黃芪對(duì)大黃誘導(dǎo)大鼠腹瀉的治療作用及其機(jī)制

莊雪峰,律廣富,林 賀,黃曉巍,周 佳,李禹墨,趙嘉睿,林 喆,王雨辰

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130117）

慢性腹瀉是一種由脾臟生理功能紊亂引起的胃腸道疾病，以排便次數(shù)增多、稀便或伴有膿血為主要癥狀［1］。慢性腹瀉的發(fā)生發(fā)展與腸道屏障的完整性、腸道炎癥性病變和腸道菌群有密切關(guān)聯(lián)［2］。當(dāng)腸道屏障受損時(shí)，腸道通透性增加，導(dǎo)致由腸道菌群產(chǎn)生的腸道內(nèi)毒素水平升高，并輸送至循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)腸道內(nèi)毒素積累和腸道細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［3］。內(nèi)毒素在腸道中的積累可以通過激活Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR），而Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptorassociated factor 6，TRAF6）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路是相關(guān)通路之一。腸道炎癥發(fā)生后，腸道無法維持正常新陳代謝，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉等一系列癥狀［4-5］。同時(shí)，腸道炎癥會(huì)進(jìn)一步破壞腸道屏障，導(dǎo)致腸道菌群失衡［6］。因此，恢復(fù)腸道屏障的完整性、維持腸道微生物的平衡和減少腸道炎癥是目前治療慢性腹瀉藥物的主要作用機(jī)制［7］。黃芪是常用的補(bǔ)氣中藥之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究［8］顯示：黃芪具有促進(jìn)機(jī)體新陳代謝、清除自由基、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體抗病力、降血壓、保護(hù)心臟和保護(hù)肝臟等作用。臨床上黃芪建中湯和黃芪注射液多用于治療小兒慢性腹瀉［9］。然而，黃芪治療慢性腹瀉的具體機(jī)制目前尚未完全闡明。本研究采用灌胃大黃水提液結(jié)合飲食不節(jié)方法制備大鼠慢性腹瀉模型，探討黃芪水煎液對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織中TLR4/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響，闡明其對(duì)腸道屏障、腸道炎癥和腸道菌群的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器選取50只健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2020-0002。本研究嚴(yán)格按照中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用指南》建議進(jìn)行。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心和長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2021058），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理、使用和治療的所有實(shí)驗(yàn)程序均遵循中國(guó)國(guó)家動(dòng)物福利法規(guī)定。光照/黑暗周期為12 h，環(huán)境溫度23℃～25℃，濕度40%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2018-0014。大黃購(gòu)自吉林國(guó)安藥業(yè)股份有限公司。黃芪由長(zhǎng)白山職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供，采自吉林省農(nóng)安縣（東經(jīng)124°36′3"7，北緯44°56′47"）。按照《中國(guó)藥典》2020年版［10］要求，將黃芪去除雜質(zhì)，按大小分開，洗凈，充分濕潤(rùn)，切成厚片，陰干，黃芪煎煮并濃縮至0.135和0.065 g·mL－1；大黃采用粉碎機(jī)粉碎，加入適量水浸泡大黃粉末，混合物60℃環(huán)境下保持過夜后過濾，低溫下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1 g·mL－1。參苓白術(shù)散（山西省華康藥業(yè)股份有限公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），Protein Marker和ECL發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）試劑盒、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）試劑盒、胃泌素（gastrin，GAS）試劑盒和胃動(dòng)素（motilin，MTL）試劑盒（長(zhǎng)春維爾科特科技有限公司），丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒和分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司），蛋白酶激活受體2（protease activated receptor-2，PAR-2）、p38、磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）、肌球 蛋 白 輕 鏈 激 酶 （myosin light-chain kinase，MLCK）、肌 球 蛋 白 輕 鏈（myosin light chain，MLC）、閉鎖蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）、閉合蛋白（Occludin）、TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、NF-κB和 甘 油 醛-3-磷 酸 脫 氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），磷酸化MLC（phosphorylated MLC，p-MLC）一抗（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），TRAF6一抗（英國(guó)ABCOM公司）。酶標(biāo)儀（型號(hào)：Multiskan FC）和－80℃超低溫冰箱（型號(hào)：ULT1386-3-V41）（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），電泳儀、電泳系統(tǒng)和BE6085轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad公司），熒光發(fā)光凝膠成像儀（型號(hào)：Alliance Q9，瑞士Tecan公司），4℃低溫離心機(jī)（型號(hào)：Centrifuge 5810R，德國(guó)艾本德股份公司），Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)（型號(hào)：Illumina HiSeq 2 500，美國(guó)Illumin公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和造模50只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組（2.468 g·kg－1參苓白術(shù) 散）、低劑量（1.35 g·kg－1）黃 芪組和高劑量（2.7 g·kg－1）黃芪組，每組10只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠采用大黃建立腹瀉模型。20 mL·kg－1大黃提取液灌胃給藥，每天1次，給藥前禁食8 h造成飲食不節(jié)，持續(xù)14 d。觀察造模期間大鼠臨床表現(xiàn)，如出現(xiàn)便溏、肛門污穢、活動(dòng)減少、拱背、毛發(fā)干枯無光澤和體質(zhì)量減少等癥狀，表明脾虛泄瀉模型建立成功［11］。造模成功后，各組大鼠均以20 mL·kg－1劑量灌胃給藥，每天固定時(shí)間灌胃給藥1次，持續(xù)14 d。在實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組大鼠給予等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)共持續(xù)28 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠糞便收集于無菌管中，－80℃下保存。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，收集血液、結(jié)腸組織和其他組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 各組大鼠腹瀉指標(biāo)測(cè)定實(shí)驗(yàn)開始后，每3 d于固定時(shí)間段記錄各組大鼠體質(zhì)量。每3 d采用干燥失重法測(cè)定大鼠糞便含水量。糞便含水量=（干燥前糞便濕質(zhì)量－干燥后糞便干質(zhì)量）/干燥前糞便濕質(zhì)量×100%。每3 d采用參考文獻(xiàn)［12］中的方法測(cè)量大鼠腹瀉評(píng)分。腹瀉評(píng)分：0分，無腹瀉或大便正常；1分，大鼠未見水樣腹瀉，但大便較濕軟；2分，中度腹瀉，大便稀薄，肛周輕度沾染；3分，重度腹瀉，大便水樣，肛周嚴(yán)重沾染。

1.4 HE染色觀察各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速收集各組3只大鼠結(jié)腸組織，4%多聚甲醛固定過夜，梯度酒精脫水、二甲苯組織透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、染色、脫水。再次梯度脫水后，烘干玻片表面液體，蓋玻片覆蓋。室溫下干燥，觀察各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)并拍照。采用雙盲法，根據(jù)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（0～3分）和上皮損傷（0～3分）的綜合評(píng)分評(píng)估結(jié)腸組織損傷。

1.5 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸組織中屏障相關(guān)蛋白和TLR4/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平各組分別選取3只大鼠結(jié)腸組織，采用含有蛋白酶抑制劑RIPA裂解緩沖液（1∶1 000）提取總蛋白。采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。10% SDS-PAGE凝膠100 V電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h。PBS緩沖液洗滌，與一抗（1∶1 000）4℃冰箱中孵育過夜，PBS緩沖液洗滌3次后，二抗孵育2 h，PBS緩沖液洗滌。采用ECL試劑盒和熒光發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯色成像。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.6 16S r DNA基因測(cè)序分析各組大鼠腸道菌群情況在提取糞便中分離總DNA，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，并在引物末端加入所需測(cè)序接頭。PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化、定量和均質(zhì)化，形成完整測(cè)序文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)量測(cè)序分析后，采用堿基調(diào)用分析，將由高通量測(cè)序獲取的原始圖像數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序讀數(shù)。通過讀數(shù)拼接和過濾、聚類或去噪、物種注釋和豐度分析，揭示樣品物種組成。采用α多樣性、β多樣性、顯著物種差異分析、相關(guān)分析和功能預(yù)測(cè)分析等方法分析樣品間差異。

1.7酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)各組大鼠血清中MTL、GAS、MDA、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和SIgA水平及SOD活性收集各組大鼠動(dòng)脈血，靜置30 min，4℃、3 000 g離心10 min，取上清，分裝于0.5 mL EP管中，-80℃超低溫冰箱保存。根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)各組大鼠血清中MTL、GAS、MDA、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和SIgA水 平 及SOD活 性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠體質(zhì)量、糞便含水量和腹瀉評(píng)分，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、IL-10和SIgA水平及SOD活性，結(jié)腸組織中PAR-2、MLCK、TLR4、NF-κB、MyD88、TRAF6、p-MLC和p-p38蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以-±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腹瀉指標(biāo)和血清中胃腸動(dòng)力激素水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01），糞便含水量和腹瀉評(píng)分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、低劑量黃芪組和高劑量黃芪組大鼠體質(zhì)量明顯升高（P＜0.01），糞便含水量和腹瀉評(píng)分明顯降低（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中MTL水平明顯升高（P＜0.01），GAS水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、低劑量黃芪組和高劑量黃芪組大鼠血清中MTL水平明顯降低（P＜0.01），GAS水 平 明 顯 升 高（P＜0.01）。見圖1和表1。

表1 各組大鼠血清中MTL和GAS水平Tab.1 Levels of MTL and GAS of rats in various groups[n=10,±s,ρB/(ng·L－1)］

表1 各組大鼠血清中MTL和GAS水平Tab.1 Levels of MTL and GAS of rats in various groups[n=10,±s,ρB/(ng·L－1)］

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model Positive control High dose of Astragali Radix Low dose of Astragali Radix MTL 64.11±5.29 83.03±3.36*73.84±6.64△75.06±4.89△75.23±3.02△GAS 63.79±2.29 49.20±1.51*59.67±2.01△56.30±1.97△55.40±2.32△

圖1 各組大鼠體質(zhì)量（A）、糞便含水量（B）、腹瀉評(píng)分（C）Fig.1 Body weights(A),fecal water contents(B)and diarrhea scores(C)of rats in various groups

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)和結(jié)腸組織損傷評(píng)分HE染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織上皮黏膜損傷，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體排列紊亂，結(jié)腸組織損傷評(píng)分升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對(duì)照組和高劑量黃芪組大鼠結(jié)腸組織上皮黏膜結(jié)構(gòu)較規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，未見明顯腺體紊亂；低劑量黃芪組大鼠結(jié)腸組織上皮黏膜結(jié)構(gòu)可見輕微損傷，部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體排列較整齊；陽性對(duì)照組、低劑量黃芪組和高劑量組大鼠結(jié)腸組織損傷評(píng)分降低（P＜0.01）。見圖2和3。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×400）Fig.2 Pathomorphology of colon tissue of rats in various groups(HE，×400）

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織中腸屏障相關(guān)蛋白表達(dá)水平Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、低劑量黃芪組和高劑量黃芪組大鼠結(jié)腸組織中ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中p-p38和PAR-2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、低劑量黃芪組和高劑量黃芪組大鼠結(jié)腸組織中p-p38和PAR-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中MLCK和p-MLC蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、低劑量黃芪組和高劑量黃芪組大鼠結(jié)腸組織中MLCK和p-MLC蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織中腸屏障相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B-G）Fig.4 Electrophoregram(A)and histogram(B-G)of expressions of intestinal barrier-related proteins in colon tissue of rats in various groups

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB蛋 白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、低劑量黃芪組和高劑量黃芪組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TRAF6、MyD88和NF-κB蛋 白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A)和直條圖（B-E)Fig.5 Electrophoregram(A)and histogram(B-E)of TLR4/TRAF6/NF-κB signaling pathway-related proteins in colon tissue of rats in various groups

2.5 各組大鼠腸道菌群變化情況由各組大鼠糞便樣本中檢測(cè)到2 239 065對(duì)高質(zhì)量序列和1 362個(gè)操 作 分 類 單 元 （operational taxonomic units，OTUs）。α多樣性分析結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪組大鼠ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)升高（P＜0.05），腸道菌群物種豐度增加。β多樣性分析結(jié)果顯示：根據(jù)非計(jì)量多維尺度（non-metric multidimensional scale score plot，NMDS）得 分 圖結(jié)果，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)存在明顯變化；與模型組比較，低和高劑量黃芪組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異?；谒阈g(shù)平均未加權(quán)配對(duì) 法 （unweighted paired average method，UPGMA）加權(quán)Unifrac聚類樹結(jié)果顯示：首先各組大鼠組內(nèi)腸道菌群聚類，隨后低和高劑量黃芪組與對(duì)照組大鼠腸道菌群聚類，而均與模型組大鼠間存在差異。在腸道菌群門豐度分析中，對(duì)照組和高劑量黃芪組大鼠腸道菌群主要由厚壁菌門和擬桿菌門組成，模型組大鼠腸道菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和疣微菌門組成。與對(duì)照組比較，模型組大鼠腸道菌群中變形菌門和疣微菌門豐度明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，低和高劑量黃芪組大鼠腸道菌群中變形菌門和疣微菌門豐度均明顯降低（P＜0.01），高劑量組大鼠腸道菌群中ε-變形菌門豐度明顯升高（P＜0.01）。見圖6和表2。

表2 各組大鼠在門水平上的腸道菌群豐度Tab.2 Abundance of intestinal flora of rats in various groups at phylum level (n=7,x±s,η/%）

圖6 各組大鼠的腸道菌群變化情況Fig.6 Changes in intestinal flora of rats in various groups

2.6 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高（P＜0.01），IL-10水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對(duì)照組、低劑量黃芪組和高劑量黃芪組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯降低（P＜0.01），IL-10水平明顯升高（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平Tab.3 Levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-10 in serum of rats in various groups (n=8，±s）

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平Tab.3 Levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-10 in serum of rats in various groups (n=8，±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model Positive control Low dose of Astragali Radix High dose of Astragali Radix TNF-α[ρB/（ng·L－1）]78.58±5.15 90.88±3.26*79.95±5.85△80.86±6.70△81.54±4.54△IL-1β[ρB/（μg·L－1）]26.12±2.91 34.08±3.20*27.73±2.21△27.47±1.15△27.28±1.98△IL-6[ρB/(ng·L－1)]75.20±19.95 240.10±15.37*93.24±18.04△143.81±11.19△118.76±15.88△IL-10[ρB/(ng·L－1)]10.54±0.88 8.20±0.52*10.13±0.91△9.80±0.58*△10.10±0.74△

2.7 各組大鼠血清中MDA水平和SOD活性與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中MDA水平明顯升高（P＜0.01），SOD活性明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對(duì)照組、低劑量黃芪組和高劑量黃芪組大鼠血清中MDA水平明顯降低（P＜0.01），SOD活 性 明 顯 升 高（P＜0.01）。見表4。

2.8 各組大鼠血清中SIgA水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中SIgA水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對(duì)照組、低劑量黃芪組和高劑量黃芪組大鼠血清中SIgA水平明顯升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠血清中MDA和SIgA水平及SOD活性Tab.4 Levels of MDA and SIgA and SOD activities in serum of rats in various groups (n=8,±s)

表4 各組大鼠血清中MDA和SIgA水平及SOD活性Tab.4 Levels of MDA and SIgA and SOD activities in serum of rats in various groups (n=8,±s)

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model Positive control Low dose of Astragali Radix High dose of Astragali Radix MDA[ρB/(g·L－1)]9.45±1.56 11.94±0.85*9.63±1.77△10.81±1.32△9.98±1.13△SIgA［ρB/（mg·L－1）］6.38±0.08 4.47±0.02*6.28±0.05△5.77±0.04△5.90±0.05△SOD[λB/(U·mL－1)]6.17±0.59 3.97±0.76*5.59±1.12△5.08±0.67△5.29±0.85△

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織損傷評(píng)分Fig.3 Injury scores of colon tissue of rats in various groups

3 討 論

腹瀉是人們生活中最常見的疾病之一。采用中藥針對(duì)腸道菌群失調(diào)和腸道炎癥是治療腹瀉的一個(gè)直接策略［13］。研究［14］顯示：慢性腹瀉的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)胃腸道運(yùn)動(dòng)激素水平有密切關(guān)聯(lián)，胃腸運(yùn)動(dòng)激素水平變化會(huì)導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。MTL和GAS是與腹瀉密切相關(guān)的胃腸運(yùn)動(dòng)激素［15］。本研究結(jié)果顯示：黃芪可以有效降低腹瀉模型大鼠體內(nèi)MTL水平，升高GAS水平，表明黃芪可以發(fā)揮改善腸道功能作用，治療大黃所致大鼠腹瀉。

本研究結(jié)果顯示：低和高劑量黃芪組大鼠腸道中變形菌門和疣微菌門水平明顯降低；黃芪可以有效降低腹瀉模型大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TRAF6、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)水平，降低腹瀉模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。在慢性腹瀉的發(fā)生發(fā)展過程中，腸道菌群發(fā)揮著重要的作用，慢性腹瀉患者伴隨腸道菌群失衡［16］。研究［17］顯示：慢性腹瀉患者腸道中擬桿菌門水平明顯降低，而變形菌門等革蘭陰性菌水平升高。變形菌門是革蘭陰性菌，包含多種與腹瀉密切相關(guān)的腸道病菌［18］。變形菌門相關(guān)菌種的外膜由脂多糖組成［19-20］。當(dāng)腸道內(nèi)變形菌門等革蘭陰性菌水平升高，其接觸腸道上皮細(xì)胞，直接激活TLR4，過度的TLR4激 活 誘 導(dǎo) 宿 主 炎癥 反 應(yīng)［21］。TLR4在慢 性腹瀉患者和大黃所致腹瀉大鼠結(jié)腸組織中高度表達(dá)，被認(rèn)為是腸道炎癥發(fā)生和發(fā)展的促成因素。TLR4激活通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與MyD88相互作用，從而激活NF-κB并促進(jìn)多種炎癥因子的合成和釋放［22］。提示黃芪可以通過降低變形菌門和疣微菌門水平，抑制TLR4/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，減少結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，從而抑制腸道炎癥，發(fā)揮黃芪治療腹瀉的作用。

研究［23］顯示：黃芪可以明顯降低腹瀉模型大鼠體內(nèi)MDA水平，升高SOD活性，且可以明顯升高SIgA水平。當(dāng)體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平升高時(shí)，會(huì)促進(jìn)腸道炎癥和腸道屏障損傷，SIgA是腸道黏膜免疫中重要的免疫球蛋白，主要用于抵抗各種內(nèi)源性共生細(xì)菌和外源性入侵病原體［23-24］。提示黃芪可以有效降低腹瀉模型大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，提高腹瀉模型大鼠體內(nèi)腸道黏膜免疫水平，發(fā)揮抑制腸道炎癥的作用。

腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)，往往會(huì)引起腸道屏障損傷，是腸道炎癥能夠引起腹瀉的重要因素。研究［25-26］表明：腸道屏障的完整性主要與腸道屏障蛋白的正常活性有關(guān)，腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)在腹瀉相關(guān)疾病中明顯下調(diào)，且受PAR-2和p38調(diào) 控。此外，PAR-2和p-p38可 以通過抑制MLCK激活和p-MLC表達(dá)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)［27］。本研究結(jié)果顯示：黃芪能上調(diào)大鼠腸道屏障蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)，降低結(jié)腸組織中PAR-2表達(dá)水平，抑制p38磷酸化，進(jìn)而抑制MLCK激活和p-MLC表達(dá)，提示黃芪可以防止結(jié)腸屏障蛋白降解，抑制腸道屏障損傷。

綜上所述，黃芪可以有效治療大黃引起的大鼠慢性腹瀉，降低腹瀉模型大鼠腸道炎癥水平，上調(diào)腸道屏障蛋白表達(dá)，恢復(fù)腸道屏障損傷，其機(jī)制可能與降低腸道菌群中變形菌門和疣微菌門的比例，恢復(fù)腸道菌群組成，抑制TLR4/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。此外，黃芪可降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，上調(diào)腸道內(nèi)分泌型免疫球蛋白水平，提高腸道免疫水平，發(fā)揮治療大黃所致大鼠慢性腹瀉的作用。