Klotho 蛋白抑制POCD 老年大鼠腦組織及小膠質(zhì)細胞中FGF23/NF-κB p65 的表達

段海霞，王翀鶴，王慶輝，姜萬維*，黃學洙*

1.大連大學附屬中山醫(yī)院麻醉科，遼寧 大連 116001；2.延邊大學附屬醫(yī)院麻醉科，吉林 延吉 133002

術(shù)后認知功能障礙(Post-operative cognitive dysfunction,POCD)是指麻醉和手術(shù)后認知功能損傷，特別是學習和記憶，嚴重時可導致人格變化[1]。POCD 多發(fā)生于老年人，是術(shù)后的主要神經(jīng)并發(fā)癥，根據(jù)患者認知功能障礙的嚴重程度對患者的生活質(zhì)量、社會獨立性和死亡率均造成不同程度影響。衰老被認為是POCD 的獨立危險因素，國際POCD 研究(ISPOCD)得出的結(jié)論，六十歲以上的患者術(shù)后7 d 內(nèi)發(fā)生POCD 的概率約為26%，術(shù)后90 d 內(nèi)發(fā)生POCD的概率約為10%[2]。麻醉和手術(shù)刺激炎癥因子大量分泌是引起POCD 的另一項重要因素。七氟醚作為一種臨床麻醉吸入性藥物，廣泛應用于各個年齡段的擇期手術(shù)患者。然而，有證據(jù)表明，七氟醚可誘導POCD 的發(fā)生[3]。也有研究證實了七氟醚在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應和凋亡中的促進作用，這與POCD 的發(fā)生密切相關(guān)[4]。klotho 又名克老素，是一種具有多效性的抗衰老基因。沉默klotho 基因的小鼠出現(xiàn)與人相似的早衰癥狀，包括多器官衰竭、認知障礙和壽命縮短[5]。klotho 能編碼一種I 型跨膜蛋白，該蛋白在大腦脈絡(luò)膜叢和腎小管上皮中高表達，具有較大的胞外結(jié)構(gòu)域和較短的胞內(nèi)部分。在分泌酶處理過程中，Klotho 蛋白可被分裂成細胞外和細胞內(nèi)的形式[6]。游離的Klotho 蛋白被釋放到腦脊液和血液中，發(fā)揮強大的抗氧化活性。一些研究已經(jīng)報道了Klotho 蛋白在細胞中的抗炎作用，以及Klotho 的缺乏與慢性阻塞性肺疾病和腎損傷中炎癥反應之間的關(guān)聯(lián)[7]。本研究探討了Klotho 蛋白在POCD 老年大鼠腦組織及小膠質(zhì)細胞中的潛在作用，為臨床POCD 的防治尋找新的靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組與處理

本研究涉及動物實驗經(jīng)我校動物保健與使用委員會批準（YB.No20210622S030）。SPF 清潔級雄性SD 大鼠（20 個月齡，體重400±50g）飲食飲水充足，并在室溫（22 ℃）下飼養(yǎng)，每天光照12 h。POCD 大鼠模型的建立方法如下[9]，將大鼠隨機分為control組，七氟醚麻醉組（sevo組）、七氟醚麻醉手術(shù)組（sevo+surgery組），每組15 只。sevo+surgery組大鼠先用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定于腦立體定位儀（美國stoelting 公司），配合氣體麻醉適配器（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），佩戴動物專用通氣面罩，以4%七氟醚和2 L/min O2維持麻醉，經(jīng)腹部正中做3 cm 切口，進行腹腔探查術(shù)，術(shù)后置于麻醉誘導箱，以麻醉通氣流量2 L/min，4%七氟醚持續(xù)吸入3 h。sevo組大鼠不行手術(shù)，直接置于麻醉誘導箱，以麻醉通氣流量2 L/min，4% 七氟醚持續(xù)吸入3 h。control組同樣不予腹腔探查，直接置入麻醉誘導箱中，以空氣/氧氣混合通氣3 h。

1.2 細胞培養(yǎng)

小膠質(zhì)細胞（BV2）購自于豐暉生物（湖南;貨號CL-0493），置于盛有DMEM（Thermo）和10% FBS（Biowest）、1%鏈霉素和青霉素的培養(yǎng)皿，37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。POCD 環(huán)境的誘導采用了Jeong[10]研究中描述的方法，BV2 細胞以1×105/孔的密度鋪于六孔板中，用1 μg/mL LPS 處理6 h 后，再用1 μg/mL Klotho（R&D 公司）孵育細胞24 h，隨后立即將六孔板置于麻醉誘導室中，暴露于含30% O2、70%氮氣、4%七氟醚中1 h。

1.3 水迷宮

大鼠經(jīng)七氟醚麻醉結(jié)束后24 h，進行Morris 水迷宮（型號：DigBehv001，購自上海吉量軟件科技有限公司）檢驗其認知功能狀態(tài)。水迷宮共劃分為4 個象限，可在任意象內(nèi)設(shè)置隱蔽平臺，我們將平臺設(shè)置在第3 象限，然后隨機將大鼠從任意象限放入恒溫水中，記錄大鼠120 s 內(nèi)尋找水上平臺時間(即逃避潛伏期) 。大鼠從4 個象限依次入水訓練，每次訓練時間間隔15 min，并記錄4 d 內(nèi)的逃避潛伏期。第5 天行空間記憶檢測，即在撤去平臺的情況下記錄大鼠在被隨意放入象限內(nèi)，60 s 內(nèi)的穿越平臺次數(shù)及第三象限停留時間占比。

1.4 HE 染色

處死大鼠前，我們予以大鼠3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射，并進行心臟灌流。灌流結(jié)束后即刻在冰浴上將大鼠斷頭，于枕骨大孔處分離皮膚暴露頭骨至雙側(cè)眼部，骨鉗剝離頭骨，逐步小心將大腦取出，注意在取出腦組織前應剪斷視神經(jīng)。用神經(jīng)剝離子鈍性分離覆蓋在海馬上方的大腦皮層，可見大鼠海馬組織，小心取出后立即放入4%多聚甲醛固定液中完全浸入。記錄編號后，將組織置于4 ℃冰箱內(nèi)避光妥善保存，固定約48 h。固定后進行包埋、切片，對組織切片脫蠟、脫水后予以蘇木素和伊紅染色，再次脫水后封片，并使用玻片掃描儀（購自廣州淶鉑銳科技股份有限公司）進行拍攝。

1.5 TUNEL 凋亡檢測

TUNEL 凋亡檢測試劑盒購自于碧云天。組織切片脫蠟水化后，滴加200 μL 蛋白酶K 室溫下孵育10 min，PBS 清洗后，加入TUNEL 反應液室溫下孵育1 h，PBS 再次清洗，加入50 μL Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min，PBS 洗后滴加DAB 顯色液反應10 min，PBS 再次清洗后進行蘇木素復染，最后脫水、透明并封片，使用玻片掃描儀進行拍攝。

1.6 ELISA

根據(jù)ELISA 試劑盒（R&D）說明書的步驟，依次檢測大鼠海馬組織上清液和小膠質(zhì)細胞BV2 中IL-1β、TNF-α、IL-6的含量，并通過標準曲線計算其濃度。

1.7 Western blot

將大鼠海馬組織蛋白裂解或BV2 細胞蛋白收集后測定蛋白濃度。每個泳道加入等量對應樣本蛋白并啟動電泳儀。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)到pvdf 膜上，進行封閉，再加入稀釋的一抗(OX-42、Klotho、FGF23、Phospho-NF-κB P65、NF-κB P65、p-IκBα、IκBα、GAPDH) 4 ℃過夜。洗膜后加入相應二抗再次孵育，再次洗膜后利用發(fā)光劑進行凝膠成像。

1.8 細胞免疫熒光染色

將細胞以1×105/孔密度均勻鋪于6 孔板中，予以LPS、Klotho 重組蛋白、七氟醚處理后，用4%多聚甲醛固定，用1%牛血清白蛋白（albumin）封閉30 min，然后首先用抗NF-κB p65 抗體在4 ℃下染色過夜。隨后，將BV2 細胞與AlexaFluor 488 偶聯(lián)的Ⅱ抗在室溫下孵育2 h。最后，染DAPI并在顯微鏡下觀察拍照。

1.9 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 9.1.2 進行數(shù)據(jù)分析與作圖，所有數(shù)據(jù)均采用表示，組間對比使用t 檢驗，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮評價POCD 老年大鼠認知功能

為驗證POCD 大鼠模型的建立，我們采用Morris水迷宮試驗檢測了老年大鼠的認知功能。顯然，與control組相比，sevo組和sevo+surgery組的大鼠逃逸潛伏期延長，在目標象限的時間縮短（均P＜0.01，圖1A-C）。同時，該兩組的大鼠平臺穿越次數(shù)顯著下降（P＜0.01，圖1D）。其中，sevo+surgery組較sevo組大鼠在目標象限停留的時間更短（P＜0.05，圖1C）。這些結(jié)果表明，七氟醚處理的大鼠表現(xiàn)出明顯認知功能受損，而手術(shù)則可能加重老年大鼠的POCD。

2.2 POCD 老年大鼠腦組織病理及炎性因子改變

觀察大鼠海馬組織形態(tài)學變化，如圖2A 所示，control組大鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元細胞整齊排列，細胞形態(tài)大小正常，細胞核清晰，細胞分布密集且規(guī)則，由于大鼠衰老，可偶見神經(jīng)元細胞核深染。sevo組大鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元細胞雖然排列較為整齊，但大量細胞體大、變形，已經(jīng)受損。行剖腹探查大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元細胞受損更為明顯，細胞密度下降且排列無規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)不清晰，細胞核深染。在大鼠海馬組織CA1 區(qū)的TUNEL 染色中我們發(fā)現(xiàn)，control組僅有少量TUNLE 染色陽性細胞，為細胞生理性死亡，sevo組部分細胞呈現(xiàn)TUNLE 染色陽性細胞，而sevo+surgery組大鼠海馬組織中有大量TUNLE染色陽性的凋亡細胞，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色（圖2B）。此外，我們用ELISA 方法檢測了兩組大鼠海馬組織上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達水平。圖2C 結(jié)果表明，與control組大鼠相比，sevo組和sevo+surgery組大鼠海馬組織上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達水平明顯升高（P＜0.01），其中，sevo+surgery組較sevo組各炎癥指標升高更顯著（P＜0.05）。

圖2 大鼠體內(nèi)炎癥因子及病理組織變化A: HE 染色觀察大鼠海馬CA1 區(qū)組織病理學改變B:大鼠海馬CA1 區(qū)TUNEL 染色C: ELISA 法測定大鼠海馬組織上清液中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表達**P＜0.01，與control組相比 #P＜0.05，與sevo組相比Fig.2 Inflammatory cytokines and pathological changes in ratsA: HE staining was used to observe the histopathological changes in hippocampal CA1 region of rats; B: TUNEL staining of hippocampal CA1 region of rats; C: The expressions of IL-β、TNF-α and IL-6 in the supernatant of rat hippocampal tissue were determined by ELISA;**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs sevo group

2.3 POCD 老年大鼠腦組織內(nèi)Klotho/FGF23/NF-κB表達情況

使用western blot 方法對大鼠海馬組織進行檢測。首先評估了POCD 老年大鼠海馬組織中小膠質(zhì)細胞的激活，如圖3A 和3B 所示，sevo組和sevo+surgery組小膠質(zhì)細胞激活特異性標志物OX-42 的表達較control組明顯升高（P＜0.01）,且sevo+surgery組比sevo組OX-42 蛋白表達更顯著（P＜0.05）。此 外，在 對POCD 老年大鼠海馬組織Klotho/FGF23/NF-κB 信號軸蛋白的檢測中發(fā)現(xiàn)，與control組大鼠相比，sevo組和sevo+surgery組的大鼠海馬組織中Klotho 蛋白表達明顯減低（P＜0.01），而FGF23 蛋白以及IκBα、NF-κB p65 的磷酸化表達顯著升高（P＜0.01）。與sevo組比較，sevo+surgery組的大鼠海馬組織中Klotho 蛋白表達更低（P＜0.05），而FGF23 蛋白和IκBα 的磷酸化則表達更高（P＜0.05），見圖3。

圖3 大鼠海馬組織中Klotho/FGF23/NF-κB 通路蛋白表達A,B: Western blot 檢測大鼠海馬OX-42 的表達 C,D : Western blot 檢測大鼠海馬Klotho、FGF23、IκBα 和NF-κB 的表達 *P＜0.05,**P＜0.01，與control組比較 #P＜0.05，與sevo組比較Fig.3 The expression of Klotho/FGF23/NF-κB pathway protein in rat hippocampusA,B: Western blot was used to detect the expression of OX-42 in hippocampus of rat; C,D: Western blot was used to detect the expression of Klotho,FGF23,IκBα and NF-κB in hippocampus of rat;*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs sevo group

2.4 Klotho 蛋白通過抑制FGF23/NF-κB 降低小膠質(zhì)細胞中炎癥因子表達

為了檢測POCD 條件下小膠質(zhì)細胞中促炎細胞因子表達的影響，我們使用ELISA 檢測了TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達水平。如圖4A 所示，經(jīng)LPS 和七氟醚誘導后，BV2 細胞中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達顯著增加(P＜0.01)。然而，Klotho 處理后抑制了POCD 條件下BV2 細胞中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達。此外，我們檢測了BV2 細胞FGF23 蛋白和NF-κB p65 的磷酸化表達水平，圖4B 和4C 可見，經(jīng)LPS 和七氟醚誘導后，F(xiàn)GF23 蛋白和NF-κB p65 的磷酸化表達明顯升高（P＜0.01），而Klotho蛋白可以抑制FGF23蛋白和NFκB p65 的磷酸化的表達。此外，我們在BV2 細胞的免疫熒光檢測中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS 和七氟醚誘導后的BV2 細胞明顯活化，p65 的磷酸化明顯上調(diào)且出現(xiàn)核內(nèi)表達，而經(jīng)Klotho處理后p65在BV2核內(nèi)表達顯著降低。

圖4 Klotho 處理的BV2 細胞中炎癥因子及FGF23/NF-κB 信號通路蛋白的表達A: ELISA 法測定BV2 細胞中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表達 B,C: Western blot 檢測BV2 細胞中FGF23、IκBα 和NFκB p65 的表達 D:免疫熒光法檢測BV2 細胞中NF-κB p65 的表達 **P＜0.01，與control組比較 ##P＜0.01，與LPS+sevo 相比較Fig.4 Expression of inflammatory cytokines and FGF23/NF-κB signaling pathway proteins in Klothotreated BV2 cellsA: The expressions of IL-β、TNF-α and IL-6 in BV2 cells determined by ELISA; B,C: Western blot was used to detect the expression of FGF23,IκBα and NF-κB p65 in BV2 cells; D: The expression of NF-κB p65 in BV2 cells detected by immunofluorescence;**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs LPS+sevo group

3 討論

POCD 是老年患者術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一。麻醉后，手術(shù)引起組織損傷刺激外周免疫系統(tǒng)激活，外周免疫細胞可參與海馬體的炎癥反應，導致細胞因子級聯(lián)和炎癥介質(zhì)的釋放，引起POCD。研究表明，吸入麻醉促進動物模型中神經(jīng)元細胞凋亡，降低學習能力和記憶[11]。七氟醚是一種吸入性麻醉劑，具有芳香氣味和對呼吸道刺激較小的特點。既往研究表明，使用七氟醚麻醉的患者術(shù)中病情穩(wěn)定，術(shù)后可迅速恢復，大大縮短了手術(shù)時間，改善了患者的鎮(zhèn)痛效果[12]。然而，近年來，七氟醚被認為是POCD 的誘導因子[1]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)單獨行七氟醚麻醉以及七氟醚麻醉后行剖腹探查的POCD 老年大鼠均表現(xiàn)出認知功能的顯著降低。除此之外，我們進一步證實了在使用七氟醚麻醉后行剖腹探查的POCD 老年大鼠體內(nèi)炎癥明顯加重。已經(jīng)有研究證實了炎癥反應和細胞凋亡參與了POCD 的發(fā)病機制，F(xiàn)an 等人[4]發(fā)現(xiàn)，七氟醚誘導后，POCD 兒童患者血清中caspase-3、TNF-α 和IL-6 水平顯著升高。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，予以七氟醚麻醉后老年大鼠海馬組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α 和IL-6 表達明顯上調(diào)，且七氟醚麻醉后行剖腹探查術(shù)的老年大鼠炎癥因子表達更高。此外，七氟醚麻醉后行剖腹探查術(shù)的老年大鼠海馬組織切片HE 染色和TUNEL 染色表明海馬區(qū)神經(jīng)元細胞嚴重受損，排列稀疏且無規(guī)則，并出現(xiàn)大量凋亡，這與阿爾茨海默癥大鼠海馬組織染色結(jié)果幾乎一致[13]。綜上說明七氟醚可以誘導老年大鼠發(fā)生POCD,而剖腹探查術(shù)則加重了老年大鼠發(fā)生POCD 的程度。

Klotho 是一種抗衰老基因，其表達隨著年齡的增長而下降，提示其在衰老相關(guān)疾病的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。成纖維細胞生長因子FGF23 作為調(diào)節(jié)礦物質(zhì)離子及維生素D 穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵激素，其受體FGFR 可與Klotho 相結(jié)合，Klotho 同時通過D3 結(jié)構(gòu)域連接FGFR1c，通過c-末端尾部連接FGF23，形成由Klotho的脫落胞外域、FGFR1c 配體結(jié)合域和FGF23組成的三元復合物參與體內(nèi)多種調(diào)節(jié)[14]。Guo[15]等人研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF23 通過激活NADPH 氧化酶觸發(fā)ROS 的產(chǎn)生并誘導NF-κB p65 磷酸化。此外，Klotho 還是一種抗炎調(diào)節(jié)因子，通過負調(diào)控NF-κB 減少促炎基因轉(zhuǎn)導。NF-κB 是一種與免疫球蛋白基因中啟動子調(diào)控區(qū)域結(jié)合的核因子。NF-κB 對與年齡相關(guān)的內(nèi)皮氧化還原變化敏感，可激活促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄，進一步抑制內(nèi)皮功能，在老年人內(nèi)皮細胞中形成炎癥和氧化應激的惡性循環(huán)。研究表明，外源性Klotho 可防止內(nèi)皮細胞氧化應激和衰老，這種抗炎抗衰老作用似乎與Klotho 防止NF-κB 核易位有關(guān)[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)，七氟醚麻醉以及七氟醚麻醉后行剖腹探查的POCD 老年大鼠腦組織中Klotho 蛋白的表達明顯下調(diào)，而FGF23 表達明顯上調(diào)，IκBα 和NF-κB p65 磷酸化表達增加。雖然七氟醚及手術(shù)損傷如何影響大鼠腦部海馬組織中Klotho 的蛋白含量仍不清楚，但有研究表明七氟醚可通過聚集免疫細胞透過血腦屏障[4]。因此，我們探究了腦組織中最重要的免疫細胞——小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)，OX-42 蛋白是小膠質(zhì)細胞活化的標志蛋白，在靜息狀態(tài)下幾乎沒有陽性表達，而本研究中發(fā)現(xiàn)，七氟醚麻醉以及七氟醚麻醉后行剖腹探查的POCD 老年大鼠腦組織中OX-42 蛋白的表達顯著升高，表明七氟醚和手術(shù)的刺激明顯激活了老年大鼠腦組織中的小膠質(zhì)細胞。

巨噬細胞是先天免疫的關(guān)鍵介質(zhì)，全麻術(shù)后激活的巨噬細胞可浸潤腦實質(zhì)，誘導小膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)炎癥。由此導致的促炎細胞因子表達的增加，尤其是在海馬體內(nèi)，最終導致認知功能障礙[17]。Zhou[18]等人發(fā)現(xiàn)，與野生型缺血性腦損傷小鼠相比，Klotho 基因過表達的小鼠腦損傷顯著減輕，而慢病毒敲減Klotho 基因的小鼠缺血性腦損傷癥狀顯著加重。此外，Klotho 過表達顯著抑制腦缺血后炎癥反應，表現(xiàn)為抑制膠質(zhì)細胞過度活化，抑制RIG-I/NF-κB 信號激活，抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生[19]。為進一步探究Klotho 對FGF23/NF-κB 的調(diào)控作用，同時為模擬臨床麻醉術(shù)后發(fā)生POCD 的情況，我們用LPS 處理BV2 小膠質(zhì)細胞誘導炎癥狀態(tài)，并用吸入麻醉劑七氟醚誘導細胞POCD 環(huán)境。本研究顯示，在LPS 處理和七氟醚暴露后，BV2 細胞中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達顯著增加，提示POCD 因這些促炎細胞因子的過量產(chǎn)生而加重，Klotho 蛋白處理降低了POCD 條件下TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達，提示Klotho 可能是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護劑，以對抗手術(shù)引起的炎癥損傷。此外，LPS 和七氟醚暴露誘導POCD 后，F(xiàn)GF23 的表達明顯升高，IκBα 和NF-κB p65 磷酸化增加，而Klotho 處理后，抑制了BV2 細胞中FGF23 的表達以及IκBα、NFκB p65 的磷酸化。以上結(jié)果表明，Klotho 可能通過抑制FGF23/NF-κB 信號通路蛋白的表達，抑制促炎細胞因子并緩解細胞損傷，最終改善老年大鼠的術(shù)后認知功能障礙。

總之，Klotho 在POCD 老年大鼠海馬組織中明顯降低，且顯著緩解LPS 和七氟醚誘導的小膠質(zhì)細胞損傷，降低小膠質(zhì)細胞中炎癥因子釋放，其作用機制可能與阻滯FGF23/NF-κB 信號通路蛋白的表達有關(guān)。因此，Klotho 可能為臨床老年人POCD 的治療提供新的方向。