揚輻麥系列新品系赤霉病抗性鑒定與評價

劉建鳳， 何震天， 張 容， 王建華， 韓 燕， 范德佳， 王汝琴， 陳士強

(江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所，江蘇揚州 225007)

小麥赤霉病(Fusarium head blight，簡稱FHB)是一種世界范圍內常見的小麥病害，也是我國小麥生產(chǎn)上的嚴重病害之一。小麥赤霉病一般發(fā)生年份可減產(chǎn)10%～30%，嚴重發(fā)生年份損失可達80%，局部甚至顆粒無收。小麥赤霉病發(fā)生以揚花期侵染為主，在連續(xù)陰雨且氣溫在15 ℃以上時，赤霉菌侵染小麥穗部小花，在籽粒灌漿成熟過程中沿穗軸迅速擴展，并在小麥籽粒中產(chǎn)生和積聚多種毒素，造成小麥嚴重減產(chǎn)、品質降低及食品安全問題。小麥赤霉病的流行主要受田間菌源量、揚花期氣溫和降水情況以及主栽品種赤霉病抗性等多個因素影響。近年來，受全球氣候變化、輪作制度的增加、秸稈全量還田不到位和赤霉病菌對藥劑的抗性上升等多種影響，小麥赤霉病的防控日趨嚴峻。到目前為止，赤霉病仍然是可防不可治，一旦發(fā)病將無法控制，只能采取預防措施。采用栽培措施和藥劑防治方法雖取得了一定的防治效果，但均未能從根本上解決小麥赤霉病危害，尤其抽穗期噴灑農藥后會造成麥粒的藥殘和環(huán)境污染，也與綠色生產(chǎn)相違背。因此，開展抗赤霉病育種，從根本上控制赤霉病的危害，對確保小麥安全生產(chǎn)意義重大。

眾多研究表明，小麥赤霉病抗性主要分為抗侵染(typeⅠ)、抗擴展(typeⅡ)、抗DON積累(typeⅢ)、籽粒抗性(typeⅣ)等多種類型，且赤霉病抗性為多基因控制的數(shù)量遺傳性狀。目前已從普通小麥及其近緣種屬中鑒定出250多個抗赤霉病QTL，但僅有7個主效抗赤霉病基因得到精準定位，即～，其中、、、、是抗擴展類型，、是抗侵染類型。是目前抗性最穩(wěn)定、最強、應用最廣泛的抗赤霉病基因，可以顯著降低赤霉病嚴重度和減輕毒素積聚。李楠楠等對周麥品種(系)材料進行基因分子檢測的結果顯示，攜帶基因和不攜帶基因材料之間赤霉病抗性差異極顯著，表明基因分子標記可用于改良周麥品種的赤霉病抗性。張宏軍等對中抗赤霉病且具有基因的品種與高感赤霉病的矮敗周麥16雜交和回交的后代進行基因功能標記選擇，研究表明攜帶的后代家系整體抗性達到中感水平。由此可見，近年來科研和育種單位抗赤霉病育種的力度不斷加強。

輻射誘變育種是創(chuàng)制和豐富小麥種質資源的有效途徑，對提高小麥產(chǎn)量、增強抗性、改善品質等方面均具有重要的意義。我國在利用輻射誘變或雜交與輻射誘變相結合方式選育耐赤霉病品種方面取得了很多成果，寧麥3號是江蘇省農業(yè)科學院1968年利用輻射誘變育成的耐赤霉病的小麥品種，用它作為抗性親本，獲得了多個耐赤霉病的“寧麥”系列品種；揚麥158是江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所1993年通過雜交與輻射誘變相結合的方法育成的高產(chǎn)中抗赤霉病且農藝性狀優(yōu)良的小麥品種，該品種是長江中下游地區(qū)歷史上種植面積和覆蓋率最大的小麥品種之一。揚輻麥是江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所通過輻射誘變或雜交與輻射誘變相結合方式選育的系列小麥品種(系)，先后育成15個小麥品種，其中2008年育成的超高產(chǎn)小麥揚輻麥4號先后作為農業(yè)農村部主體品種、江蘇省主推品種、江蘇好品種，推廣應用近133.33萬hm，種植面積一直處于江蘇淮南麥區(qū)小麥品種前列。

明確近年來培育的揚輻麥系列新品系的赤霉病抗性水平，是篩選和鑒定集高產(chǎn)多抗于一體的揚輻麥系列新品種(系)的關鍵。本研究通過人工接種方法對揚輻麥新品系進行赤霉病抗性鑒定，同時利用抗赤霉病主效基因緊密連鎖的分子標記對抗性較好的品系進行分子檢測，以期篩選出抗性較好的目標品系，加速揚輻麥的抗赤霉病育種，同時也為開展抗性基因定位與克隆研究提供可利用的抗病種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以341個揚輻麥系列中間品系為試驗材料，選用赤霉病不同抗性水平的蘇麥3號、揚麥158、揚麥15、安農8455作為抗病、中抗、中感、感病對照，由江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所提供。

供試禾谷鐮刀菌菌液及病麥粒由江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所陳懷谷研究員及江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所張勇研究員提供，包括F0301、F0609、F0980、F1126等4種高致病力赤霉菌株。

1.2 試驗設計

試驗材料于2020年秋播時種植于江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所萬?；卦囼炋?，在小麥赤霉病土表接種鑒定圃和單花滴注接種鑒定圃各種植1套。試驗田人工開溝，每份材料種植2行，行長 1 m，行距25 cm，株距5 cm，每隔50個試驗材料設對照品種，病圃土壤肥力中等，前茬為水稻，鑒定圃的管理措施如施肥、除草、害蟲防治等同常規(guī)育種田。

1.3 赤霉病抗性鑒定與評價

接種方法：參考張彬等的方法，用供試的小麥赤霉病混合菌種病麥粒和孢子懸浮液對供試品種分別進行土表接種和單花滴注接種。土表接種是將病麥粒于小麥抽穗前1個月(2021年3月11日)均勻撒于鑒定圃，接種量為4 kg/667 m，接種后定期采用自動彌霧噴水裝置保持土壤水分，利于子囊殼形成，誘導發(fā)病；單花滴注接種法于試驗材料揚花初期(2021年4月8—15日)，用注射器吸取 5 μL 孢子懸浮液注入麥穗自上而下第5小穗的任意1個小花中，孢子懸浮液的濃度為10倍×10倍顯微鏡視野下約30個游離孢子，每個材料接種20個單穗，接種后設立自動彌霧噴水裝置人工保濕，噴霧3～4次/d，每次5 min左右，保證田間濕度利于病害的發(fā)生。

抗性評價方法：在小麥乳熟中后期，以蘇麥3號為抗病對照，揚麥158為中抗對照，揚麥15為中感對照，安農8455為感病對照，參照中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T 2954—2016《小麥區(qū)域試驗品種抗赤霉病鑒定技術規(guī)程》和張曉軍等的方法調查和記載各試驗材料的發(fā)病程度，每份材料隨機抽取15個麥穗。(1)土表接種，待病情發(fā)展基本穩(wěn)定時，調查其病情嚴重度級別。分級標準：0級，無發(fā)病小穗；1級，發(fā)病小穗占全穗1/4以下；2級，發(fā)病小穗占全穗1/4～1/2；3級，發(fā)病小穗占全穗1/2～3/4；4級，發(fā)病小穗占全穗3/4以上。計算病穗率和病情指數(shù)()：病穗率=發(fā)病穗數(shù)/總調查穗數(shù)×100%；病情指數(shù)()=∑(各病級穗數(shù)×相應病級數(shù))/(最高病級數(shù)×總調查穗數(shù))×100。(2)單花滴注接種，接種25 d后開始調查接種穗的病情嚴重度及病小穗數(shù)。分級標準：0級，接種小穗無可見發(fā)病癥狀；1級，僅接種小穗或相鄰的個別小穗發(fā)病，穗軸不發(fā)??；2級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗占全穗1/4以下；3級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗占全穗 1/4～1/2；4級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗占全穗1/2以上。計算各品系的嚴重度和病小穗率(percentage of diseased spikelet，簡稱PDS)：平均嚴重度()=∑(各病級穗數(shù)×相應病級數(shù))/總調查穗數(shù)；病小穗率()=病小穗數(shù)/總小穗數(shù)×100%?？剐栽u價以對照品種為基準，劃分為免疫(I)、抗(R)、中抗(MR)、中感(MS)、感(S)品種?？紤]基因型和環(huán)境綜合影響，參照對照品種的表現(xiàn)進行抗性分級，評價標準見表1。

表1 小麥赤霉病抗性劃分標準

1.4 Fhb1基因的檢測

對經(jīng)單花滴注接種鑒定為中抗赤霉病的品系，于其幼苗期，采集新鮮嫩葉片1 g左右，采用北京索萊寶科技有限公司提供的植物基因組DNA提取試劑盒提取葉片基因組DNA，具體操作步驟參考說明書。采用引物TaHRC-F/TaHRC-R進行基因鑒定，引物序列為TaHRC-F：5′-A T T C C T A C T A G C C G C C T G G T-3′，TaHRC-R：5′-G C C A A T C A G G T T C T G A G G C A T T T T A-3′。利用南京諾唯贊生物科技有限公司的GreenMix進行PCR擴增，PCR體系總體積為10 μL，其中GreenMix為5 μL，正反向引物各1 μL，DNA為0.5 μL，ddHO補足至 10 μL。引物PCR的具體程序：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性15 s，64 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。最終用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，抗病材料擴增片段大小為 1.4 kb，感病材料擴增片段大小為2 kb，以蘇麥3號為陽性對照，將位點呈抗病基因型的品種記為“*”。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 揚輻麥新品系的赤霉病抗性

由表2可知，土表接種條件下，抗病對照品種蘇麥3號病穗率均值為17%，中抗對照品種揚麥158病穗率均值為53%，中感對照品種揚麥15的病穗率均值為66%，感病對照品種安農8455的病穗率均值為78%；單花滴注條件下，抗病對照品種蘇麥3號嚴重度均值為1.37，中抗對照品種揚麥158嚴重度均值為2.01，中感對照品種揚麥15的嚴重度均值為3.11，感病對照品種安農8455的嚴重度均值為3.82，說明本年度揚輻麥新品系的抗性鑒定均為有效試驗。

表2 人工接種條件下對照品種的赤霉病試驗結果

由表3可知，采用土表接種法鑒定，341個揚輻麥新品系材料中，沒有篩選到對赤霉病抗病(R)的品系，表現(xiàn)中抗(MR)的品系有69個，占供試品系的20.2%；中感(MS)的品系248個，占供試品系的72.7%；感病(S)的品系24個，占供試品系的7.1%。采用單花滴注接種鑒定，341個揚輻麥新品系材料中，沒有篩選到對赤霉病擴展抗病(R)的品系，表現(xiàn)中抗(MR)的品系有49個，占供試品系總數(shù)的14.4%；中感(MS)的品系241個，占供試品系總數(shù)的70.6%；感病(S)的品系51個，占供試品系總數(shù)的15.0%。鑒定結果表明，土表接種和單花滴注接種都沒有鑒定到赤霉病抗性達R的揚輻麥新品系，達MR的品系有14.4%～20.2%，達MS的品系70.6%～72.7%，可見MS以上的品系占比85.0%～92.9%，表明揚輻麥新品系對赤霉病抗性水平較好。

表3 揚輻麥新品系的赤霉病抗性水平

2.2 Fhb1基因的分子標記檢測結果

對49個經(jīng)單花滴注接種鑒定為中抗赤霉病的小麥品系，進行赤霉病抗性基因的標記診斷鑒定，部分PCR產(chǎn)物的電泳結果見圖1。對結果進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，抗病對照蘇麥3號、7個揚輻麥新品系攜有基因，中抗對照揚麥158、中感對照揚麥15、感病對照安農8455及其他42個揚輻麥新品系未檢測到基因(表4)。7個攜基因品系的病小穗率在15.1%～17.1%，嚴重度在1.8～2.0，與中抗對照揚麥158病小穗率(20.4%)及嚴重度(2.01)差異明顯。由此可見，攜基因揚輻麥新品系的赤霉病抗性水平明顯高于中抗對照品種揚麥158。

表4 經(jīng)單花滴注接種鑒定為MR品系Fhb1基因的檢測結果

3 討論與結論

近年來，隨著氣候、環(huán)境、耕作方式等變化，小麥赤霉病的流行速度與危害程度不斷增加。江蘇省地處黃淮海地區(qū)，在小麥生長期常高溫多雨，在溫濕環(huán)境下，極易暴發(fā)小麥赤霉病，一旦暴發(fā)不僅會影響小麥的產(chǎn)量，且產(chǎn)生和累積多種毒素，導致小麥品質降低，造成食品安全問題，危害人畜健康。鑒于此，江蘇省小麥品種審定時對赤霉病抗性提出了更高的要求，淮南麥區(qū)的小麥品種必須對赤霉病達到中抗及以上才能進行品種審定，否則小麥品種審定中一票否決?？梢姡x育和推廣適合該麥區(qū)種植的赤霉病抗性小麥品種尤為重要。

小麥赤霉病抗感表型的準確鑒定對資源的表型評價、基因精細定位和克隆、抗性機制解析研究及培育抗病品種等非常關鍵。土表接種和單花滴注接種是表型鑒定小麥赤霉病抗性最常用的方法，張煜等采用土表接種結合單花滴注接種的方法對黃淮南部762個小麥品種(系)的赤霉病抗性進行鑒定，篩選出10個穩(wěn)定的中抗赤霉病小麥品種(系)。張彬等采用土表接種和單花滴注接種對黃淮南片麥區(qū)的65個主栽小麥品種進行了赤霉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)黃淮南片主栽小麥品種的赤霉病抗性普遍較差。本研究采用土表接種和單花滴注接種對341個經(jīng)過輻射誘變技術育成的新品系分別進行赤霉病抗性鑒定，土表接種鑒定發(fā)現(xiàn)69個品系表現(xiàn)為中抗赤霉病，單花滴注接種鑒定發(fā)現(xiàn)49個品系表現(xiàn)為中抗赤霉病，且有7個品系含有基因，這為小麥抗赤霉病育種提供了重要的遺傳材料。

小麥赤霉病是由多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳機制復雜，如何減小菌源多寡及溫濕度等環(huán)境因素的影響，實現(xiàn)準確鑒定比較困難。為了提高赤霉病鑒定的準確性，將人工接種與自然感病調查相結合，對高世代的品系可連續(xù)多年和安排到異地穿梭進行多點鑒定，再結合分子標記技術輔助進行選擇。從筆者所在課題組對小麥赤霉病抗性鑒定多年的結果看，抗性較好的小麥材料，往往植株較高、麥穗較長、小穗密度較低、小穗數(shù)較少、籽粒較小，這些性狀于小麥的豐產(chǎn)相悖。因此，在小麥抗赤霉病育種及抗性種質創(chuàng)制中，可通過輻射誘變或雜交與輻射誘變相結合，采用田間和人工赤霉病抗性篩選、分子標記輔助選擇及農藝性狀選擇的三者有機結合，培育產(chǎn)量性狀優(yōu)良的抗性品種。

本研究的鑒定結果表明，經(jīng)過輻射誘變或雜交與輻射誘變相結合育種技術選育的341個新品系中，沒有品系達到R級赤霉病抗性，說明 R級的小麥品系極其稀少，與相關研究的結果一致。土表接種鑒定抗性達到MR級的品系有69個，占試驗材料的20.2%；單花滴注接種鑒定抗性達到MR級的品系有49個，占試驗材料的14.4%，其中有7個品系含有基因。由此可見，揚輻麥新品系對赤霉病抗性水平較好，可以嘗試從這些MR級材料中篩選赤霉病抗性好的新種質，挖掘抗赤霉病其他基因，也可從中篩選出豐產(chǎn)性、綜合性狀好的品種。表明利用輻射誘變或雜交與輻射誘變相結合技術進行小麥育種，能夠獲得赤霉病抗性好的新種質、新材料，是小麥抗赤霉病育種中切實有效的選育方法。