1 732例兒童血清維生素K2臨床分析及其與骨代謝標志物關系的研究

杜長秀 李娜

（1.沈陽醫(yī)學院，遼寧沈陽 110034；2.沈陽市兒童醫(yī)院兒童保健科，遼寧沈陽 110032）

維生素K2（vitamin K2，VitK2）廣泛存在于發(fā)酵食品或動物來源的食品中，主要由細菌合成，因多種側鏈結構不同，被命名為四烯甲萘醌-n（menatetrenone，MK-n），其中較為重要的是MK-4和MK-7［1-2］。VitK2作為γ-谷氨酸羧化酶的輔酶［3］，參與骨相關維生素K（vitamin K，VitK）依賴性蛋白質羧化的生理過程，而骨鈣素（osteocalcin，OC）作為骨相關VitK依賴蛋白質中最重要的一種，能直接反映成骨細胞和破骨細胞活性，是成骨細胞功能和骨質礦化的特殊標志物。目前國際推薦同時測量骨形成標志物和骨吸收標志物，可更好地協(xié)助臨床醫(yī)生判斷人體內骨代謝的變化，預測骨丟失情況，評估治療療效。其中Ⅰ型前膠原氨基端前肽（type Ⅰ procollagen amino-terminal peptide，PINP）及Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽（typeⅠcollagen carboxy-terminal peptide，CTX）分別為國際上推薦的首選骨形成標志物及骨吸收標志物［4］。

van Summeren 等［5］隨機對照試驗研究中，給55例健康兒童補充MK-7，發(fā)現(xiàn)在不影響凝血功能的情況下，適量MK-7的補充可以增加OC的羧化，促進兒童骨骼健康發(fā)育。隨著對骨健康研究的深入，發(fā)現(xiàn)兒童晚期和青春期是骨骼積累的關鍵時期，此期可以達到峰值骨量的95%［6］，如果在青春期末未達到其峰值，不僅影響兒童本身的生長發(fā)育，同時，成年以后患病理性骨折和骨質疏松的風險明顯提升，所以兒童時期的骨骼健康至關重要［7］。國內外關于VitK 與骨代謝標志物的關系研究多基于成人（絕經(jīng)期婦女、中老年），而國內關于兒童的臨床研究較少，如胡雪松等［8］研究用VitK 治療兒童失用性骨質疏松對骨生化指標及骨代謝標志物的影響，未明確區(qū)分VitK1和VitK2，故本研究通過測定VitK2和骨代謝標志物水平，了解兒童VitK2的營養(yǎng)分布狀況，及其血清VitK2和骨代謝標志物（OC、PINP、CTX）相關性，以期為預防VitK2的缺乏和促進兒童的骨骼健康提供科學參考和建議。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取2020 年10 月至2021 年10 月于沈陽市兒童醫(yī)院兒童保健科門診常規(guī)體檢的兒童1 732例為研究對象，測定血清VitK2、25羥維生素D［25-hydroxyvitamin D，25(OH)D］水平。納入標準：（1）0～14 歲常規(guī)體檢兒童；（2）身高、體重達到標準的兒童；（3）家屬同意并簽署知情同意書。排除標準：（1）有明確先天性代謝病和內分泌疾病者（如低磷抗D佝僂病、甲狀腺疾病、糖尿病、肝腎疾?。┑?；（2）患嚴重呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)疾病患兒；（3）長期服用糖皮質激素或其他影響骨代謝藥物（如噻嗪類利尿劑、肝素、抗驚厥藥物、重組人甲狀旁腺素）等。將受試者按年齡段分為＜1歲組、1～3歲組、＞3～6 歲組、＞6～14 歲組；根據(jù)血清VitK2水平分為VitK2正常組和VitK2缺乏組，分析各組間臨床特征。

為排除維生素D對骨代謝的影響，將25(OH)D＜50 nmol/L兒童排除，同時剔除采血不足和資料不完整者，最終剩余309 例兒童，測定血清OC、PINP、CTX 水平，分析不同年齡段骨代謝標志物水平及其與血清VitK2的相關性。

本研究已獲得沈陽市兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準（2019001）。

1.2 相關定義

參考德國柏林醫(yī)學診斷檢驗中心實驗室標準，將血清VitK2＜0.1 ng/mL 定義為缺乏。體重指數(shù)（body masss index，BMI）=體重（kg）/身高（m2），參考中國0～18歲兒童、青少年BMI的生長曲線［9］，BMI≥85 百分位數(shù)（或+SD）為超重，BMI≥95 百分位數(shù)（或+2 SD）為肥胖。參考美國醫(yī)學研究院報告［10］將血清25(OH)D＜50 nmol/L定義為缺乏。

1.3 血清VitK2和25(OH)D測定

1 732 例兒童于早晨空腹狀態(tài)下采集靜脈血2 mL，離心取血清1 mL，送至兒童神經(jīng)康復實驗室檢測。采用高效液相色譜串聯(lián)質譜法測定血清VitK2和25(OH)D，儀器型號為美國AB 4500MD，標準品均購自美國Sigma-Aldrich檢驗所，實驗用水采用德國默克Milli-Q Diret8 60 LITER PE TANK 純水化系統(tǒng)制備。

1.4 骨代謝標志物測定

309例兒童測骨代謝標志物，于清晨空腹抽靜脈血4 mL，以3 000 r/min離心5 min，分離出血清，置于-20℃冰箱低溫保存待測。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法測定OC、PINP 和CTX，通過繪制標準曲線計算樣品所測指標濃度。酶標儀型號為日本BIORAD iMark，試劑盒均購自北京索萊寶公司。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準差（±s），多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗；非正態(tài)分布計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較用Nemenyi檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)和百分率（%）表示，率的比較用χ2檢驗，多個樣本率的兩兩比較用Bonferroni 法。相關性分析用Spearman 秩相關。以α=0.05 為檢驗水準，其中Bonferroni法以（α'=α/比較次數(shù)）為檢驗水準。

2 結果

2.1 1 732例兒童血清VitK2臨床資料分析

1 732 例兒童中，中位年齡為7.3（3.8，10.7）歲，血清VitK2缺乏率為52.31%（906/1 732），睡眠不實、超重/肥胖、生長痛（≥3 歲）發(fā)生率分別為33.78% （585/1 732）、 15.65% （271/1 732），29.97%（519/1 732）。男童睡眠不實、超重/肥胖、生長痛（≥3 歲） 發(fā)生率高于女童（P＜0.05），見表1。

表1 男童和女童臨床資料比較

VitK2缺乏組年齡大于VitK2正常組，食欲缺乏、超重/肥胖、生長痛（≥3歲）發(fā)生率高于VitK2正常組（P＜0.05）。2 組間無癥狀者比例、睡眠不實發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 VitK2正常組和VitK2缺乏組臨床資料比較

2.2 1 732例兒童血清VitK2水平分析

1 732 例兒童中位血清VitK2水平為0.1（0.1，0.2）ng/mL，不同年齡段間血清VitK2缺乏率、血清VitK2水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。經(jīng)兩兩比較，＞6～14 歲組血清VitK2缺乏率高于1～3 歲組（P＜0.0083），血清VitK2水平低于1～3 歲組（P＜0.05）。見表3。

表3 不同年齡段血清VitK2的水平

2.3 309例兒童骨代謝標志物水平分析

＞3～6 歲組和＞6～14 歲組兒童血清CTX 水平低于＜1 歲組，＞3～6 歲組兒童血清CTX 水平低于1～3歲組（P＜0.05）；＞6～14 歲組兒童血清OC 水平高于＜1 歲組（P＜0.05）；＞3～6 歲組和＞6～14 歲組兒童血清PINP 水平高于＜1 歲組，＞6～14 歲組兒童血清PINP水平高于1～3歲組（P＜0.05）。見表4。

表4 不同年齡段骨代謝標志物的水平

2.4 VitK2與骨代謝標志物的相關性分析

經(jīng)Spearman 秩相關分析表明，年齡與血清VitK2、OC、PINP 水平呈正相關（分別rs=0.136、0.433、0.415，P＜0.05）。年齡與血清CTX水平呈負相關（rs=-0.488），血清VitK2與OC 水平呈正相關（rs=0.347），血清CTX 與PINP 水平呈負相關（rs=-0.317），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而血清VitK2與 血 清CTX、PINP 無 相 關 性（P＞0.05）。見表5。

表5 各指標間的相關性

3 討論

VitK2作為人類所必需的天然營養(yǎng)素，在體內廣泛分布，其與γ-谷氨酰羧化酶具有高度親和性，可利用氫醌的活化形式激活凝血因子、OC 和基質Gla蛋白發(fā)揮促進凝血、參與骨代謝、調節(jié)糖脂代謝、預防血管硬化等生理過程［11-12］。本研究中，超重/肥胖兒童血清VitK2缺乏率升高，這與國外研究［13］表明VitK2具有降脂作用一致。Sogabe 等［13］用MK-4 對雌性大鼠進行為期3 個月的喂養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MK-4 的加用顯著降低了總脂肪積累，且血清三酰甘油降低了29%。

由于血液中VitK2濃度低，其脂溶性易受脂質的干擾，因此測定血液中VitK2比較困難，國內外也沒有兒童VitK2營養(yǎng)分布狀況的確切數(shù)值，相關文獻報道健康人群血VitK2水平高于絕經(jīng)期女性和骨質疏松人群；日本人群高于歐洲人群，考慮與飲食和個體因素（如健康狀態(tài)、年齡段、人種等）有關［14-17］。本研究中1 732例兒童血清VitK2水平的中位數(shù)為0.1（0.1，0.2）ng/mL，血清VitK2缺乏率為52.31%，不同年齡段兒童血清VitK2水平中位數(shù)均處于較低水平，這與我國飲食結構中普遍缺乏VitK2直 接 相 關［18］。1～3 歲 組和＞6～14 歲組 血清VitK2缺乏率、血清VitK2水平差異有統(tǒng)計學意義，考慮到＞6～14歲組是生長發(fā)育的高峰期，此期對營養(yǎng)素需求量較大有關；另一方面，人們對VitK2與骨骼健康相關認知較少，只注重維生素D、鈣的補充，忽視VitK2營養(yǎng)狀況有關，因此我們要重視VitK2日常監(jiān)測與補充。但目前研究多基于VitK 的膳食補充，也未有VitK2的兒童推薦補充劑量。國外的MK-7 臨床試驗不良反應中，Ozdemir 等［19］對20 例3～18 歲地中海貧血的骨病患兒進行為期1 年的含有MK-7和骨化三醇膳食補充的過程中，未觀察到不良反應，且依從性良好。根據(jù)美國藥典委員會發(fā)表的對MK-7 安全性評價，認為MK-7 作為食品添加劑，兒童每日攝入量可高達1.5 μg/(kg·d)而對凝血功能沒有不良影響［20］。上述結果皆表明VitK2作為食品補充是安全的，暫未有嚴重不良事件的發(fā)生，VitK2缺乏兒童可通過此方法補充。

維生素D 與VitK2共同參與調節(jié)骨代謝，維生素D 可在基因轉錄水平影響OC 的合成，且OC 合成與維生素D水平有關，多項研究報道維生素D與PINP、CTX 水平的相關性，但結論尚未統(tǒng)一。洪維等［21］在一項以1 389 例體檢人群為對象的研究中，發(fā)現(xiàn)25(OH)D 與PINP 呈負相關，且僅在25(OH)D嚴重減低時，PINP水平出現(xiàn)有統(tǒng)計學意義的升高，但與CTX 無明顯相關性，且CTX 水平在不同維生素D水平間的差異無統(tǒng)計學意義。但另一項以2 798例德國學齡兒童為對象的研究中，發(fā)現(xiàn)外周循環(huán)中維生素D濃度越高，反映骨吸收水平的CTX 濃度越低［22］。由此可得出骨代謝標志物與維生素D 含量相關，故將25(OH)D＜50 nmol/L 的兒童剔除，控制維生素D缺乏對試驗研究的影響。

VitK2作為非肝組織中VitK 最豐富的形式，參與骨相關VitK 依賴性蛋白質的羧化。當機體中的成骨細胞進行成熟分化時，可表達出一種特異性的非膠原蛋白，即OC。OC 不僅可以調節(jié)骨吸收，而且在骨基質礦化和成骨細胞分化中起到關鍵作用。血清OC水平的升高提示骨形成速率加快，兒童時期骨代謝水平活躍，骨組織的形成大于吸收，從而實現(xiàn)骨量的積累，故兒童生長期血清OC水平多升高。本研究中，血清OC水平與血清VitK2、年齡呈正相關，＜1 歲組兒童血清OC 水平遠低于＞6～14歲組，這與金軼［23］研究得出＞3個月至1歲兒童VitK缺乏嚴重，易發(fā)生骨代謝異常結論一致。＞6～14歲組血清OC呈較高水平，此現(xiàn)象考慮與青春期生長發(fā)育高峰骨代謝旺盛，骨形成速率加快有關。此外，還發(fā)現(xiàn)生長痛患兒VitK2缺乏率升高，血清VitK2又與血清OC 呈正相關，考慮VitK2缺乏可能是兒童骨痛產(chǎn)生的原因之一。國內外的多項研究也表明體內良好的VitK2狀態(tài)有利于骨健康，對骨代謝異常疾病有一定的治療作用。如康麗娟等［24］發(fā)現(xiàn)VitK可提高佝僂病患兒OC的羧化率，對佝僂病有一定的治療作用；Nicolaidou等［25］發(fā)現(xiàn)對囊性纖維化兒童補充VitK 可改善患兒的整體骨健康狀態(tài)。

CTX 作為Ⅰ型膠原降解產(chǎn)物，主要反映骨吸收的狀態(tài)，檢測血清CTX 水平可以預測骨轉換的活躍程度，＜1歲組兒童血清CTX水平明顯高于＞3～6 歲組和＞6～14 歲組，提示＜1 歲組骨轉換水平活躍，符合嬰兒期的生長發(fā)育規(guī)律。PINP 由成骨細胞分泌，反映骨形成狀態(tài)，是新骨形成的特異性敏感指標，＜1歲組兒童血清PINP水平低于＞3～6歲組和＞6～14 歲組年齡組，血清PINP 水平與年齡呈正相關，提示隨著年齡的增長實現(xiàn)骨量積累，促進其生長發(fā)育。骨代謝包括骨吸收和骨形成過程，破骨細胞吸收舊骨，成骨細胞生成新骨取代以完成骨轉換，不同時期骨轉換水平不同，本研究發(fā)現(xiàn)血清CTX 與PINP 水平呈負相關，提示CTX 與PINP 間存在相互轉換、相互博弈現(xiàn)象，符合骨代謝的病理生理過程。在相關性分析中未發(fā)現(xiàn)血清VitK2與血清CTX、PINP 的關聯(lián)性，考慮兩指標只受維生素D的影響，也可能與本研究納入樣本量較小有關。

綜上所述，VitK2與OC存在相關性，可通過作用于OC來調節(jié)骨代謝影響骨健康。血清VitK2缺乏組超重/肥胖發(fā)生率高于正常組，提示VitK2缺乏可能與超重/肥胖有關，建議臨床醫(yī)生及家長應高度重視超重/肥胖兒童VitK2的營養(yǎng)狀況。本研究雖驗證了VitK2與骨代謝標志物的相關性，但未對VitK2缺乏兒童進行相關研究，存在一定的不足。另外納入本研究對象為我院門診常規(guī)體檢兒童，存在一定的選擇偏倚，仍需大量前瞻性、多中心基于兒童的臨床試驗研究來獲得VitK2的營養(yǎng)分布狀況，并發(fā)布相應的臨床預防及補充方案。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突關系。