉組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平稱?。?0±5）mg凍存比目魚肌組織，按10 mL·g－1RIPA組織裂解液裂解，采用Bio-Rad法測定蛋白濃度，配制12 %聚丙烯酰胺凝膠，GAPDH等量蛋白上樣對照，30 μg蛋白質(zhì)樣品SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗3次，每次10 min；加入抗體（Nrf2 1∶1 000，GAPDH 1∶5 000），4℃孵育過夜。次日TBST漂洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫?fù)u床孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min。ECL顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組小鼠SMI值，肌肉組織中ROS水 平，PGC-1α及 抗 氧 化 基 因Nqol、Cat、Gclc、Sod1和Sod2 mRNA表達(dá)水平，肌肉組織中Nrf2mRNA和蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以-±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠比目魚肌病理形態(tài)表現(xiàn)3 M組小鼠比目魚肌顏色以紅色為主，形態(tài)規(guī)則，大小均勻，肌纖維周圍可見細(xì)胞核；12 M組小鼠比目魚肌顏色仍以紅色為主，肌纖維形態(tài)規(guī)則，橫截面積增大，部分肌纖維細(xì)胞核數(shù)量增多，少許肌纖維可見變性改變；22 M組小鼠比目魚肌白色肌纖維增多，形態(tài)不規(guī)則，大小不均勻，肌纖維細(xì)胞核數(shù)量增多并出現(xiàn)核內(nèi)移現(xiàn)象，肌細(xì)胞間隙明顯增大，肌纖維變性增多。見圖1。

圖1 各組小鼠比目魚肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×400）Fig.1 Pathomorphology of soleus muscle tissue of mice in various groups(HE,×400)

2.2 各組小鼠骨骼肌SMI與3 M組［（0.61±0.08）mg·g－1］比較，12 M組和22 M組小鼠SMI［（0.60±0.07）和（0.54±0.09）mg·g－1］均降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與12 M組比較，22 M組小鼠SMI值差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠肌肉組織中ROS水平DCFH-DA熒光探針法檢測結(jié)果顯示：與3 M組［（1.12±0.08）AU］比較，12 M組和22 M組小鼠肌肉組織中ROS水平［（1.45±0.42）和（2.00±0.19）AU］均升高（P＜0.05）；與12 M組比較，22 M組小鼠肌肉組織中ROS水平明顯升高（P＜0.01）。

2.4 各組小鼠肌肉組織中PGC-1α和Nrf2 mRNA表達(dá)水平RT-qPCR結(jié)果顯示：與3 M組比較，12 M組和22 M組小鼠肌肉組織中PGC-1α mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與12 M組比較，22 M組小鼠肌肉組織中PGC-1α mRNA表達(dá)水平降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與3 M組比較，12 M組小鼠肌肉組織中Nrf2 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），22 M組小鼠肌肉組織中Nrf2 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與12 M組比較，22 M組小鼠肌肉組織中Nrf2 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見表2。

2.5 各組小鼠肌肉組織中抗氧化基因Nqol、Cat、Gclc、Sod1和Sod2 mRNA表達(dá)水平與3 M組比較，12 M組小鼠肌肉組織中抗氧化基因Nqol、Cat、Gclc、Sod1和Sod2 mRNA表 達(dá) 水 平 均 明 顯升高（P＜0.01）；與12 M組比較，22 M組小鼠肌肉組織中抗氧化基因Nqol、Cat、Sod1和Sod2mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），Gclc mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠肌肉組織中抗氧化基因mRNA表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of antioxidant gene mRNA in muscle tissue of mice in various groups

2.6 各組小鼠肌肉組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平與3 M組比較，12 M組小鼠肌肉組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），22 M組小鼠肌肉組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與12 M組比較，22 M組小鼠肌肉組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組小鼠肌肉組織中Nrf2蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expression of Nrf2 protein in muscle tissue of mice in various groups

3 討 論

年齡增長相關(guān)的骨骼肌老化是導(dǎo)致原發(fā)性肌少癥發(fā)生的主要原因，衰老過程導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)量變化，因而骨骼肌質(zhì)量和功能的下降是衰老最顯著的結(jié)果。比目魚肌是以慢肌纖維氧化型為主的肌纖維，其肌紅蛋白和線粒體數(shù)量較多。本研究HE染色結(jié)果顯示：22 M組小鼠比目魚肌白色肌纖維增多，形態(tài)不規(guī)則，肌纖維細(xì)胞核數(shù)量增多并出現(xiàn)核內(nèi)移現(xiàn)象，肌細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞數(shù)量減少。比目魚肌形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和骨骼肌SMI值降低，提示骨骼肌的數(shù)量和肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，增齡性比目魚肌表型發(fā)生肌少癥的改變。

衰老等因素特異性損害骨骼肌線粒體功能［9］。研究［10-11］報道：衰老骨骼肌線粒體密度降低，基質(zhì)空泡化、嵴變短，大部分線粒體出現(xiàn)去極化或無功能。骨骼肌內(nèi)的線粒體分為肌膜下線粒體和肌纖維間線粒體，前者為肌細(xì)胞膜活性轉(zhuǎn)運和基因轉(zhuǎn)錄提供ATP，后者為肌肉組織中收縮肌絲提供ATP，與氧化磷酸化過程有關(guān)［12-13］。PGC-1α作為線粒體生物發(fā)生和氧化呼吸的主要調(diào)節(jié)因子之一，能夠增加氧化磷酸化，影響ROS產(chǎn)生［14-15］。線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)羌?xì)胞內(nèi)ROS的主要來源之一，本研究結(jié)果顯示：增齡性比目魚肌中ROS水平和PGC-1α mRNA表達(dá)水平均升高，與以往研究［16］結(jié)果一致。氧化應(yīng)激時PGC-1α誘導(dǎo)ROS解毒酶升高，抑制ROS水 平。研 究［17］表明：PGC-1α水平升高可維持骨骼肌橫截面積，阻止比目魚肌早期分解代謝途徑，緩解比目魚肌萎縮。

研 究［18］顯 示：PGC-1α通 過 激 活Nrf2而 調(diào) 控抗氧化基因表達(dá)，下調(diào)PGC-1α表達(dá)，則完全抑制了Nrf2結(jié)合谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞單位（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）基因的啟動子元件，降低超氧化物歧化酶2（superoxide dismutases 2，SOD2）和谷氨酰半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）蛋白表達(dá)水平。此外，Nrf2能夠協(xié)同調(diào)節(jié)抗氧化劑谷胱甘肽（glutathione，GSH）產(chǎn)生和再生，通過調(diào)控Nqol等調(diào)節(jié)ROS水平，使Nrf2為細(xì)胞提供重要的細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)［19］。在小鼠肌營養(yǎng)不良模型中，使用Nrf2激活劑肌肉功能得以改善，提示Nrf2缺乏增強了老年骨骼肌中線粒體ROS產(chǎn)生［20］。本研究結(jié)果顯示：隨著增齡性改變，小鼠肌肉組織中ROS水平升高，Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，小鼠肌肉組織中抗氧化基因Nqol、Cat、Sod1和Sod2 mRNA表達(dá)水平升高，提示增齡性肌肉組織中部分抗氧化能力與Nrf2依賴抗氧化途徑有關(guān)。

研究［21-22］證實：線粒體不僅是ROS的主要來源，也是氧化損傷的靶點，隨著年齡的增長，ROS產(chǎn)生增加。Nrf2是一種組成性活性轉(zhuǎn)錄因子，能夠感知氧化還原平衡并控制抗氧化防御系統(tǒng)的基因，由于比目魚肌以氧化代謝為主，高水平的氧化磷酸化水平自然暴露于過氧化氫和超氧化物等，由此推測比目魚肌對氧化還原失衡可作出迅速反應(yīng)［23-24］。線粒體具有調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)功能，使ROS不會過度產(chǎn)生或累積，進(jìn)而激活分解代謝途徑［25-26］。研究［27］顯示：線粒體中ROS水平升高可導(dǎo)致適應(yīng)性反應(yīng)，增強對氧化應(yīng)激的抵抗力，并可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的長期降低。本研究結(jié)果顯示：增齡性比目魚肌組織中Nrf2 mRNA和蛋白及抗氧化基因表達(dá)水平升高，ROS水平升高，提示增齡性改變中，比目魚肌具有一定的氧化應(yīng)激抵抗能力，然而ROS并未完全清除。根據(jù)衰老的自由基理論，ROS會產(chǎn)生反饋環(huán)，其形成增加可能會對細(xì)胞造成累積性損傷，從而加劇線粒體功能障礙［28］。提示細(xì)胞核中心化和細(xì)胞數(shù)量減少等骨骼肌老化的表現(xiàn)可能與ROS水平升高有關(guān)。HARMAN［29］表明：靜止或力竭運動均會產(chǎn)生過量ROS，導(dǎo)致氧化應(yīng)激相關(guān)的組織損傷和肌肉收縮力受損。氧化損傷是一種將衰老與慢性疾病聯(lián)系的機制，包括骨骼肌質(zhì)量和功能的逐漸喪失。因此，減輕氧化損傷是預(yù)防或延遲慢性病發(fā)作或延長健康期的潛在途徑［2］。Nrf2依賴的抗氧化信號途徑可能是治療以氧化代謝為主的肌肉減少癥的一個潛在治療靶點。