牦牛角對LPS誘導(dǎo)發(fā)熱大鼠模型的解熱活性評價及機制研究

趙晶晶,武文星,朱昭穎,劉睿,宿樹蘭,郭盛,段金廒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室,江蘇 南京 210023)

發(fā)熱是機體面對病原體入侵時產(chǎn)生的一種復(fù)雜的防御性反應(yīng),通常為在激活物的直接或間接作用下,通過中樞介質(zhì)作用于體溫調(diào)節(jié)中樞,在外周免疫系統(tǒng)和中樞共同作用下使機體產(chǎn)熱增加,散熱減少,調(diào)定點上移而引起調(diào)節(jié)性體溫升高,并伴有功能和代謝改變的一種病理過程[1]?，F(xiàn)代臨床常用的解熱藥為對乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、安乃近等,解熱藥作為急診常用藥物,使用不當(dāng)常會出現(xiàn)過敏反應(yīng)、胃腸道出血、變性血紅蛋白水平增加甚至損害肝腎功能等不良反應(yīng)[2-4]。因此,有必要通過本草典籍等途徑尋找更安全、有效且毒副作用小的退熱藥物。

《本草綱目》記載“牦牛角味酸、咸、涼,無毒;主治驚癇熱毒,諸血病?！盵5]藏醫(yī)在臨床用藥方面常將牦牛角銼成粉配方用或單用塊磨汁單服，治療小孩與成人高熱[6]?！陡咴嗅t(yī)藥》則記載犀角地黃湯原方使用時牦牛角可替代犀角發(fā)揮清熱涼血,定驚解毒之功[7]。由此可見牦牛角具有確切的解熱活性,但牦牛角藥材尚缺乏較為深入的功效學(xué)驗證及作用機制研究。因此,本研究通過脂多糖(LPS)致發(fā)熱大鼠的肛溫變化以評價牦牛角解熱活性,采用細胞因子表達及非靶向血漿代謝組探究其潛在的解熱機制,以期闡明牦牛角解熱的科學(xué)內(nèi)涵,為牦牛角新資源藥材開發(fā)提供證據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠,體質(zhì)量150～200 g。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2021-0011，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,室溫保持在20～24 ℃,相對濕度為58%～62%,光照周期為12 h,自由進食飲水。所有動物實驗方案均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審查批準(zhǔn)(許可號:202112A065)。

1.2 藥材與試劑

牦牛角購自西藏市那曲鎮(zhèn)羅布熱地市場,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為?？苿游镪笈osgrunniensLinnaeus.的角。羚羊角粉購自南京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號：011201;阿司匹林腸溶片購自德國Bayer公司,批號：BJ56442;LPS購自Sigma公司,批號12190801;烏來糖購自上海源葉生物科技有限公司,批號：S11036;氯化鈉注射液購自辰欣藥業(yè)股份有限公司,批號：2101080725;羧甲基纖維素鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號：20191203;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白介素-1β(IL-1β)試劑盒、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)試劑盒與前列腺素E2(PGE2)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,批號：20220510;乙腈、甲醇(色譜純)購自德國Merk公司;甲酸(色譜純)購自美國ACS公司,批號：C11901830;亮氨酸腦啡肽購自美國Waters公司。

1.3 儀器

Waters ACQUITY UHPLC系統(tǒng)(包括四元泵溶劑系統(tǒng),在線脫氣機和自動進樣器，英國Waters)、Waters SYNAPT G2-Si質(zhì)譜儀(英國Waters)、MassLynx質(zhì)譜工作站(英國Waters)、Milli-Q Advantage超純水系統(tǒng)(美國Millipore)、ML204精密分析天平(瑞士Mettler Toledo)、Tissuelyser-48全自動樣品快速研磨儀、Microfuge 22R高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter)、EnSpire多功能酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer)、ST60-4微孔板恒溫振蕩器(杭州米歐)、MV-100渦旋混勻儀(武漢塞維爾)、YT308醫(yī)用電子體溫計(江蘇魚躍)。

2 方法

2.1 藥液制備

牦牛角去除骨塞后,經(jīng)南京理工大學(xué)國家特種超細粉體工程技術(shù)研究中心加工粉碎為400目超微粉。臨用前用0.2%CMC-Na溶液配成一定濃度的混懸液。羚羊角粉與阿司匹林腸溶片供試品藥液制備方法同上。

2.2 實驗動物造模、分組及給藥

實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,實驗前3天每日早晚各1次對大鼠進行適應(yīng)測體溫操作,實驗前10 h禁食不禁水,實驗當(dāng)日致熱前連續(xù)測體溫3次,以其平均值作為基礎(chǔ)體溫,淘汰基礎(chǔ)體溫>38 ℃且體溫波動>0.5 ℃的大鼠。取8只體溫合格大鼠腹腔注射(10 mL·kg-1)0.9%氯化鈉注射液,作為空白組；其余大鼠均等體積腹腔注射由0.9%氯化鈉注射液現(xiàn)配的LPS溶液(80 μg·kg-1)建立發(fā)熱模型。造模大鼠于造模6 h后重新測量體溫,篩選40只發(fā)熱幅度在0.7～1.7 ℃之間的大鼠,按照分層分組方法隨機分為5組,每組8只,分別為模型組、阿司匹林組、羚羊角組、牦牛角低劑量組、牦牛角高劑量組,分組后立即灌胃給藥。阿司匹林組按80 mg·kg-1劑量給予阿司匹林腸溶片混懸液灌胃(按人每日臨床劑量0.016 g·kg-1折算)，羚羊角組按0.05 g·kg-1劑量給予羚羊角粉混懸液(按人每日臨床劑量0.01 g·kg-1折算)，牦牛角低劑量組按0.625 g·kg-1劑量給予牦牛角粉混懸液(按人每日臨床劑量0.125 g·kg-1折算)，牦牛角高劑量組按1.25 g·kg-1劑量給予牦牛角粉混懸液(按人每日臨床劑量0.25 g·kg-1折算)，空白組與模型組同時灌胃等體積0.2%CMC-Na溶液。隨后每隔30 min測量記錄1次體溫,連續(xù)監(jiān)測4 h,計算各組大鼠在各監(jiān)測點的體溫增減值(ΔT,實測體溫值-基礎(chǔ)體溫值)及體溫反應(yīng)指數(shù)(TRI,平均體溫反應(yīng)曲線與基線之間的面積),繪制體溫反應(yīng)曲線并分析解熱效果[8]。

2.3 血清、血漿及下丘腦樣本的采集

各組大鼠于最后一次測肛溫后,腹腔注射20%烏來糖(8 mL·kg-1)進行麻醉,經(jīng)腹主動脈取血,采用真空采血管及肝素鈉采血管進行血液收集,全血放置2 h后,于4 ℃ 1 500×g離心15 min,吸取上清液于-80 ℃下冷凍保存。隨后迅速取出全腦,預(yù)冷生理鹽水溶液漂洗2～3次洗去血跡,冰上操作于視交叉與灰結(jié)節(jié)之間取下丘腦組織進行液氮速凍,后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待測[9]。

2.4 血清及下丘腦細胞因子測定

將下丘腦組織置于冰上解凍,準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量。按質(zhì)量體積比1 g∶9 mL的比例加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.2),用組織勻漿機將其勻漿充分,冰上靜置30 min后,4 ℃ 1 000×g離心20 min,取上清,采用ELISA試劑盒按照說明書要求測定血清中TNF-α與IL-1β水平及下丘腦組織中cAMP與PGE2水平[9]。

2.5 血漿樣品的代謝組學(xué)分析

2.5.1 樣本處理 將凍存的血漿樣本置于冰上解凍,各組分別取100 μL加入300 μL冷乙腈沉淀蛋白,渦旋混勻1 min,于4 ℃冰箱靜置30 min后,以4 ℃ 19 000×g離心15 min,取上清,備用[10]。

將所有待測樣本各取10 μL混合作為質(zhì)控樣本(QC)樣本。進樣前后及各組樣品間均進1針QC樣本,用于評估UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)穩(wěn)定性。

2.5.2 LC-MS條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)。梯度洗脫條件:0～6 min,95%～55%A;6～13 min,55%～5%A;13～14 min,5%A。柱溫40 ℃,流速0.4 mL·min-1,進樣量2 μL[11]。

采用ESI離子源正、負離子模式(ESI+/ESl-),質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000;毛細管電壓、錐孔電壓分別為3.0 kV和30 V;萃取電壓:2.0 V;離子源溫度120 ℃,脫溶劑氣溫度為350 ℃;錐孔氣流量:50 L·h-1;碰撞能量:20～50 eV,準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用亮氨酸-腦啡肽(ESI+:m/z556.277 1,ESI-:m/z554.261 5)溶液為鎖定質(zhì)量溶液。

2.5.3 數(shù)據(jù)處理和多元分析 采用Progenesis QI(V2.4)進行峰對比、拾取、噪聲去除、重疊峰解析、標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化等處理,分別輸出正、負離子模式下由保留時間、質(zhì)荷比值(m/z)和每個峰值區(qū)域的歸一化峰面積的數(shù)據(jù)列表,導(dǎo)入SIMCA-P 14.1進行無監(jiān)督主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA),通過OPLS-DA中R2Y(Y的累積模型變化)和Q2(累積的預(yù)測變化)2個關(guān)鍵參數(shù)評價魯棒模型的可靠性,當(dāng)參數(shù)越接近1.0時,則模型預(yù)測可靠性越高。Q2大于0.5表示可接受,通過200次置換檢驗驗證模型是否過擬合[12]。選取VIP>1與S-plot≥0.05的交集變量作為潛在差異代謝物。采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,利用t檢驗與非參數(shù)檢驗等分析方法檢驗兩組間生物標(biāo)志物的相對峰面積是否具有顯著性差異,以P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義篩選得到差異代謝物。使用HMDB(https://hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫及Metabo Analyst(https://www.metaboanalyst.ca/)進行生物標(biāo)志物鑒定和代謝通路分析[13]。

2.6 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 解熱效應(yīng)

各給藥組干預(yù)發(fā)熱大鼠在不同時間點的體溫變化如表1、圖1所示,體溫反應(yīng)指數(shù)變化見表2。結(jié)果表明,與空白組比較,造模后6 h模型組與各給藥組大鼠體溫明顯上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);與模型組比較,牦牛角低劑量組在給藥后2、3 h體溫明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且與羚羊角解熱效應(yīng)相當(dāng)。與模型組比較,牦牛角高劑量組給藥后1 h(TRI6～7 h)體溫反應(yīng)指數(shù)明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠肛溫變化

表2 不同時間監(jiān)測點下各組體溫反應(yīng)指數(shù)變化

3.2 細胞因子表達水平

結(jié)果見圖2,與空白組比較,模型組血清TNF-α水平及下丘腦組織中cAMP與PGE2水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.001),血清IL-1β水平也有上升趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組比較,牦牛角低劑量組TNF-α及cAMP水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),牦牛角高劑量組cAMP水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),牦牛角給藥組均有降低IL-1β與PGE2水平的趨勢。

3.3 代謝組學(xué)樣品的質(zhì)量控制評估

通過UHPLC-MS/MS采集大鼠血漿樣本正、負離子流色譜圖。采用PCA分析對QC樣本進行聚類分析來考察儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖3所示,在正、負離子模式下,QC樣品均緊密聚集,表明所建立的代謝組學(xué)分析方法穩(wěn)定可靠,符合大批量進樣的分析條件。

3.4 UPLC-Q-TOF-MS數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計分析

為進一步尋找牦牛角發(fā)揮解熱藥效的潛在生物標(biāo)志物,對模型組與空白組進行OPLS-DA分析,結(jié)果如圖3所示,在OPLS-DA評分結(jié)果中空白組與模型組明顯分離,在正離子模式下,R2Y=0.996,Q2=0.911;在負離子模式下,R2Y=0.96,Q2=0.832;200次置換結(jié)果Q2均小于0,表示模型均未過擬合且具有良好的預(yù)測能力。在S-plots圖中,提取VIP>1和|P|≥0.05變異變量作為潛在候選標(biāo)志物,進一步采用t檢驗選出具有顯著性差異(P<0.05)的化合物導(dǎo)入HMDB數(shù)據(jù)庫進行檢索,如圖3所示(其中紅色標(biāo)記為已鑒定得到的15個差異代謝物,黃色標(biāo)記為符合篩選要求但未鑒定出的生物標(biāo)志物,藍色標(biāo)記為滿足VIP和|P|值要求,但經(jīng)t檢驗未見顯著性差異的化合物),詳細信息如表3所示。

3.5 血漿中差異代謝產(chǎn)物鑒定

根據(jù)血漿代謝物的質(zhì)荷比、分子式、二級碎片離子、保留時間,并結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫對空白組與模型組之間顯著變化的代謝物進行鑒定,共指認出15個差異代謝物,詳細信息見表3、圖4。牦牛角高劑量給藥后可顯著回調(diào)其中11個代謝物,主要包括磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、腺嘌呤、琥珀酸、L-蘇氨酸、4-羥脯氨酸、磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰乙醇胺等。

表3 潛在差異代謝物

3.6 代謝通路分析

將差異代謝物導(dǎo)入Metaboanalyst5.0數(shù)據(jù)庫中進行代謝通路分析。代謝通路影響值>0.1的通路被視為貢獻值最大的代謝通路。分別篩選得到與發(fā)熱相關(guān)的代謝通路共13條以及牦牛角發(fā)揮解熱作用的代謝通路共7條,結(jié)果見圖5,結(jié)果表明發(fā)熱主要涉及通路及牦牛角解熱主要涉及通路均為甘油磷脂代謝通路。

4 討論

LPS為革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,通過內(nèi)毒素作用于免疫細胞產(chǎn)生內(nèi)源性致熱原,通過中樞介質(zhì)作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱。LPS所致發(fā)熱模型動物升溫過程出現(xiàn)的癥狀與臨床感染性炎癥所致發(fā)熱相似,常用于篩選解熱藥物并探討炎性發(fā)熱機制[14]。體溫反應(yīng)指數(shù)為發(fā)熱機理實驗中直觀定量指標(biāo),能一定程度概括發(fā)熱高度、熱程和持續(xù)波動變化三個要素[15]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),牦牛角高劑量組在給藥后1 h體溫反應(yīng)指數(shù)明顯下降(P<0.05),牦牛角低劑量組在給藥后2、3 h體溫明顯下降(P<0.05),且與羚羊角解熱效應(yīng)相當(dāng),提示牦牛角給藥組具有較好的解熱作用,與西藥阿司匹林退熱快速但易反彈特點相比,牦牛角呈現(xiàn)出持久退熱的作用趨勢。

cAMP是接近體溫中樞終端的正調(diào)節(jié)介質(zhì),是腦內(nèi)多種介質(zhì)的第二信使,是多種致熱原引起發(fā)熱的共同中介環(huán)節(jié);PGE2為引起發(fā)熱的主要介質(zhì)，內(nèi)生致熱源通過作用于下丘腦視前區(qū)來刺激下丘腦中PGE2釋放，進而改變體溫調(diào)節(jié)神經(jīng)元的放電頻率，致使體溫調(diào)定點上調(diào)引起發(fā)熱[16-17]。TNF-α與IL-1β為外周致熱細胞因子,兩者協(xié)同介導(dǎo)發(fā)熱進程。TNF是內(nèi)生致熱源刺激巨噬細胞、淋巴細胞等產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì),包括TNF-α和TNF-β,二者生物效應(yīng)相似,其中TNF-α是參與發(fā)熱過程的主要細胞因子,可以直接刺激PGE2或IL-6的生成。IL-1β是LPS致熱所必需的介導(dǎo)物質(zhì)之一,主要作用于體溫調(diào)節(jié)中樞。IL-1β可直接通過終板血管器的毛細血管或經(jīng)過毛細血管壁到達血管外間隙(血腦屏障外側(cè))的干細胞處,血液中IL-1β可激活毛細血管的內(nèi)皮細胞,通過內(nèi)皮細胞間接分泌到腦中進而傳輸致熱信號[18-20]。本研究表明模型組血清TNF-α水平及下丘腦組織中cAMP與PGE2水平均顯著升高(P<0.05,P<0.001),血清IL-1β水平也有上升趨勢,牦牛角給藥組能顯著下調(diào)TNF-α及cAMP水平(P<0.01),且有降低IL-1β與PGE2水平的趨勢,提示牦牛角可通過抑制內(nèi)源性致熱源和中樞體溫正性調(diào)節(jié)介質(zhì)的釋放來發(fā)揮解熱作用。

非靶向血漿代謝組學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與發(fā)熱相關(guān)的差異代謝物有15個,主要涉及的信號通路為甘油磷脂代謝通路。牦牛角給藥后可顯著回調(diào)其中11個代謝物,包括磷脂酰乙醇胺PE[16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)]與PE(18∶0/14∶0)、鞘磷脂SM[d18∶1/18∶1(11Z)]與SM[d18∶1/22∶1(13Z)]、腺嘌呤、琥珀酸、L-蘇氨酸、4-羥脯氨酸、磷脂酰膽堿PC[18∶3(9Z,12Z,15Z)/P-18∶1(9Z)]與PC[20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/P-16∶0]、溶血性磷脂酰乙醇胺LysoPE(0∶0/18∶0)。磷脂作為細胞膜的重要組成成分可分為甘油磷脂與鞘磷脂兩大類,其中PE與PC是細胞膜中含量最豐富的磷脂,在細胞信號傳導(dǎo)、膜錨定和底物轉(zhuǎn)運中起主要作用,其合成增加與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)[21];腺嘌呤主要參與能量代謝與白細胞生成[22];琥珀酸作為檸檬酸或檸檬酸循環(huán)的一個重要組成部分,能向電子轉(zhuǎn)移鏈提供電子,主要參與能量代謝[23];有研究表明機體每升高1 ℃需增強10%～12.5%的代謝速度[24],因此人體在發(fā)熱情況下機體能量代謝水平相應(yīng)升高,進而影響腺嘌呤與琥珀酸代謝;4-羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分,隨著發(fā)熱機體能量代謝異常進而使活性氧增加,加速膠原蛋白降解[25],使得4-羥脯氨酸水平升高。進一步進行通路富集分析,結(jié)果表明牦牛角給藥組主要涉及甘油磷脂代謝通路,提示牦牛角能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)紊亂而抑制感染性發(fā)熱。

綜上所述,本研究從細胞因子水平與血漿代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控角度探究了牦牛角發(fā)揮解熱功效的作用機制,牦牛角可通過調(diào)節(jié)中樞和外周的致熱細胞因子水平,調(diào)節(jié)脂質(zhì)類成分,從而影響脂質(zhì)代謝等途徑發(fā)揮解熱作用,起效快且持久,療效顯著,與名貴中藥羚羊角解熱效應(yīng)相當(dāng)。本研究為牦牛角臨床應(yīng)用及開發(fā)成為替代珍稀角類藥材的類效資源提供了重要支撐。