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    新型根管封閉劑HiFlow 抗菌性能的體外研究

    2022-10-14 05:11:36馮立新李芷萱
    關(guān)鍵詞:熱牙膠糞腸球菌

    邢 陽 馮立新 徐 穎 王 戈 李芷萱

    完美的根管充填材料應(yīng)該能夠?qū)Ω芟到y(tǒng)實(shí)現(xiàn)三維空間的、嚴(yán)密的充填,同時(shí)將根管與其周圍的根尖周組織交通隔斷。AH plus 根管封閉劑具有良好的物理性質(zhì)以及化學(xué)性質(zhì),已作為“金標(biāo)準(zhǔn)”被廣泛應(yīng)用于熱牙膠充填的臨床應(yīng)用中[1]。iRoot SP 根管封閉劑是一種新型的硅酸鹽生物陶瓷類根管封閉劑,無鋁成分,其理化特性與無機(jī)三氧化聚合體(Mineral trioxide aggregate,MYA)相似,具有良好的X 線阻射性、生物相容性、抗菌抑菌性,不存在凝固收縮或者膨脹,粘接性及封閉性良好,已受到臨床廣泛的重視[2],但由于其受熱后可能產(chǎn)生變性,因此目前對(duì)于其在高溫狀態(tài)下的根尖封閉性能及抗菌性尚存在爭(zhēng)議[3]。HiFlow 根管封閉劑是一種專門為熱牙膠垂直加壓充填法而設(shè)計(jì)的硅酸鈣基類預(yù)混合根管封閉劑,其主要化學(xué)成分與iRoot SP 根管封閉劑相似,僅粒度分布不同,有研究報(bào)道稱其具有良好的生物相容性、生物活性,易于滲透入牙本質(zhì)小管內(nèi),從而提高其抑菌性能、粘接強(qiáng)度及封閉性能,此外HiFlow 根管封閉劑還具有低收縮性以及X 線阻射性[4]。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇AH plus 根管封閉劑與iRoot SP 根管封閉劑兩種經(jīng)典的根管封閉劑與HiFlow 根管封閉劑進(jìn)行體外抗菌性能的比較,從而對(duì)HiFlow 根管封閉劑的體外抗菌性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

    1.材料與方法

    1.1 材料及器械 Endo Sequnce RC Sealer Hi Flow 根管封閉劑(Rrasseler USA,美國);AH Plus根管封閉劑(Dentsply,瑞士);iRoot SP 根管封閉劑(Innovative RioceramixInc,Vancouver,加拿大);復(fù)合樹脂Z350(3M,美國);Protaper Universial機(jī)用鎳鈦銼(登士柏,瑞士);熱牙膠充填系統(tǒng)(SybronEndo,美國);0.06 錐度牙膠尖(北京達(dá)雅鼎,中國);垂直加壓器(SybronEndo,美國);UV 1800 紫外可見分光光度儀(Shimadzu,日本);糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AYCC29212(壇墨質(zhì)檢,中國)。

    1.2 方法

    1.2.1 直接接觸實(shí)驗(yàn)(direct contact test,DCY)[5]將標(biāo)準(zhǔn)菌糞腸球菌(AYCC29212)制備成濃度為106CFU/ mL 的菌懸液。

    取100 個(gè)1.5mL 的經(jīng)無菌處理的離心管,按照選擇的根管封閉劑材料的不同,將其共分為5 組,分別為AH Plus 組、iRoot SP 組、Hi Flow 組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組,各組20 個(gè)樣本。各組封閉劑的使用均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,將各組封閉劑分別注入離心管的底部,高度均約1cm,陽性對(duì)照組則注入同等高度的凡士林,陰性對(duì)照組為無菌空白管。將各組離心管均放置于37℃、相對(duì)濕度>95%的恒溫箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    分別于根管封閉劑應(yīng)用后的20min、1d、7d、14d,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從各組樣本中取出5 個(gè)離心管樣本,各實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組的離心管內(nèi)均被注入10μL 的糞腸球菌菌液,陰性對(duì)照組內(nèi)加入10μL的無菌去離子水。待各組于37℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h 后,將各組的所得細(xì)菌懸液進(jìn)行濃度稀釋,將各濃度的菌液分別取50μL 接種于RHI 瓊脂培養(yǎng)基上,置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧下培養(yǎng)24h 后,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),最終結(jié)果合算成每毫升CFU,計(jì)數(shù)結(jié)果取均值。

    1.2.2 抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn) 取濃度為3×108CFU/ mL的糞腸球菌懸液50μL,以玻璃棒于培養(yǎng)皿上涂開,于37℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧下培養(yǎng),觀察細(xì)菌當(dāng)達(dá)到不完全融合生長(zhǎng)時(shí),取出培養(yǎng)皿,在同一培養(yǎng)皿上放置帶有3 個(gè)圓形鏤空的濾紙,鏤空直徑均為5mm,鏤空之間保持一定間隔。將3 個(gè)鏤空分別標(biāo)記為A、R、C 三組,分別涂布AH Plus 根管封閉劑、iRoot SP 根管封閉劑、Hi Flow 根管封閉劑,另放置一個(gè)直徑5mm 含有蒸餾水的濾紙作為D 組,每組設(shè)置5 個(gè)RHI 培養(yǎng)皿。將各組培養(yǎng)皿置于37℃、100%濕度的厭氧培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng),分別于1d、3d、7d 時(shí)取出培養(yǎng)皿,測(cè)量各組的抑菌環(huán)直徑,每組重復(fù)測(cè)量3 次,結(jié)果取均值記錄。

    1.2.3 糞腸球菌感染根管模型實(shí)驗(yàn)(infected root canal model,IRCM)

    (1)離體牙的采集與處理:收集因牙周炎或正畸治療需要而拔除的單直根管恒牙140 顆,納入標(biāo)準(zhǔn):①牙齒發(fā)育形態(tài)正常,牙根完好,根尖孔發(fā)育完全,無齲壞,未經(jīng)過牙髓治療,顯微鏡下觀察未見隱裂及外吸收;②X-ray 片顯示根管均為單根管恒牙,不存在根管內(nèi)吸收;③牙根長(zhǎng)度正常,釉牙骨質(zhì)界距離根尖超過11mm;④根管通暢,無鈣化;⑤經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①根尖孔不完整,已有吸收或破壞;②為多根管或根管系統(tǒng)存在解剖變異。將所拔除的牙齒流水沖洗干凈后,以齦下刮治器刮除牙根表面的牙周膜、肉芽及牙石,再以流水沖洗干凈后將離體牙置于0.9%生理鹽水中,4℃冰箱冷藏備用。

    (2)根管預(yù)備:以金剛砂車針沿釉牙骨質(zhì)界將離體牙進(jìn)行截冠。冠向下法進(jìn)行根管預(yù)備,將預(yù)備好的離體牙樣本浸泡于去離子水中,進(jìn)行高溫高壓滅菌后備用。

    (3)糞腸球菌感染根管模型的建立:向制備好的根管模型內(nèi)注射濃度為108CFU/ mL 的糞腸球菌懸液并置于含有1ml 此懸液的1.5ml 離心管內(nèi),于厭氧培養(yǎng)箱(37℃、100%濕度)中厭氧培養(yǎng)3w,感染根管模型建立完成,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    (4)根管充填及分組:將根管預(yù)備完成的離體牙隨機(jī)分為7 組,每組20 個(gè)樣本。分別為A 組:AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組;R 組:AH Plus根管封閉劑單尖組;C 組:iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組;D 組:iRoot SP 根管封閉劑單尖組;E組:Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組;F 組:Hi Flow 根管封閉劑單尖組;G 組:熱牙膠對(duì)照組,為僅充填熱牙膠,未使用根管封閉劑。根管充填后,以樹脂封閉髓腔,全程均在無菌操作下進(jìn)行。

    (5)細(xì)菌計(jì)數(shù):將根管充填后的樣本均置于無菌RHI 培養(yǎng)基中培養(yǎng),每隔2d 更換一次新鮮培養(yǎng)液,分別于根管充填20min、1d、7d、14d 時(shí),對(duì)各組樣本進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。具體方法如下:將牙根截成根尖3mm、根中1/ 3、根冠1/ 3,應(yīng)用GG 鉆將根管內(nèi)根充材料磨除,將收集到的所有磨除的根充材料及牙本質(zhì)碎屑移入2ml 離心管內(nèi),其內(nèi)加入2mlPRS 緩沖液,均勻震蕩1min 后,對(duì)細(xì)菌懸液進(jìn)行濃度稀釋,方法同1.2.1 的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法,全部取樣工作均在無菌操作下進(jìn)行。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件23.0版本對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,各組間的菌落數(shù)、抑菌環(huán)直徑比較均采用ANOVA 分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊者采用LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,方差不齊者采用塔姆黑尼Y2 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.結(jié)果

    2.1 直接接觸實(shí)驗(yàn)各組根管封閉劑抑菌效果的比較 各組在與細(xì)菌混合培養(yǎng)不同時(shí)間后,除陽性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)間菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P>0.05),其余各組隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),菌落數(shù)均逐漸增多,各組不同時(shí)間點(diǎn)間菌落數(shù)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

    各組根管封閉劑在新鮮混合20min、1d 后,AH Plus 組、iRootSP 組、Hi Flow 組三組的菌落數(shù)均低于同時(shí)間點(diǎn)的陽性對(duì)照組(P<0.05),且20min、1d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的三組間菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各實(shí)驗(yàn)組根管封閉劑在混合7d 后,抗菌性均有所下降,以AH Plus 組下降最為明顯,但三組菌落數(shù)仍低于陽性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),iRootSP 組與Hi Flow 組的菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),均低于AH Plus 組(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組根管封閉劑在混合14d 后,AH Plus 組的抗菌性進(jìn)一步降低,與陽性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。iRootSP 組與Hi Flow 組的抗菌性也在降低,但兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而與陽性對(duì)照組及AH Plus 組的菌落數(shù)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。具體見表1,圖1。

    圖1 各組根管封閉劑混合1d 后菌落數(shù)比較

    表1 各組根管封閉劑混合不同時(shí)間后菌落計(jì)數(shù)的比較(Log10 CFU/ mL,)

    注:相同字母表示在同一時(shí)間點(diǎn)組間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

    2.2 三組根管封閉劑抑菌環(huán)直徑的比較 三組根管封閉劑作用于糞腸球菌1d、3d、7d 后,各組的抑菌環(huán)直徑遞減,各組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)間除1d 與3d間的抑菌環(huán)直徑無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P>0.05),其余時(shí)間點(diǎn)間比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。根管封閉劑作用于糞腸球菌1d 時(shí),三組間的抑菌環(huán)直徑iRootSP 根管封閉劑組最大,AH Plus 根管封閉劑組最小,但三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。3d 時(shí),各組抑菌環(huán)直徑均略有縮小,抑菌作用在減弱,但三組間仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。7d 時(shí),各組抑菌環(huán)直徑縮小明顯,iRootSP 根管封閉劑組與Hi Flow 根管封閉劑組抑菌環(huán)直徑無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),且均高于AH Plus 根管封閉劑組(P<0.05)。對(duì)照組蒸餾水作用于細(xì)菌后,任何時(shí)間均無抑菌環(huán)形成。具體見表2,圖2。

    表2 各組根管封閉劑抑菌環(huán)直徑的比較(mm,)

    表2 各組根管封閉劑抑菌環(huán)直徑的比較(mm,)

    圖2 不同根管封閉劑不同時(shí)間的抑菌環(huán)效果

    2.3 建立感染根管模型各組根管封閉劑抑菌效果的比較 各組根管封閉劑作用于感染根管20min后,AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組三組的菌落數(shù)均低于熱牙膠對(duì)照組(P<0.05),三組之間菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。其余各組菌落數(shù)與熱牙膠對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各組根管封閉劑作用于感染根管1d 后,AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 單尖組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組四組的菌落數(shù)均低于熱牙膠對(duì)照組(P<0.05),四組之間菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。其余各組菌落數(shù)與熱牙膠對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各組根管封閉劑作用于感染根管7d 后,各實(shí)驗(yàn)組的抗菌性仍存在,菌落數(shù)均低于熱牙膠對(duì)照組(P<0.05)。iRoot SP 根管封閉劑單尖組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組,與其1d 時(shí)相比,菌落數(shù)更少,抗菌性更強(qiáng)(P<0.05)。iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組與其1d 時(shí)相比,菌落數(shù)增加,抗菌性減弱(P<0.05)。各組根管封閉劑作用于感染根管14d 后,AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 根管封閉劑單尖組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組三組的抗菌性仍良好,均優(yōu)于其余各組(P<0.05),且iRoot SP 根管封閉劑單尖組與Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組的菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),均優(yōu)于AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組(P<0.05)。具體見表3。

    表3 建立感染根管模型各組根管封閉劑抑菌效果的比較(Log10 CFU/ mL,)

    表3 建立感染根管模型各組根管封閉劑抑菌效果的比較(Log10 CFU/ mL,)

    3.討論

    根管是一個(gè)比較復(fù)雜的結(jié)構(gòu),它存在很多根管預(yù)備器械很難到達(dá)的結(jié)構(gòu),比如根管的峽部、側(cè)支根管以及根尖分歧、根尖分叉等部位。同樣的,在根管充填時(shí),單純依靠牙膠尖等核材料也無法實(shí)現(xiàn)對(duì)這些部位的嚴(yán)密充填,對(duì)于根尖部位的充填不嚴(yán)密,往往會(huì)導(dǎo)致根尖微滲漏出現(xiàn)的幾率增加。因此,根管充填若要保持一個(gè)長(zhǎng)期且穩(wěn)定的嚴(yán)密封閉效果,則必須有根管封閉劑的加入,根管封閉劑可進(jìn)入這些復(fù)雜結(jié)構(gòu)內(nèi),以保證根尖部位的封閉效果,從而能夠更好地降低根管內(nèi)再感染的風(fēng)險(xiǎn)。AH Plus 作為樹脂類根管封閉劑中的代表,它能夠通過固化反應(yīng)時(shí)分解的雙酚a-二縮水甘油醚以及甲醛從而達(dá)到抗菌的目的,其中的甲醛含量揮發(fā)極少,降低了細(xì)胞毒性,同時(shí)又兼具抗菌抑菌性,根尖封閉效果好,但AH Plus 對(duì)于根尖周組織有少量的刺激性作用[6-7]。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),與其它各類的根管封閉劑相比,硅酸鹽生物陶瓷類材料無論在生物活性、理化性能以及提高根尖密合性等方面表現(xiàn)更出色一些[8-9]。iRoot SP 根管封閉劑作為其中的代表,可以促進(jìn)骨組織的再生以及根尖孔的閉合,同時(shí)凝固時(shí)不產(chǎn)生收縮,充填完成后降低了根尖再感染的發(fā)生[10]。HiFlow 根管封閉劑屬于硅酸鈣基類根管封閉劑的一種,與iRoot SP 的化學(xué)成分相似,其預(yù)混合而成,不需要調(diào)拌,直接注入根管內(nèi)即可,表現(xiàn)出較理想的生物相容性,很小的遺傳毒性,致癌性小,術(shù)后疼痛反應(yīng)輕,生物活性亦較好,可促進(jìn)成骨分化及礦化,根尖組織耐受,可與牙本質(zhì)形成良好的化學(xué)粘接力[11-12],同時(shí)可用于高溫下熱牙膠的根管內(nèi)充填,現(xiàn)已逐漸受到口腔臨床工作者的關(guān)注。

    目前公認(rèn)的根管治療理論表明,根管充填不應(yīng)單單只為了達(dá)到密閉根管的效果,更應(yīng)通過根管內(nèi)的充填材料(核材料以及根管封閉劑)對(duì)根管進(jìn)行穩(wěn)定長(zhǎng)久地殺菌抑菌作用,控制甚至完全清除根管內(nèi)的殘余細(xì)菌,促使根尖周組織加速痊愈[13]。HiFlow根管封閉劑屬于新型硅酸鈣基類封閉劑,可耐高溫,與iRoot SP 均屬于預(yù)合成的親水性生物陶瓷類封閉劑。區(qū)別在于,HiFlow 根管封閉劑在150℃~220℃的高溫下,仍能保持高流動(dòng)性及粘接性,高溫下理化性質(zhì)穩(wěn)定,而iRoot SP 根管封閉劑在140℃時(shí)已發(fā)生了變性,因此不適用于熱牙膠的充填[14]。DCY 是檢測(cè)藥物抑菌性能的幾種方法之一。有實(shí)驗(yàn)人員將DCY 改進(jìn)后,證實(shí)i Root SP 根管封閉劑、AH Plus 根管封閉劑及HiFlow 根管封閉劑三種根管封閉劑對(duì)糞腸球菌均有一定地抑菌性,但材料的抑菌性能隨著固化時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸衰弱[15]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí),各組根管封閉劑在新鮮混合20min、1d 后,AH Plus 組、iRootSP 組、Hi Flow 組均有抗菌性,菌落數(shù)均低于陽性對(duì)照組,但三組間抗菌性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組根管封閉劑在混合7d 后,各組仍有抗菌性,且iRootSP 組與Hi Flow 組的抗菌性優(yōu)于AH Plus 組。各組根管封閉劑在混合14d 后,AH Plus 組抗菌性極低,而iRootSP 組與Hi Flow 組仍能保持抗菌性。抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),三組根管封閉劑作用于糞腸球菌1d、3d、7d 后,各組的抑菌環(huán)直徑遞減,說明隨著時(shí)間的延長(zhǎng),抑菌作用都逐漸在減弱。此外,本實(shí)驗(yàn)還建立了感染根管模型,研究了各組根管封閉劑在常溫下及熱牙膠充填時(shí)的高溫作用后的抗菌性。結(jié)果表明,各組根管封閉劑表現(xiàn)出了良好的抗菌抑菌性,在根管充填14 天后,iRootSP 根管封閉劑+熱牙膠組,因高溫使其理化性質(zhì)有所改變,抗菌性降低,但其單尖充填后的抗菌性與Hi Flow 根管封閉劑的抗菌效果優(yōu)于AH Plus 根管封閉劑,與直接接觸實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。以上均說明,三組封閉劑對(duì)糞腸球菌均有抗菌效果,且其抗菌性能與其固化狀態(tài)、時(shí)間有關(guān),但Hi Flow 根管封閉劑與iRootSP 根管封閉劑的抗菌效果在實(shí)驗(yàn)中未見差異,分析其原因:iRootSP 根管封閉劑與Hi Flow 根管封閉劑的主要化學(xué)成分基本相同,均含有硅酸鈣、氧化鋯、磷酸鈣、氫氧化鈣,其中后兩者反應(yīng)產(chǎn)生堿式磷酸鈣(Hydroxyapatite,HAP)及水后,水促進(jìn)硅酸鈣發(fā)生水化,又生成氫氧化鈣及水化硅酸鈣(Hydrate calcium silicate,C-S-H),從而水化反應(yīng)循環(huán)發(fā)生,使根管內(nèi)呈強(qiáng)堿性環(huán)境[16],致使細(xì)菌的細(xì)胞膜或DNA 受損,蛋白質(zhì)發(fā)生變性,因而iRootSP 根管封閉劑與Hi Flow 根管封閉劑均能夠發(fā)揮其抑菌抗菌性,細(xì)菌很難生存。此外,iRootSP 根管封閉劑與Hi Flow 根管封閉劑的區(qū)別在于兩者的顆粒分布不同,后者在高熱狀態(tài)下表現(xiàn)出更好的低粘性、高流動(dòng)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明Hi Flow 根管封閉劑在高溫狀態(tài)下,其抗菌效果未發(fā)生改變,而AH Plus 根管封閉劑因其釋出具有抑菌成分的甲醛量較低,因而其抑菌性低于前兩者[17-18]。

    綜上所述,Hi Flow 根管封閉劑其抑菌性與iRootSP 根管封閉劑相似,值得臨床推廣。但由于本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的觀察時(shí)間尚短,而且是體外研究實(shí)驗(yàn),不能完全模擬出口腔內(nèi)的真實(shí)環(huán)境,因此根管封閉劑的抗菌性仍需長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合大量的臨床病例進(jìn)一步的研究。

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