p-mTOR、p-4EBP1 及p-S6K1 在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

曹李，陳鵬，李丁昌，董光龍*

1.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071；2.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心普通外科醫(yī)學(xué)部，北京 00853

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)生發(fā)展是多種因素參與、多階段演進(jìn)的極其復(fù)雜的生物學(xué)過程[1,2]，其中基因組的不穩(wěn)定、遺傳學(xué)組件改變等因素可導(dǎo)致其蛋白翻譯異常，出現(xiàn)增殖失控而致癌。已知信息不足以充分描述其生物學(xué)特征及解釋所涉及的分子信號通路。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種高度保守并廣泛表達(dá)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，為磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶家族的一員，是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要樞紐，是細(xì)胞生長和增殖的重要調(diào)節(jié)因子。mTOR 信號通路異常激活后具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡、促進(jìn)血管生成及促癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等作用[3]。mTOR 主要通過調(diào)節(jié)哺乳動物的蛋白質(zhì)翻譯過程發(fā)揮作用，真核細(xì)胞始動因子4E 結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）和核糖體S6 蛋白激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）作為mTOR 的直接底物，參與調(diào)控蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長、增殖、細(xì)胞代謝等反應(yīng)。mTOR 激活后可使4EBP1 和S6K1 蛋白磷酸化而表現(xiàn)出不同的生物功能[4]。磷酸化后的4EBP1 失去與真核細(xì)胞翻譯啟動因子（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）結(jié)合的能力而無法抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)；磷酸化后的S6K1 可使核糖體S6 蛋白激活，增加含嘧啶序列mRNA 的翻譯能力，表達(dá)的蛋白常是一些核糖體蛋白和翻譯調(diào)節(jié)蛋白?？梢姡?EBP1對細(xì)胞的生長起到負(fù)向調(diào)節(jié)的作用；而S6K1 對細(xì)胞的生長起到正向調(diào)節(jié)的作用[5]。隨著mTOR/4EBP1/S6K1 信號傳導(dǎo)通路在胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等惡性腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展過程中作用機制報道的增多，p-mTOR 及其下游分子p-4EBP1 和p-S6K1 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的情況及意義值得進(jìn)一步探討和證實。結(jié)直腸癌病理類型以腺癌最為多見，排除其他及特殊類型結(jié)直腸癌，本研究運用免疫組織化學(xué)方法探索pmTOR 及其下游分子p-4EBP1 和p-S6K1 在結(jié)直腸腺癌腫瘤組織及腫瘤旁組織中的表達(dá)情況及三者之間可能存在的聯(lián)系，分析其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，為了解其在結(jié)直腸腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及影響提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗標(biāo)本 選用2013年10月至2018年8月就診于中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)院普通外科行結(jié)直腸癌根治術(shù)患者的結(jié)直腸癌組織石蠟包埋標(biāo)本60例及癌旁正常組織（腫瘤邊緣2 cm）40例。

1.1.2 入組及排除標(biāo)準(zhǔn) 入組標(biāo)準(zhǔn)：①具有完整的病歷資料；②術(shù)前未經(jīng)新輔助放、化療；③經(jīng)手術(shù)治療、病理證實為結(jié)直腸腺癌、留有完整組織標(biāo)本；④未合并其他惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病歷資料不完善；②術(shù)前經(jīng)任何其他治療，可能影響客觀條件者；③合并其他惡性腫瘤；④標(biāo)本組織少或家屬要求保留標(biāo)本者。

1.1.3 臨床病理資料 入組60例結(jié)直腸腺癌患者，其中男性38例，女性22例，年齡32～82 歲，中位年齡61.5 歲；右半結(jié)腸腺癌5例，左半結(jié)腸腺癌20例，直腸腺癌35例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例；臨床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期25例，Ⅳ期0例；低分化10例，高中分化50例；大體分型：隆起型23例，潰瘍型20例，浸潤型17例，均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗檢測 應(yīng)用MaxVision 法分別檢測結(jié)直腸腺癌及癌旁組織標(biāo)本中p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1 的表達(dá)情況。本次實驗標(biāo)本均經(jīng)過甲醛固定液固定，75%、85%、95%酒精充分脫水，透明，浸蠟，并常規(guī)石蠟包埋。嚴(yán)格按照說明書操作，以0.01 mol/L 的PBS 替代一抗作為陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)，并設(shè)立為對照組；陽性標(biāo)準(zhǔn)為鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)或／和細(xì)胞核中出現(xiàn)棕色顆粒。

1.2.2 結(jié)果判定 由2 名高年資病理科醫(yī)師采用雙盲法各自判讀，參照Naoki 法：陽性細(xì)胞數(shù)0 為（-）；0～20%為（±）；20%～80%為（+）；＞80%為（++），（-）和（±）為陰性，（+）和（++）為陽性。不一致結(jié)果經(jīng)商討得出統(tǒng)一結(jié)論。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗所有數(shù)據(jù)采用SPSS25.0 軟件進(jìn)行處理。以頻數(shù)表示計數(shù)資料，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示計量資料，各組間的陽性率比較采用四格表卡方（2）檢驗，各組間陽性率的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析檢驗，以α=0.05 為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-mTOR 的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系

p-mTOR 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況見圖1。其表達(dá)陽性呈現(xiàn)棕色，主要定位于細(xì)胞漿。在結(jié)直腸腺癌組織中p-mTOR 的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在高中分化及低分化結(jié)直腸腺癌組織中mTOR 蛋白表達(dá)陽性率分別為46.00%（23/50）和80.00%（8/10），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在TNM 分期中，Ⅰ～Ⅱ期結(jié)直腸腺癌組織中mTOR 蛋白的表達(dá)陽性率為37.14%（13/35）；Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸腺癌組織中mTOR 蛋白的表達(dá)陽性率為72.00%（18/25），兩組差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中mTOR 蛋白表達(dá)陽性率分別為69.57%（16/23）和40.54%（15/37），兩組差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 p-mTOR 的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Expression of p-mTOR and its relationship with clinicopathological features

圖1 p-mTOR 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況A：癌旁正常組織 p-mTOR 陰性 B：癌旁正常組織 p-mTOR 陽性 C：結(jié)直腸腺癌組織 p-mTOR 陰性 D：結(jié)直腸腺癌組織p-mTOR 陽性Fig.1 Expression of p-mTOR in mucosal tissues and adjacent normal tissues of colorectal adenocarcinomaA: normal adjacent tissue,p-mTOR negative； B: normal adjacent tissue,p-mTOR positive；C: colorectal adenocarcinoma tissue,p-mTOR negative；D: colorectal adenocarcinoma tissue,p-mTOR positive

2.2 p-4EBP1 的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系

p-4EBP1 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織及癌旁正常組織表達(dá)情況見圖2。陽性表達(dá)呈棕色，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。在結(jié)直腸腺癌組織中p-4EBP1 的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而p-4EBP1 的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、分化程度等未見相關(guān)，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 p-4EBP1 的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Expression of p-4EBP1 and its relationship with clinicopathological features

圖2 p-4EBP1 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織及癌旁正常組織表達(dá)情況A：癌旁正常組織p-4EBP1 陰性 B：癌旁正常組織p-4EBP1 陽性 C：結(jié)直腸腺癌組織p-4EBP1 陰性 D：結(jié)直腸腺癌組織p-4EBP1 陽性Fig.2 Expression of p-4EBP1 in mucosal tissues and adjacent normal tissues of colorectal adenocarcinomaA: normal adjacent tissue,p-4EBP1 negative；B: normal adjacent tissue,p-4EBP1 positive； C: colorectal adenocarcinoma tissue,p-4EBP1 negative；D:colorectal adenocarcinoma tissue,p-4EBP1 positive

2.3 p-S6K1 的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系

p-S6K1 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織及癌旁正常組織表達(dá)情況見圖3。陽性表達(dá)呈棕色，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。在結(jié)直腸腺癌組織中p-S6K1 的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在高中分化結(jié)直腸腺癌組織中S6K1 蛋白表達(dá)陽性率明顯高于低分化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在TNM 分期中，Ⅰ～Ⅱ期結(jié)直腸腺癌組織中p-S6K1 表達(dá)陽性率為45.71%（16/35）；Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸腺癌組織中p-S6K1 表達(dá)陽性率為72.00%（18/25），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

圖3 p-S6K1 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織及癌旁正常組織表達(dá)情況A：癌旁正常組織 p-S6K1 陰性 B：癌旁正常組織 p-S6K1 陽性 C：結(jié)直腸腺癌組織 p-S6K1 陰性 D：結(jié)直腸腺癌組織p-S6K1 陽性Fig.3 Expression of p-S6K1 in colorectal adenocarcinoma mucosal tissues and adjacent normal tissuesA: normal adjacent tissue,p-S6K1 negative； B: normal adjacent tissue,p-S6K1 positive；C: colorectal adenocarcinoma tissue,p-S6K1 negative；D: colorectal adenocarcinoma tissue,p-S6K1 positive

表3 p-S6K1 的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 Expression of p-S6K1 and its relationship with clinicopathological features

2.4 結(jié)直腸腺癌組織中p-mTOR、p-4EBP1 和p-S6K1三者表達(dá)的相關(guān)性分析

本實驗mTOR 蛋白表達(dá)陽性的31例結(jié)直腸腺癌粘膜組織中4EBP1 蛋白表達(dá)陽性的有19例；31例4EBP1 蛋白陰性表達(dá)的結(jié)直腸腺癌粘膜組織中mTOR 蛋白表達(dá)陰性的有19例，應(yīng)用SPSS 軟件中Spearman 秩相關(guān)系數(shù)分析計算，結(jié)果示它們之間的陽性表達(dá)有一定的正相關(guān)趨勢（r=0.268，P=0.038，P＜0.05）。31例mTOR 蛋白表達(dá)陽性結(jié)直腸腺癌粘膜組織中S6K1 蛋白表達(dá)陽性的有24例；26例S6K1 蛋白表達(dá)陰性結(jié)直腸腺癌粘膜組織中mTOR 蛋白表達(dá)陰性的有19例，應(yīng)用SPSS 軟件中Spearman 秩相關(guān)系數(shù)分析計算，結(jié)果示它們之間的陽性表達(dá)有明顯的正相關(guān)趨勢（r=0.433，P=0.001，P＜0.05）。見表4。在34例S6K1 蛋白表達(dá)陽性的結(jié)直腸腺癌粘膜組織中4EBP1蛋白表達(dá)陽性的有18例；在31例4EBP1 表達(dá)陰性的結(jié)直腸腺癌粘膜組織中S6K1 蛋白表達(dá)陰性的有15例，應(yīng)用SPSS 軟件中Spearman 秩相關(guān)系數(shù)分析計算，結(jié)果它們之間的表達(dá)無明顯的相關(guān)趨勢（r=0.105，P=0.423，P＞0.05）。見表5。

表4 p-mTOR 表達(dá)陽性的結(jié)直腸腺癌組中p-4EBP1 及p-S6K1 的表達(dá)情況及相關(guān)性分析Tab.4 Expression and correlation analysis of p-4EBP1 and p-S6K1 in colorectal adenocarcinoma group with positive p-mTOR expression

表5 p-4EBP1 表達(dá)陽性結(jié)直腸腺癌中p-S6K1的表達(dá)情況及相關(guān)性分析Tab.5 Expression and correlation analysis of p-S6K1 in colorectal adenocarcinoma with positive p-4EBP1 expression

3 討論

結(jié)直腸癌是世界第3 大惡性腫瘤，列于腫瘤致死性疾病的第4 位。多數(shù)結(jié)直腸癌被確診時已處于中晚期，淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移亦屬常見，治療以開腹或腹腔鏡等手術(shù)為主、放化療為輔助，但患者生存期改善有限，中位生存時間在20 個月左右[6]。目前結(jié)直腸癌的發(fā)病機制尚不明確，如何從基因?qū)用?，分子水平達(dá)到預(yù)防、治療甚至攻克癌癥是當(dāng)前的研究重點。PI3K/AKT/mTOR 信號通路為最新研究熱點之一[7,8]，該信號通路對多種良惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵的作用及影響[9,10]，如甲狀腺癌、乳腺癌、肺癌、胃結(jié)直腸癌、腎癌和宮頸癌等以及相關(guān)的良性腫瘤組織病變。mTOR 信號通路的活性主要由LKB1/AMPk/mTOR、PI3K/AKT/mTOR 和氨基酸通路這3 條信號通路調(diào)節(jié)[11～13]。

本實驗運用免疫組織化學(xué)方法研究p-mTOR 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，mTOR 蛋白在結(jié)直腸腺癌粘膜組織中表達(dá)的陽性率為56.67%，明顯高于癌旁正常粘膜組織的22.5%，二者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示mTOR 的過表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生有密切的聯(lián)系。mTOR 信號通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)樞紐，與結(jié)直腸癌的形成和進(jìn)展有緊密的聯(lián)系[11]。Slattery等人[14]將1574例患結(jié)腸癌病例與1940例對照組進(jìn)行病例對照分析，結(jié)果示mTOR 蛋白的過度表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生呈現(xiàn)顯著相關(guān)（OR=1.21，95% CI 為1.05～1.38）。王茜等[15]分析mTOR 蛋白在63例結(jié)直腸癌組織、27例轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織、12例轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)情況，得出結(jié)論p-mTOR 在結(jié)直腸癌及轉(zhuǎn)移癌組織中過表達(dá)可以作為結(jié)直腸癌病理分期及預(yù)后的重要指標(biāo)，且腫瘤組織中mTOR 蛋白表達(dá)陽性患者的PFS 及OS 均顯著低于腫瘤組織中mTOR 蛋白表達(dá)陰性的患者。趙長林等[16]探討分析60例直腸癌、30例直腸腺瘤、10例正常直腸粘膜組織中p-mTOR 表達(dá)情況，認(rèn)為mTOR 蛋白高表達(dá)在直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。以上研究證實mTOR 蛋白高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，甚至影響腫瘤細(xì)胞的浸潤與轉(zhuǎn)移。這也為mTOR 信號通路作為結(jié)直腸癌藥物治療靶點提供了更多的證據(jù)。

此外，本實驗分析p-mTOR 表達(dá)情況與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理資料之間的關(guān)系表明：p-mTOR 的表達(dá)與患者年齡、性別、腫物大小、腫瘤部位、浸潤深度無明顯相關(guān)性（P＞0.05）；而與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度有關(guān)（P＜0.05）。張毅等人[17]的研究也表明p-mTOR 的表達(dá)與直腸癌病人術(shù)前的CEA 水平、分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本次實驗結(jié)果示：p-mTOR在結(jié)直腸腺癌粘膜組織中陽性表達(dá)明顯高于癌旁組織，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因此p-mTOR 可能作為結(jié)直腸腺癌發(fā)病、轉(zhuǎn)移及評價腫瘤惡性程度的潛在參考指標(biāo)。

本實驗通過免疫組織化學(xué)法檢測p-4EBP1 在結(jié)直腸腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：其在結(jié)直腸腺癌粘膜組織中表達(dá)的陽性率為48.33%，高于癌旁正常組織的27.50%，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。張毅等人[17]的研究結(jié)論為：p-4EBP1 在直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)陽性率分別為79.00%和22.50%，二者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，與本結(jié)論一致。但p-4EBP1 的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、分化程度等未見相關(guān)，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這提示p-4EBP1 的表達(dá)情況尚不能作為提示結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移浸潤的可靠指標(biāo)，還需大量實驗進(jìn)一步證實。

本實驗通過免疫組織化學(xué)法檢測p-S6K1 在結(jié)直腸腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：p-S6K1 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織中表達(dá)的陽性率為56.67%明顯高于癌旁正常組織的35.00%，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其在分化程度越低的腫瘤組織中表達(dá)越高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這也與文獻(xiàn)報道的結(jié)果相一致[18,19]；且在腫瘤分期越晚的組織中表達(dá)越高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示p-S6K1 不僅可為腫瘤的診斷提供依據(jù)，還可指示腫瘤的惡性程度及進(jìn)展情況。但p-S6K1 的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移未見相關(guān)性，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其能否作為結(jié)直腸癌浸潤轉(zhuǎn)移的參考指標(biāo)尚缺乏可靠的理論依據(jù)。

本實驗組間相關(guān)性分析結(jié)果顯示：p-mTOR 與p-4EBP1 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織中的表達(dá)具有一定的正相關(guān)趨勢（r=0.268，P=0.038），提示二者在結(jié)直腸腺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能存在一定的協(xié)同作用。pmTOR 與p-S6K1 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織中的表達(dá)具有顯著的正相關(guān)性（r=0.433，P=0.001），提示二者可能在結(jié)直腸腺癌發(fā)生及分化程度上有重要的協(xié)同作用。p-4EBP1 和p-S6K1 在結(jié)直腸腺癌粘膜組織中的表達(dá)無相關(guān)性（r=0.105，P=0.423），亦未見明顯的相關(guān)趨勢，二者在結(jié)直腸腺癌發(fā)展過程中的相互關(guān)系還需大量數(shù)據(jù)進(jìn)一步探究。p-mTOR、p-4EBP1 和p-S6K1 三者的聯(lián)合檢測可能為結(jié)直腸腺癌的診斷及惡性程度評估提供一定的指向性[20]。