團(tuán)羽鐵線蕨HPLC-DAD指紋圖譜的建立與多種特征成分含量測定

王 宇，林 肯，肖 丹，高 源*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省印江縣新寨鎮(zhèn)衛(wèi)生院，貴州 銅仁 555200；3.貴州省食品檢驗檢測院，貴州 貴陽 550004)

團(tuán)羽鐵線蕨，又名豬鬃草，為鐵線蕨科Adiantaceae鐵線蕨屬Adiantum植物Adiantumcapillus-junonisRupr.的全草，為少數(shù)民族地區(qū)常用藥材，具有清熱利尿、潤肺止咳、補(bǔ)腎通絡(luò)的功效[1]，其廣布于全國多地，常見于貴州、云南、四川等地區(qū)[2]。常生長于海拔300～2500 m的濕潤石灰?guī)r壁石縫中、陰濕墻壁基部石縫中或蔭蔽濕潤的白堊土上。由于團(tuán)羽鐵線蕨藥材現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，藥材來源質(zhì)量控制不佳，《貴州中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)中未收錄能反映藥材質(zhì)量的化學(xué)成分整體輪廓的指紋圖譜[3]，且含量測定方法提取過程繁瑣，不能全面反映鐵線蕨藥材的質(zhì)量。因此，利用中藥指紋圖譜具整體性的特點，實現(xiàn)對中藥內(nèi)在化學(xué)成分的綜合評價和整體質(zhì)量的全面控制[4]。本研究利用指紋圖譜技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)分析，首次建立19個不同產(chǎn)地團(tuán)羽鐵線蕨藥材指紋圖譜與特征成分含量測定，并進(jìn)行方法學(xué)研究，為提高藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。本實驗指認(rèn)的槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸和山奈酚-3-O-蕓香糖苷屬于黃酮類物質(zhì)，黃酮類化合物在臨床上有抗氧化、抗突變等作用，可用于高血壓的輔助治療，有防止腦溢血、循環(huán)器官疾病的功效[5-8]。

1 材料與方法

1.1 儀器

試驗主要用到的儀器有電子天平(型號XS205DU；AL204)、超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(AISITI)、回流提取器(上海南陽儀器有限公司)、waters e2695 高效液相色譜儀(waters)、DAD 二極管陣列檢測器(waters)、Agilent ZORBAX SB-Aq C18 色譜柱(安捷倫科技有限公司)、Waters XSelect?T3 色譜柱(沃特世科技有限公司)、SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱。

1.2 試劑

實驗主要用到的試劑有甲醇、乙腈(GR，淮安科儀化玻有限公司)；甲酸、乙酸、磷酸(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸(成都普思生物科技股份有限公司，批號：MUST-19052825，純度：99.72%)；山奈酚-3-O-蕓香糖苷(成都普思生物科技股份有限公司，批號：MUST-19041507，純度：98.16%)。

1.3 藥材

實驗所用藥材來自不同省份的多個地區(qū)，部分為自行采集，部分為購買，詳見表1所示。

表1 團(tuán)羽鐵線蕨的來源Tab.1 Sourcesof Adiantum capillus-junonis Rupr.

1.4 方法

1.4.1色譜條件

色譜條件參照文獻(xiàn)記載[9]。

1.4.2樣品及對照品制備方法

供試品制備：稱取藥材樣本1 g置于錐形瓶，精確加入80%甲醇25 mL[10]，70 ℃條件下回流60 min，趁熱過濾，于80 ℃水浴揮發(fā)至6～7 mL，定容至10 mL，過0.45 μm的微孔濾膜，待用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：分別稱取槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸、山奈酚-3-O-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品25 mg于小燒杯內(nèi)，溶解轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，分別使用80%甲醇定容至刻度，配置成濃度約為0.1 mg/mL的混合溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜研究

2.1.1儀器精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考查及團(tuán)羽鐵線蕨HPLC方法完整性考查

取S15藥材供試品溶液進(jìn)樣測定，以10號峰為參照峰計算得精密度相對保留時間RSD值為0.02%～0.05%、穩(wěn)定性相對保留時間RSD值為0.05%～0.20%，重復(fù)性相對保留時間RSD值為0.05%～0.12%(均小于3%)，精密度相對峰面積RSD值為0.11%～2.95%、穩(wěn)定性相對峰面積RSD值為0.14%～2.85%、重復(fù)性相對峰面積RSD值為0.10%～2.98%(均小于3%)；采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)進(jìn)行相似度評價分析，設(shè)置時間窗寬度為0.1，可得相似度均達(dá)到0.99以上，精密度RSD值為0.23%、其余為0；顯示該方法儀器精密度、方法48小時穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。取S15藥材制備6份供試品溶液，將100%甲醇洗脫時間調(diào)整到100 min，其余洗脫梯度不變，進(jìn)樣量為20 uL，未見有峰洗脫出來，說明本HPLC方法完整。

2.1.2建立圖譜及特征峰指認(rèn)

以S19藥材圖譜為參照圖譜，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)，釆用平均數(shù)圖譜生成法和多點矯正的方式，整合19批樣本的指紋圖譜數(shù)據(jù)，生成19批團(tuán)羽鐵線蕨HPLC疊加圖譜與指紋對照圖譜(圖1、圖2)，可見團(tuán)羽鐵線蕨80%甲醇提取液有13個相同的共有峰，通過與對照品(圖3)比對，指認(rèn)出共有峰2個，分別為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸和山奈酚-3-O-蕓香糖苷，其余11個共有峰未被指認(rèn)出。通過疊加圖譜和指紋對照圖譜，可知19批次樣本的DAD指紋圖譜相似度范圍為0.558～0.901，平均值為0.756，RSD值為16.91%。以10號峰為參照峰，計算出19批次樣本的相對保留時間RSD值為0.11%～0.99%，相對峰面積RSD值較大。

圖1 19批團(tuán)羽鐵線蕨HPLC疊加圖譜(S1-S19)與對照圖譜(R)Fig.1 HPLC overlay atlas (S1-S19) and control atlas (R) of 19 batches of Adiantum capillus-junonis Rupr.

圖2 指紋對照圖譜Fig.2 Fingerprint control

圖3 槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸(a)和山奈酚-3-O-云香糖苷(b)的對照色譜圖Fig.3 contrast chromatogram of Quercetin-3-O-β-D-glucuronide (a) and Kaempferol-3-O-cloud carnosine (b)

2.1.3聚類分析

以10號峰為參照，以19批藥材中13個共有峰的相對峰面積為變量，標(biāo)準(zhǔn)化組成19×13階原始數(shù)據(jù)矩陣，通過SPSS 26軟件進(jìn)行聚類分析。利用組間連接法，以歐式距離作為樣品的測度[11]，結(jié)果見圖4，19批藥材可聚為3類，其中S1、S2為一類，S3-S6、S11聚為一類，其余批次藥材聚為一類。

圖4 19批團(tuán)羽鐵線蕨聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis of 19 batches of Adiantum capillus-junonis Rupr.

2.1.4主成分分析

主成分分析(PCA)方法是一種能夠從原始數(shù)據(jù)中提取出其共有特征的方法，通過構(gòu)建主成分因子可以體現(xiàn)樣本間相似性和原始數(shù)據(jù)對主成分因子的貢獻(xiàn)[11-12]。以10號峰為參照，以19批藥材樣品中13個共有峰的相對峰面積為變量進(jìn)行PCA分析，選擇3個主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為85.6%，說明模型預(yù)測良好。由PCA得分圖(圖5)顯示，19批藥材樣品可分為3類，S1、S2聚為一類，S3-S5、S11、S6聚為一類，其余產(chǎn)地聚為一類。

圖5 19批團(tuán)羽鐵線蕨PCA得分圖Fig.5 PCA score chart of 19 batches of Adiantum capillus-junonis Rupr.

2.1.5正交偏最小二乘法判別分析 (OPLS-DA)分析

不同產(chǎn)地的團(tuán)羽鐵線蕨藥材樣品集中在不同區(qū)域，19批藥材樣品可分為3組(圖6)，S1、S2聚為一組，S3-S5、S11、S6聚為一組，其余產(chǎn)地聚為一組，與PCA分析、聚類分析結(jié)果一致。OPLS-DA模型(圖7)中的擬合參數(shù)R2X=0.851，R2Y=0.966，模型預(yù)測參數(shù)(Q2)=0.903，均大于0.5，表明所建模型穩(wěn)定且預(yù)測能力較強(qiáng)。以模型變量投影(VIP)值為指標(biāo)對引起組間差異的成分進(jìn)行分析，篩選貢獻(xiàn)較大的8個變量(以VIP值>1為標(biāo)準(zhǔn))，從大到小依次為11號(VIP=1.20455)>8號(VIP=1.12766)>1號(VIP=1.11016)>3號(VIP=1.06954)>10號(VIP=1.05879)>7號(VIP=1.04475)>12號(VIP=1.03037)>6號(VIP=1.02963)，提示引起19批藥材樣品質(zhì)量差異的為上述8個成分[13]。

圖6 19批團(tuán)羽鐵線蕨OPLS-DA得分圖Fig.6 OPLS-DA score chart of 19 batches of Adiantum capillus-junonis Rupr.

圖7 19批團(tuán)羽鐵線蕨OPLS-DA模型中共有峰的VIP值Fig.7 VIP value of common peaks in OPLS-DA model of 19 batches of Adiantum capillus-junonis Rupr.

2.2 特征成分含量測定

2.2.1含量測定方法

在指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上，由于有部分產(chǎn)地特征成分分離度不足以滿足含量測定的要求，且指紋圖譜方法測試時間太長，不符合試驗經(jīng)濟(jì)學(xué)，故調(diào)整洗脫梯度為甲醇(A)-0.05磷酸水溶液(B)(0～30 min，30%～48%A)。

2.2.2專屬性考查

取空白溶液及供試品溶液進(jìn)樣測試，如圖8所示，空白溶液不干擾特征成分槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸、山奈酚-3-O-蕓香糖苷槲2個成分，說明方法專屬性良好。

2.2.3線性考查

進(jìn)樣分析并記錄2個成分的不同濃度峰面積。以X軸為對照品濃度，Y軸為峰面積進(jìn)行線性回歸計算。結(jié)果可得，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸在0.01100～0.2200 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y=724 515x-38 962，R2為0.997；山奈酚-3-O-蕓香糖苷槲在0.01017～0.2034 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y=806 074x-22 310，R2為0.998，表明對照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考查

取S15產(chǎn)地藥材進(jìn)樣測定，分別記錄2個成分的峰面積，并計算其RSD值，特征成分槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸、山奈酚-3-O-蕓香糖苷槲的精密度RSD值分別為1.81%、0.90%，穩(wěn)定性RSD值為1.39%、1.38%，重復(fù)性RSD值為2.39%、2.24%。結(jié)果表明，儀器精密度良好，48 h內(nèi)方法穩(wěn)定性，重復(fù)性良好。

2.2.5回收率考查

取S15產(chǎn)地藥材9份，每份0.5 g,分為三組，每一組的3份以80%、100%、120%比例分別加入槲皮素-3-0- β -D一吡喃葡糖苷酸、山奈酚-3-0-蕓香糖苷懈2種對照品，進(jìn)樣測試并記錄。結(jié)果顯示，槲皮素-3-0- β -D-吡喃葡糖苷酸、山奈酚-3-0-蕓香糖苷槲平均回收率分別為102.5%、95.1%，RSD值分別為1.60%、2.65%。符合《中國藥典》(2020版)四部中附錄(9101)分析方法驗證指導(dǎo)原則[14]，可用于鐵線蕨2種特征成分含量測定。

注：a為供試品圖譜;b為對照品圖譜;c為空白圖譜。圖8 團(tuán)羽鐵線蕨專屬性實驗Fig.8 Specificity experiment of Adiantum capillus-junonis Rupr.

2.2.6含量測定結(jié)果

分別精密稱定19批次藥材1 g，進(jìn)樣測試并記錄峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，記錄槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸和山奈酚-3-O-蕓香糖苷的含量，結(jié)果見表2，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸含量范圍為0.11～4.35 mg/g，山奈酚-3-O-蕓香糖苷量范圍為0.15～10.35 mg/g。

表2 樣品含量測定結(jié)果Tab.2 Determination of sample content

3 結(jié)論與討論

本文章主要研究了團(tuán)羽鐵線蕨化學(xué)指紋圖譜及特征成分含量測定。通過方法學(xué)考察，調(diào)整確定流動相梯度，得到了19批次不同產(chǎn)地團(tuán)羽鐵線蕨的HPLC-DAD指紋圖譜，并定量檢測槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸和山奈酚-3-O-蕓香糖苷兩個物質(zhì)的含量，本研究首次建立了團(tuán)羽鐵線蕨指紋圖譜與含量測定方法，實驗具有較大創(chuàng)新意義。

團(tuán)羽鐵線蕨在西南地區(qū)產(chǎn)地較多，藥材豐富，從結(jié)果中可以看出，西南地區(qū)云貴川三省產(chǎn)地團(tuán)羽鐵線蕨藥材HPLC-DAD指紋圖譜相似度較好，但其余各省相似度較差，說明團(tuán)羽鐵線蕨生長環(huán)境對其化學(xué)成分含量影響較大，西南地區(qū)特有的氣候、土壤環(huán)境使得團(tuán)羽鐵線蕨化學(xué)成分與其他省份差異較大，文獻(xiàn)研究也指出了西南地區(qū)的生物氣候環(huán)境非常適合于鐵線蕨的生長繁殖[2]。19個團(tuán)羽鐵線蕨產(chǎn)地數(shù)據(jù)顯示，共有峰相對保留時間RSD值較小，說明19批藥材團(tuán)羽鐵線蕨化學(xué)成分基本一致，但共有峰相對面積RSD值較大，其RSD值最高達(dá)131.61%，說明19批團(tuán)羽鐵線蕨成分含量差異較大，推測原因為：(1)團(tuán)羽鐵線蕨樣品本身化學(xué)成分的差異較大；(2)與樣品不同采摘期有關(guān)，本實驗樣品由藥材供應(yīng)商提供，無法對采摘期進(jìn)行控制，今后的試驗將會進(jìn)一步針對研究不同采摘期團(tuán)羽鐵線蕨化學(xué)成分差異進(jìn)行報道。