異落新婦苷通過調節(jié)NLRP3炎癥小體和NF-κB信號通路減輕尿酸鈉誘導的小鼠急性痛風性關節(jié)炎機制研究

姚燕箐 汪焱 徐文靜 吳晨曦 楚秉泉 夏道宗

浙江中醫(yī)藥大學藥學院 杭州 310053

急性痛風性關節(jié)炎歸屬中醫(yī)的 “痹病”“歷節(jié)風”范疇，最早的相關記載可追溯至《黃帝內經(jīng)》中的“痹癥”，《名醫(yī)別錄》中陶弘景首次將其命名為“痛風”[1]，該名稱沿用至今。急性痛風性關節(jié)炎的發(fā)生主要與體內嘌呤代謝水平變化，造成尿酸排出減少或生成增多有關，過多的尿酸鹽晶體沉積在關節(jié)內，會引起關節(jié)部位病變，產生炎癥反應[2]。近年來隨著社會的不斷發(fā)展進步，人們的生活習慣和飲食方式也發(fā)生著變化，急性痛風性關節(jié)炎的患病率大大增高。

研究表明，急性痛風性關節(jié)炎的發(fā)病機制與機體代謝、炎癥反應和免疫應答密切相關[3]。NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎癥小體和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路在炎癥進程中被激活，使得下游的白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等炎癥因子釋放，放大炎癥級聯(lián)反應[4]。

目前臨床上應用于急性痛風性關節(jié)炎的藥物主要包括非甾體類抗炎藥、秋水仙堿等，不良反應較多，對胃腸道及肝腎功能均有影響，存在一定的用藥局限性[5]。因此，開發(fā)一種安全有效的藥物，對于急性痛風性關節(jié)炎的治療具有重要意義?，F(xiàn)代基礎研究證實，中藥治療急性痛風性關節(jié)炎具有一定的療效[6-8]。異落新婦苷（isoastilbin，IA）是一種主要存在于土茯苓、黃芪等中藥中的二氫黃酮醇苷類化合物，本課題組研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗氧化活性，且在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的小鼠單核巨噬細胞白血病炎癥模型中展現(xiàn)出了抗炎能力[9]。本研究基于NLRP3炎癥小體和NF-κB信號通路，探討IA對小鼠急性痛風性關節(jié)炎的作用及機制，為急性痛風性關節(jié)炎的新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級C57BL/6小鼠75只，7～8周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012]。

1.1.2 主要試劑 尿酸鈉（monosodium urate，MSU）購于美國Sigma-Aldrich公司（批號：BC8R7559）；秋水仙堿購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司（批號：G1514018）；二喹 啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司（批號：50206）；鼠IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購于美國eBioscience公司（批號：151906029、153149017、161044013）；β-actin、NF-κB抑制蛋白激酶α（inhibitor of nuclear factor-κB kinase α，IKKα）、Phospho-IKKα、NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of nuclear factor-κB α，IκBα）、Phospho-IκBα、Phospho-NF-κB p65、NF-κB p65、NLRP3、Histone H3抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司（批號：15、5、19、10、18、16、9、3、9）；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1）、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis associated speck like protein containing a CARD，ASC）抗體均購于美國Abcam公司（批號：GR202191-1、2813878）。

1.1.3 主要儀器 BSA224S-CW型電子天平購于賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；MagNA Lyser勻漿器購于德國Roche公司；Mini-PROTEAN Tetra System垂直電泳系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司；Power Blotter XL半干轉膜儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司；Odyssey Clx雙色紅外激光成像系統(tǒng)購于美國LI-COR公司；C13210-01數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)為日本濱松公司產品；Synergy H1型多功能微孔板檢測儀購于美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物的制備和配制 土茯苓購于浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司，鑒定后按本課題組前期研究方法自制IA，提取的IA符合指紋圖譜質控要求[9]。MSU粉末過200目篩后，精密稱取250 mg，加入純水5 mL，配成50 mg·mL-1的MSU混懸液，4℃保存，臨用前超聲混勻。精密稱取IA樣品250 mg，加入0.5%的羧甲基纖維素鈉 （sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液5 mL，配成50 mg·mL-1的單體溶液，4℃保存。 根據(jù)小鼠體質量，以0.9%氯化鈉溶液稀釋到所需濃度。精密稱取秋水仙堿250 mg，加入純水5 mL，配成50 mg·mL-1的秋水仙堿溶液，4℃保存，臨用時稀釋到所需濃度。

1.2.2 實驗分組及給藥 小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為5組，每組15只，分別為正常組、模型組、秋水仙堿組、IA低劑量組、IA高劑量組，正常組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液，秋水仙堿組給予秋水仙堿溶液（1 mg·kg-1），IA低、 高劑量組分別給予相應劑量（25、50 mg·kg-1）的IA溶液，連續(xù)灌胃7 d。

1.2.3 建立小鼠急性痛風性關節(jié)炎模型 第6天灌胃后1 h，用無菌微針吸取0.025 mL的MSU混懸液，注射至除正常組外其他4組小鼠的踝關節(jié)中，注射后可以觀察到小鼠踝關節(jié)對側明顯鼓起，正常組注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.4 測量小鼠踝關節(jié)腫脹度 造模前在小鼠踝關節(jié)上方0.5 cm處用不褪色的記號筆標記一條橫線，后續(xù)測量時以橫線為準，造模前及造模后2、4、6、10、24 h分別用課題組自制足趾容積測量裝置[10]測量小鼠足趾容積，并按下列公式計算小鼠踝關節(jié)腫脹率。踝關節(jié)腫脹率（%）=（造模后足趾容積-造模前足趾容積）/造模前足趾容積×100%

1.2.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察IA對小鼠急性痛風性關節(jié)炎踝關節(jié)炎性浸潤的影響 取材時從小鼠踝關節(jié)上方劃線處剪下關節(jié)，固定于甲醛中，固定完成后脫鈣，送樣進行切片、HE染色，采用數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)進行拍片。

1.2.6 ELISA檢測小鼠踝關節(jié)組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平 稱取關節(jié)質量，按照1∶10（g·mL-1）的比例加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），以勻漿器研碎，完全研碎后4℃下3 000 r/min離心10 min，收集上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測炎癥因子水平。

1.2.7 免疫印跡法檢測相關蛋白表達 將關節(jié)剪碎放入研缽中，加適量液氮研磨，研磨完全后稱取質量，按照1:10（g·mL-1）的比例加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的放射免疫沉淀（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液，冰上裂解1 h后4℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液，用BCA試劑盒進行蛋白定量。電泳完成后，轉至二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封閉1 h后加入一抗4℃孵育過夜，次日加入二抗孵育1 h，用Odyssey Clx雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠踝關節(jié)腫脹率比較 造模后2 h，除正常組外，其余各組小鼠踝關節(jié)均明顯腫脹，表明急性痛風性關節(jié)炎模型造模成功，各組踝關節(jié)腫脹率均在造模后4 h時達到最大值，4 h后腫脹率逐漸降低。與正常組比較，模型組小鼠踝關節(jié)腫脹率在造模2～24 h內顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，秋水仙堿組造模2～24 h內踝關節(jié)腫脹率均顯著降低 （P＜0.01），IA低、高劑量組造模2～24 h內踝關節(jié)腫脹率均顯著降低（P＜0.01）。與秋水仙堿組比較，IA低劑量組造模2～24 h內踝關節(jié)腫脹率均顯著升高（P＜0.01），IA高劑量組造模4～10 h內踝關節(jié)腫脹率均顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01），而2、24 h時踝關節(jié)腫脹率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與IA低劑量組比較，IA高劑量組造模2～24 h內踝關節(jié)腫脹率均顯著降低（P＜0.01）。見表1。表明IA能緩解MSU引起的小鼠踝關節(jié)腫脹，且高劑量組減輕踝關節(jié)腫脹率的效果與秋水仙堿組類似。

表1 各組小鼠踝關節(jié)腫脹率比較Tab.1 Comparison of ankle joint swelling rate in each group(±s,n=15)

表1 各組小鼠踝關節(jié)腫脹率比較Tab.1 Comparison of ankle joint swelling rate in each group(±s,n=15)

注：與正常組比較， **P＜0.01；與模型組比較， ##P＜0.01；與秋水仙堿組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與IA低劑量組比較，▲▲P＜0.01。Note:Compared with normal group,**P＜0.01;compared with model group,##P＜0.01;compared with colchicine group, △P＜0.05, △△P＜0.01;compared with IA low dose group, ▲▲P＜0.01.

組別 2 h 4 h 6 h 10 h 24 h正常組 38.83±2.99 49.86±3.50 38.62±3.36 27.27±4.02 15.16±3.62模型組 70.02±3.14** 91.31±4.98** 69.42±6.63** 58.32±6.62** 44.78±5.85**秋水仙堿組 49.85±4.16## 69.25±5.04## 48.40±6.22## 36.85±4.95## 21.68±4.30##IA 低劑量組 59.93±5.37##△△ 81.61±9.47##△△ 57.30±6.26##△△ 47.74±7.75##△△ 34.98±6.39##△△IA 高劑量組 52.18±5.48##▲▲ 58.36±2.53##△△▲▲ 42.21±6.56##△▲▲ 30.62±5.47##△▲▲ 18.24±4.87##▲▲

2.2 各組小鼠踝關節(jié)炎性浸潤比較 正常組小鼠踝關節(jié)幾乎未見炎癥發(fā)生；模型組踝關節(jié)組織內有大量炎性細胞浸潤，表明小鼠踝關節(jié)內發(fā)生了較強的炎癥反應，秋水仙堿組炎性浸潤情況較輕，IA各劑量組隨給藥劑量增加，炎性浸潤情況減輕，但減輕程度不如秋水仙堿組，表明IA可以減輕MSU誘導的小鼠踝關節(jié)炎性浸潤現(xiàn)象，但與秋水仙堿組比較效果較差。見圖1。

圖1 各組小鼠踝關節(jié)病理形態(tài)學觀察（HE染色，100×）Fig.1 Pathomorphology observation of ankle joint in each group（HE staining， 100×）

2.3 各組小鼠踝關節(jié)組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 與正常組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，秋水仙堿組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯降低（P＜0.01）；IA低、高劑量組IL-6、TNF-α水平均明顯降低（P＜0.01），IA低劑量組IL-1β的水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），IA高劑量組IL-1β水平明顯降低（P＜0.01）。與秋水仙堿組比較，IA低劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高 （P＜0.01）；IA高劑量組TNF-α水平升高（P＜0.01）， 但IL-1β、IL-6的水平與秋水仙堿組類似，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與IA低劑量組比較，IA高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2。表明IA能夠劑量依賴性地降低MSU誘導的急性痛風性關節(jié)炎小鼠踝關節(jié)分泌的炎癥因子水平，具有一定的抗炎作用。

圖2 各組小鼠踝關節(jié)中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較Fig.2 Comparison of level of IL-1β， IL-6 and TNF-α of ankle joint in each group

2.4 各組小鼠踝關節(jié)組織中NLRP3炎癥小體相關蛋白表達比較 與正常組比較，模型組小鼠踝關節(jié)組織中的NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達顯著增高（P＜0.01）。與模型組比較，秋水仙堿組和IA低、高劑量組蛋白表達量顯著降低（P＜0.01），且IA高劑量組比低劑量組降低更多（P＜0.01）。與秋水仙堿組比較，IA低劑量組NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達量均升高（P＜0.05，P＜0.01），IA高劑量組NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達量均減低（P＜0.01）。 見圖3。

圖3 各組小鼠踝關節(jié)中NLRP3炎癥小體相關蛋白表達比較Fig.3 Comparison of expression of NLRP3 inflammasome protein of ankle joint in each group

2.5 各組小鼠踝關節(jié)組織中NF-κB信號通路相關蛋白表達比較 與正常組比較，模型組小鼠踝關節(jié)組織中的p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα、p-IKKα/IKKα蛋白表達比例均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，秋水仙堿組和IA低、高劑量組蛋白表達比例顯著降低（P＜0.01），且IA高劑量組比低劑量組降低更多（P＜0.01）。 與秋水仙堿組比較，IA低劑量組p-IκBα/IκBα、p-IκBα/Iκκα蛋白表達比例均升高（P＜0.01）、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達比例降低 （P＜0.01），IA高劑量組p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα、p-IKKα/IKKα蛋白表達比例均降低（P＜0.01）。 見圖4。

圖4 各組小鼠踝關節(jié)中NF-κB信號通路相關蛋白表達比較Fig.4 Comparison of expression of NF-κB signaling pathway related protein of ankle joint in each group

2.6 各組小鼠踝關節(jié)組織中NF-κB p65蛋白入核比較 與正常組比較，模型組細胞核內p-NF-κB蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組和IA低、高劑量組細胞核內p-NF-κB蛋白表達均顯著降低（P＜0.01），且IA高劑量組比低劑量組降低更多（P＜0.01）。與秋水仙堿組比較，IA低劑量組細胞核內p-NF-κB蛋白表達升高（P＜0.01），IA高劑量組細胞核內p-NF-κB蛋白表達降低（P＜0.01）。 各組胞質內p-NF-κB/NF-κB蛋白表達之比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見圖5。

圖5 各組小鼠踝關節(jié)組織中NF-κB p65蛋白入核比較Fig.5 Comparison of NF-κB p65 protein of ankle joint entered into nucleus in each group

3 討論

急性痛風性關節(jié)炎的發(fā)生主要與嘌呤代謝紊亂、尿酸鹽沉積于關節(jié)有關，在臨床上多辨證為濕熱蘊結型，患者在飲食方面不節(jié)制，嗜食膏脂厚味，致使?jié)駸釡诮?jīng)絡，氣血不暢，導致關節(jié)紅腫熱痛[11]。中醫(yī)認為，有關痛風，脾腎虧虛是其病機關鍵；濕、痰、淤是其基本病機；飲食、情志、寒濕是相關致病因素，治療應以化濕逐瘀祛痰為主，用藥可選土茯苓等[12]。土茯苓是一味常用的中藥材，為百合科植物光葉菝葜（Smilax glabra Roxb.）的干燥根莖，其味甘、淡，性平，歸肝、胃經(jīng)，具有解毒祛濕、通利關節(jié)的作用[13]。IA作為落新婦苷的同分異構體，在土茯苓中廣泛存在[14]，但IA干預急性痛風性關節(jié)炎的相關報道較少，作用機制尚未完全明確。

MSU作為損傷相關的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）被人體固有免疫細胞細胞膜上的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR）識別后，人體啟動免疫應答，經(jīng)細胞內一系列信號轉導， 激活NLRP3、IL-1β、IL-18、TNF-α等炎癥因子表達，從而誘導炎癥反應[15]。NOD樣受體是PRR家族中能感知細胞內病原性信號的一族胞質型PRR，NLRP3是其中的重要成員，NLRP3與ASC及caspase-1組成分子量約700 kDa的NLRP3炎癥小體，激活IL-1β轉化酶，將效應蛋白caspase-1催化為有活性的p20和p10兩個亞單位，參與IL-1β和IL-18的加工、分泌，誘導細胞發(fā)生炎癥壞死[16]。本研究參考Reber等[17]的急性痛風性關節(jié)炎造模方法，利用微針在踝關節(jié)一側注射MSU混懸液，并在對側踝關節(jié)處注射等體積PBS作為對照，成功建立了小鼠急性痛風性關節(jié)炎模型。本研究發(fā)現(xiàn)，IA能夠明顯下調由MSU誘導的NLRP3、caspase-1、ASC蛋白的表達，并降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平，說明IA可以通過下調NLRP3炎癥小體相關蛋白，抑制下游IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌，減輕急性痛風性關節(jié)炎的相關癥狀。

急性痛風性關節(jié)炎發(fā)生時，NF-κB信號通路被激活。NF-κB由Rel蛋白二聚體組成，在Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）與DAMPs或病原相關的分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）結合后，與髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的羧基末端相互作用，使MyD88活化，隨后募集κB激酶的抑制劑IKK，IKK被激活后，抑制蛋白IκB被磷酸化及泛素化，NF-κB隨即從p50/p65/IκB異源三聚體中解離出來，轉位至細胞核內，與核內脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）上的特異序列結合，增強炎癥相關基因的轉錄，在調節(jié)炎癥因子釋放過程中起到關鍵的作用[18]。本研究結果表明，在C57BL/6小鼠中，MSU誘導可以激活NF-κB信號通路，從而促進pro-IL-1β的釋放。低、高劑量的IA和秋水仙堿均能夠顯著抑制NF-κB信號通路的激活，減少pro-IL-1β的釋放。NF-κB信號通路與NLRP3炎癥小體同時被抑制，下游炎癥因子的分泌減少，從而能夠減輕急性痛風性關節(jié)炎的癥狀。與常用抗痛風藥物秋水仙堿比較，IA在減輕小鼠關節(jié)腫脹度和炎性浸潤、降低炎癥因子分泌水平、降低NLRP3炎癥小體及NF-κB信號通路相關蛋白表達方面的效果類似，同時不良反應可能更小。

綜上所述，本研究證明IA通過同時抑制NLRP3炎癥小體和NF-κB信號通路，抑制下游相關炎癥因子的釋放，從而能夠減輕急性痛風性關節(jié)炎的癥狀，為臨床上治療急性痛風性關節(jié)炎提供了新的思路。