不同齲敏感性兒童口腔變異鏈球菌信號分子AI-2活性檢測

陳 嵐，韓林秀，吳 菊，徐 皚，劉興容

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科（瀘州646000）；2.重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院口腔科（開州405400）；3.西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實驗室（瀘州646000）；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科（瀘州 646000）

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細菌與細菌間進行信息交流，用以感受種群密度變化并協(xié)調(diào)種群間行為改變的重要通訊系統(tǒng)[1]，QS系統(tǒng)有不同的類型，其中LuxS/AI-2廣泛存在于革蘭氏陽性菌和陰性菌中，是種間通用的交流系統(tǒng)[2]。LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控著細菌的多種重要生理過程，如生物發(fā)光、毒素的分泌、抗生素的合成、生物膜的形成、生物膜內(nèi)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移以及耐藥性等[3-7]，因此深入研究AI-2 分子具有重要意義。

齲病是由牙表面致病性菌斑生物膜引起的一種典型口腔感染性疾病[8]，菌斑生物膜中存在著多種細菌，變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）作為其中的關(guān)鍵細菌[9]，能產(chǎn)生利于致齲生物膜形成和種間相互作用的信號分子[10]。研究發(fā)現(xiàn)牙菌斑中存在信號分子AI-2，能調(diào)節(jié)相關(guān)毒力因子的表達，在致齲過程發(fā)揮重要作用[11-12]。變異鏈球菌不同菌株之間致齲力存在很大差異[13]，而不同致齲性變異鏈球菌信號分子AI-2的產(chǎn)生情況目前尚未見相關(guān)研究報道。本實驗以課題組前期分離保存的不同齲敏感性兒童口腔變異鏈球菌臨床分離株為實驗對象，采用簡便易行的哈維弧菌BB170生物學(xué)發(fā)光法定量檢測[14]不同菌株間AI-2的表達差異，為進一步研究AI-2如何調(diào)節(jié)變異鏈球菌的致齲作用奠定基礎(chǔ)。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

不同齲敏感兒童口腔變異鏈球菌臨床分離株（高齲株、中齲株、無齲株）均由本實驗課題組前期分離，保存于西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實驗室；變異鏈球菌國際標準株UA159（簡稱UA159標準株）由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院國家級重點實驗室提供；哈維弧菌BB170（vibrio harveyiBB170）購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

BHI 培養(yǎng)基、2216E 培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；甘露醇、蜜二糖、棉子糖、山梨醇、精氨酸雙水解酶肉湯細菌微量生化鑒定管、七葉苷培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責任公司）；總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR 試劑盒（TOYOBO 公司，日本）；Luxs引物、pfs引物、16SrRNA引物（上海生工生物科技有限公司）。

低溫高速離心機，RT-qPCR 儀（Thermo 公司，美國）；多功能酶標儀（Bio-Tek 公司，美國）；核酸蛋白檢測儀（凱奧公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌的復(fù)蘇、培養(yǎng)及體外非應(yīng)激條件下生長曲線的測定 將3 組變異鏈球菌及UA159 標準菌株復(fù)蘇后，于BHI固體培養(yǎng)基上平板劃線，37 ℃厭氧（80%N2、10%H2、10%CO2）培養(yǎng)至24 h 時進行革蘭染色和生化鑒定。挑選每組菌株的單菌落至BHI 液體培養(yǎng)基中，每組3 管，37 ℃厭氧（80% N2、10% H2、10% CO2）培養(yǎng)24 h。3000 r/min 離心15 min，棄上清液，PBS 液漂洗，重復(fù)3 次，重懸，調(diào)節(jié)吸光度（optical density，OD）600=1；37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h，每隔2 h從每組中各取出1管放置于4 ℃冰箱保存。每組每管分別吸取100 μL加入標準96 孔板，每管樣本取3 次，多功能酶標儀測每組OD600值，繪制細菌生長曲線。

1.3.2 各組變異鏈球菌信號分子AI-2的活性檢測

1.3.2.1 各菌株無菌上清液的制備 將各菌株按2%接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至16 h（穩(wěn)定期），3 000 r/min 離心15 min，收集上清液，用0.22 μm濾菌器過濾除菌;將哈維弧菌BB170 接種于AB 培養(yǎng)基，28 ℃連續(xù)培養(yǎng)12 h，以相同方法收集無菌上清液作為陽性對照；用0.22 μm 的濾菌器分別過濾AB 培養(yǎng)基和BHI 液體培養(yǎng)基，作為陰性對照和介質(zhì)對照。各組濾液標記后于-80 ℃保存。

1.3.2.2 信號分子AI-2 的活性檢測 將哈維弧菌BB170菌株接種于AB培養(yǎng)基中，28 ℃、90 r/min連續(xù)振蕩培養(yǎng)12 h調(diào)節(jié)至OD600為0.8～1，菌液用新鮮AB培養(yǎng)基按照1∶5 000 的比例稀釋，振蕩混勻，將各組變異鏈球菌無菌上清液及陽性、陰性、介質(zhì)對照與與上述稀釋過的哈維弧菌BB170 培養(yǎng)液按照1∶100 的比例混合均勻，28 ℃振蕩培養(yǎng)。1～6 h 內(nèi)每間隔1 h，吸取200 μL于96孔全黑酶標板中，用多功能酶標儀檢測其熒光強度值，樣品與對照均取3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

在6 h內(nèi)，以陰性對照組的熒光強度值降到最低的時間點為基準，陰性對照組的相對熒光強度值為1，信號分子AI-2用相對熒光強度表示。以時間為橫坐標，對應(yīng)時間點的熒光強度值為縱坐標，然后根據(jù)得出的數(shù)據(jù)繪制曲線。計算公式如下：

待測組的相對熒光強度值=待測樣品的熒光強度值/介質(zhì)對照組的熒光強度值；

陽性對照組的相對熒光強度值=陽性對照的熒光強度值/陰性對照組的熒光強度值。

1.3.3 不同生長時期AI-2的活性檢測

1.3.3.1 變異鏈球菌高齲株不同生長時期AI-2的活性檢測 將高齲株按2%的比例接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，共3 管，37 ℃厭氧（80%N2、10%H2、10%CO2）培養(yǎng)16 h，3 000 r/min 離心15 min，PBS 洗滌，重復(fù)3 次，BHI液體培養(yǎng)基重懸調(diào)節(jié)OD600為1，按1.3.2 方法收集在各生長時期（遲緩期、對數(shù)前期、對數(shù)中期、對數(shù)后期、穩(wěn)定期）的無菌上清液，菌體用于總RNA 的提取。將各組上清液以同樣方法進行AI-2的活性檢測。

1.3.3.2 不同時間點信號分子AI-2與OD600的關(guān)系 將接種于BHI 液體培養(yǎng)基中的高齲菌株在37 ℃厭氧（80%N2、10%H2、10%CO2）培養(yǎng)4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h后，各時間點各3管，測定OD600值。并測定在不同時間點信號分子AI-2 的活性，收集數(shù)據(jù)，比較OD600與信號分子AI-2的關(guān)系。

1.3.4 RT-qPCR法檢測LuxS和pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平

1.3.4.1 細菌總RNA的提取及濃度測定 取不同生長時期的變異鏈球菌高齲株菌體，采用細菌總RNA 提取試劑盒提取菌株的RNA,在核酸蛋白檢測儀上測定RNA濃度。

1.3.4.2 引物設(shè)計與合成 在NCBI Genbank 上搜索LuxS及pfs基因的DNA全長序列，應(yīng)用Oligo7設(shè)計內(nèi)參引物（16SrRNA-F和16SrRNA-R）及特性引物（LuxS-F和LuxS-R，Pfs-F和Pfs-R），由上海生工生物股份有限公司合成，具體見表1。

表1 16SrRNA、LuxS、Pfs引物序列Table 1 Primer sequences of 16SrRNA，LuxS and pfs

1.3.4.3 實時熒光定量PCR 根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制20 μL反應(yīng)體系，配制過程均在冰上進行，20 μL反應(yīng)體系：ddH20 2.5 μL、Forward Primer 3 μl、Reverse Primer 3 μL、Template cDNA1.5 μL、SYBR qPCR Mix 10 μL。冰浴條件下行RT-qPCR，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃1 min，循環(huán)1 次，95 ℃15 s，60 ℃10 s，72 ℃30 s，循環(huán)45次，72 ℃5 min，循環(huán)1次。分析各個時間點的菌株LuxS、pfs及內(nèi)參16SrRNA基因的溶解曲線、擴增曲線，數(shù)據(jù)分析采用相對定量分析—2-△△Ct法計算LuxS、pfs基因的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果用表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)和生化鑒定結(jié)果

各組變異鏈球菌經(jīng)革蘭染色，光鏡下（×100）觀察細菌形態(tài)基本一致，均呈長短不一、鏈狀排列，革蘭染色均為紫色陽性，見圖1。

圖1 高齲株（1A）、中齲株（1B）、無齲株（1C）及UA159標準株（1D）（革蘭染色，×100）Figure 1 High caries strains（1A），medium caries strains（1B），caries free strains（1C）and ua159 standard strains（1D）（Gram staining，×100）

如表2 所示，高、中、無齲株及UA159 標準株均可分解山梨醇、甘露醇、蜜二糖、棉子糖使其指示劑變黃，水解七葉苷使指示劑生成黑色沉淀，但均不能水解精氨酸。三組變異鏈球菌株的生化鑒定結(jié)果與變異鏈球菌標準株UA159的生化性狀一致。

表2 生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results

2.2 體外非應(yīng)激條件下生長曲線測定

在非應(yīng)激環(huán)境下，四組變異鏈球菌株生長曲線趨勢基本一致，見圖2。在0～4 h生長緩慢，處于生長遲緩期；在4～8 h增殖速度加快，處于對數(shù)生長期；從8 h開始，速度減緩，12 h進入穩(wěn)定期。高齲株各時間點的菌液濃度均高于無齲株，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在4 h后，中齲株、UA159標準株菌液濃度均高于無齲株，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 四菌株生長曲線測定結(jié)果Figure 2 Growth curves of four strains

2.3 各組變異鏈球菌AI-2的活性檢測結(jié)果

以哈維弧菌BB170為陽性對照，AB培養(yǎng)基為陰性對照，利用哈維弧菌BB170測各組菌株AI-2的產(chǎn)生情況。由圖3可知，在0～3 h內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間的延長，陽性對照、陰性對照、介質(zhì)對照的熒光強度均在不斷降低，在3 h時陰性對照的熒光強度降到最低，隨后開始升高，說明時間達到3 h時，指示菌產(chǎn)生的信號分子AI-2濃度達到誘導(dǎo)發(fā)光的時間閾值。因此，以3 h時的熒光強度值為基準計算相對熒光強度，表示信號分子AI-2活性。

圖3 不同培養(yǎng)時間各樣品的熒光強度值Figure 3 Fluorescence intensity values of samples at different culture times

三組變異鏈球菌均可以產(chǎn)生信號分子AI-2，相對熒光強度均大于陰性對照（圖4）。其中高齲株的相對熒光值最大，不僅高于中齲株和無齲株，還明顯高于陽性對照（P＜0.05），因此在后續(xù)實驗中選擇高齲株作為高產(chǎn)信號分子AI-2菌株。

圖4 各組變異鏈球菌相對熒光強度比較Figure 4 Comparison of relative fluorescence intensity of Streptococcus mutans in each group

2.4 不同生長時期高齲株AI-2的活性檢測

對高齲株不同生長時期AI-2活性檢測結(jié)果表明，在不同生長時期均有AI-2 產(chǎn)生，但在遲緩期、對數(shù)前期其產(chǎn)生AI-2 較少，從對數(shù)中期開始逐漸增加，到對數(shù)后期達峰值，顯著高于其他生長時期（P＜0.05），產(chǎn)生的AI-2 為陰性對照的19 倍，并在穩(wěn)定期開始下降，如圖5所示。

圖5 高齲株不同生長時期相對熒光強度比較Figure 5 Comparison of relative fluorescence intensity of high caries strains at different growth stages

由圖6 可知，在4～16 h 內(nèi)，高齲株的OD600隨著培養(yǎng)時間不斷上升，在16 h 后達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)。而在4～12 h內(nèi)，AI-2信號隨著培養(yǎng)時間不斷增加，在12 h之后開始下降。

圖6 高齲株上清液相對熒光強度與OD600的關(guān)系Figure 6 Relationship between relative fluorescence intensity of supernatant of high caries strains and OD600

2.5 不同生長時期LuxS 基因和pfs 基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平

應(yīng)用2-△△CT法分析不同時期LuxS基因、pfs基因的mRNA 水平。從表3、圖7 中可知，LuxS和pfs基因的相對表達量隨時間的增加趨勢大致相同，在遲緩期到對數(shù)后期的過程中，LuxS和pfs的mRNA 水平逐漸升高，至對數(shù)后期達最高，LuxS為10.47 ± 0.35，大約為遲緩期的10.5倍，pfs為7.22±0.06，為遲緩期的7.2倍，均在穩(wěn)定期開始下降。

圖7 高齲株不同生長時期LuxS基因、pfs基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平Figure 7 mRNA transcription levels of LuxS gene and pfs gene in different growth stages of high caries strains

表3 變異鏈球菌高齲株不同生長時期LuxS、pfs基因表達量（，n=3）Table 3 LuxS and pfs gene expressions of high caries strains of Streptococcus mutans at different growth stages（，n=3）

表3 變異鏈球菌高齲株不同生長時期LuxS、pfs基因表達量（，n=3）Table 3 LuxS and pfs gene expressions of high caries strains of Streptococcus mutans at different growth stages（，n=3）

3 討論

兒童齲病是一項全球性的健康問題，患病率從23%到90%不等[15]，變異鏈球菌作為首要的致齲菌[16]，與多種細菌一起定植在口腔牙菌斑生物膜內(nèi)，在兒童齲病中發(fā)揮重要作用。變異鏈球菌不同菌株間生長特性略有差異。在體外非應(yīng)激條件下，不同齲敏感兒童口腔變異鏈球菌與UA159 標準株的生長周期基本相似，均有遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期。高齲株與標準株生長速度相近，明顯快于中齲株和無齲株（P＜0.05）。說明在相同基因型不同齲敏感性的變異鏈球菌中，致齲敏感性高的變異鏈球菌，生長繁殖速度較快。

以哈維弧菌BB170作為報告菌株檢測不同齲敏感兒童口腔變異鏈球菌臨床分離株AI-2的表達情況，結(jié)果致齲敏感性越高的變異鏈球菌株，產(chǎn)生的AI-2 越多，說明密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控變異鏈球菌致齲能力，然而具體是通過何種機制進行識別和調(diào)控目前還尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，AI-2 可誘導(dǎo)變異鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase,GTF）的表達，GTF 所合成的非水溶性葡聚糖是變異鏈球菌致齲的主要毒力因子之一[17-18]。因此我們推測本實驗中高齲株產(chǎn)生的AI-2更多可能是與GTF表達更多有關(guān)。

在對許多細菌密度感應(yīng)系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，胞外AI-2 的活性在對數(shù)中晚期達到峰值，在穩(wěn)定期開始下降[19]。如曹素芳在奶牛隱性乳房炎大腸桿菌AI-2的研究結(jié)果表明，從對數(shù)中期開始細菌開始大量表達AI-2，到對數(shù)后期達到高峰，為陰性對照的12 倍[20]。在本實驗中，高齲株在整個生長時期均有AI-2 產(chǎn)生，在對數(shù)后期生成的AI-2 達到最高峰。與上述的研究是相符的。AI-2在穩(wěn)定期開始下降可能是因為變異鏈球菌生長繁殖的過程中，胞外AI-2 不斷增加，當積累到一定程度，細菌周圍的AI-2 可能會發(fā)生內(nèi)化作用，從而參與調(diào)控某些重要功能[21]。目前研究較為清楚的是弧菌、大腸桿菌和沙門氏菌的AI-2信號分子的傳遞及內(nèi)化途徑。而有關(guān)變異鏈球菌的AI-2 的內(nèi)化途徑目前尚不清楚。

已知LuxS基因在細菌中高度保守，信號分子AI-2的合成途徑也高度保守[22]，是以pfs蛋白和LuxS蛋白催化底物S-腺苷高半胱氨酸酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）合成的。也有研究利用純化表達的LuxS 蛋白和pfs 蛋白在體外成功合成了具有生物活性的變異鏈球菌的AI-2 信號分子，證實了兩種酶的生物學(xué)活性[23]。本實驗為了研究變異鏈球菌產(chǎn)生的AI-2 信號分子與LuxS、pfs基因轉(zhuǎn)錄水平間的關(guān)系，檢測了變異鏈球菌高齲株在不同生長時期的LuxS基因和pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)AI-2產(chǎn)生水平與LuxS轉(zhuǎn)錄水平具有高度相關(guān)性，而與pfs轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性相對略低，結(jié)果與白灝等[24]在禽致病性大腸桿菌的AI-2 產(chǎn)生水平與LuxS基因的轉(zhuǎn)錄水平具有高度相關(guān)性的研究保持一致。推測原因可能是LuxS是直接合成AI-2的酶，可直接與S-核苷高半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine，SRH）底物發(fā)生反應(yīng)，直接反應(yīng)了LuxS的轉(zhuǎn)錄水平，而pfs 是在底物SAH 的作用下生成SRH，然后間接形成AI-2，在這過程中可能與細胞的代謝狀態(tài)有關(guān)，也有可能本身pfs的表達相對較低，具體機制仍需進一步研究。目前齲病致病性生物膜中微生物間相互作用機制尚不明確[25]，因此深入研究AI-2 信號通路有助于進一步研究牙菌斑生物膜的形成，發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)系統(tǒng)與變異鏈球菌致齲性基因的關(guān)系，為齲病的防治找到新的方向。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同齲敏感性兒童口腔變異鏈球菌臨床分離株均能產(chǎn)生信號分子AI-2，致齲敏感性越高的菌株AI-2 產(chǎn)量越高。而該高齲株在不同生長時期AI-2 的生成與LuxS、pfs基因相關(guān)，且與LuxS基因的相關(guān)性更高。本結(jié)論可為進一步研究群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控變異鏈球菌致病性的具體機制提供參考。

（利益沖突：無）