新疆部分地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)PEDV、TGEV和RV的流行情況調(diào)查

陳強(qiáng)斌

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第八師動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆 石河子 832000）

我國(guó)的生豬養(yǎng)殖業(yè)不斷趨向于集約化和規(guī)?；l(fā)展，支撐著我國(guó)畜牧產(chǎn)業(yè)的壯大，但是隨著我國(guó)豬場(chǎng)的規(guī)?；l(fā)展，各種豬的流行病也在我國(guó)的豬場(chǎng)中肆虐起來，特別是豬病毒性腹瀉，嚴(yán)重影響著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展壯大[1]。豬病毒性腹瀉是規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)常見的一種豬腸道疾病，有著非常復(fù)雜的致病機(jī)理，不論是細(xì)菌、病毒的感染，還是寄生蟲的感染，都有可能導(dǎo)致病毒性腹瀉。豬病毒性腹瀉的傳播速度非?？?，致死率也非常高，尤其是在規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)中，一旦流行起來，就有可能造成大量種豬和仔豬死亡。近年來，新疆的很多豬場(chǎng)都發(fā)生過不同程度的豬病毒性腹瀉，引起這些病毒性腹瀉的3種典型性病毒分別為豬輪狀病毒（RV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等。一般來說，這3種病毒一般以混合交叉感染的方式或者單一感染的方式在豬群中傳播，發(fā)病非常急，對(duì)于仔豬來說更是可以造成百分之百的致死率。目前，僅從病理解剖和腸道病變很難區(qū)分TGE（豬傳染性胃腸炎）、PED（豬流行性腹瀉）、輪狀病毒感染，因?yàn)楦腥玖素i病毒性腹瀉的豬都有相同的臨床表現(xiàn)，那就是消瘦、有水樣腸道病變、食欲不振、精神狀態(tài)差等，會(huì)讓感染病豬發(fā)生各種各樣的腸道病變。雖然生豬養(yǎng)殖有很大的利潤(rùn)，但是因?yàn)樨i場(chǎng)流行病毒性腹瀉，導(dǎo)致大量生豬死亡，會(huì)對(duì)養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。特別是新疆部分地區(qū)，由于豬的規(guī)?；B(yǎng)殖起步時(shí)間不長(zhǎng)，養(yǎng)殖技術(shù)和疾病防治技術(shù)都不發(fā)達(dá)，很多養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)豬流行性腹瀉的流行狀況并不了解，甚至不管豬感染何種病毒，都盲目使用豬腹瀉疫苗，不但不能阻礙豬病毒性腹瀉的傳播，還對(duì)養(yǎng)殖戶造成了更加嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此采用科學(xué)的方法對(duì)新疆部分地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)的PED、TGE和RV流行情況調(diào)查是非常有必要的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年12月在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第八師動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 病料來源 收集來自新疆部分規(guī)?；i場(chǎng)疑似TGEV、PEDV和RV的組織病料。

1.2.2 主要試驗(yàn)儀器設(shè)備 梯度型PCR儀（山東龍煤工礦機(jī)械有限公司）；TG16-WS高速離心機(jī)（常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）；MIX2000漩渦混合器（杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司）：HH-80數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）；迷你離心機(jī)WTL-6K（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)（蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；DYCP-44P快速凝膠電泳槽（北京合眾博普科技發(fā)展有限公司）；格蘭仕微波爐（格蘭仕集團(tuán)）；伊若達(dá)DSX-280KB30滅菌器（南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司）；博科96孔板混勻儀VORTEX-2（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；電子精密天平JA3003（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；705型超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）。

1.2.3 主要試劑 血樣/組織DNA提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、Trizol裂解液、2×TaqPCR Master Mix；反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

1.3 引物設(shè)計(jì)

PEDV、TGEV和RV的檢測(cè)參考前人建立的方法[2-5]。各病原檢測(cè)引物信息見表1。

表1 引物序列和片段大小

1.4 方法

1.4.1 病料的處理 將采集的病料用研磨器進(jìn)行研磨，再用PBS緩沖液作10倍稀釋，經(jīng)過反復(fù)凍融3次，然后在5℃ 8 000 r/min離心20 min，取上清液，并且將樣品的相應(yīng)信息進(jìn)行標(biāo)注，進(jìn)行下一步的檢測(cè)。

1.4.2 核酸的提取 按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行操作。

1.4.3 RT-PCR

（1）將無菌操作臺(tái)充分消毒通風(fēng)后，取一個(gè)無菌的PCR離心管，添加樣品及試劑，隨機(jī)引物（Random Primer）1 μL；樣品病料RNA 2 μL；H2O 9 μL；5×RT Buffer 4 μL；dNTPs 2 μL；RNase Inhibitor 1 μL；Reverse Tra Ace 1 μL。

（2）將上述20 μL混合液PCR管混勻，低速離心后，置于RT-PCR反應(yīng)儀器中，反應(yīng)溫度見表2，反應(yīng)結(jié)束后在4 ℃保存。

表2 反應(yīng)溫度

（3）PCR擴(kuò)增反應(yīng)（25 μL體系）。試劑添加：10×PCR buffer2.5 μL；dNTP2.0 μL；上游引物1.0 μL；下游引物1.0 μL；滅菌去離子水17.0 μL；DNA模板1.0 μL；Taq酶0.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反復(fù)30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止循環(huán)。

將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在電壓5～10 V/cm條件下30 min，同時(shí)與DNA Marker DL 2 000進(jìn)行比較，即可得出試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

采用RT-PCR方法對(duì)來自新疆維吾爾自治區(qū)50個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的131份疑似豬病毒性腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)[6]，結(jié)果如下。

2.1 豬病毒性腹瀉病料RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

不同地區(qū)豬病毒性腹瀉病料RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見表3。收集的131份病料中PEDV陽性份數(shù)74份，陽性率為56.5%；TGEV陽性份數(shù)17份，陽性率為13.0%；RV陽性份數(shù)18份，陽性率為13.7%，表明新疆維吾爾自治區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)引起豬病毒性腹瀉的主要病原為PEDV，陽性率最高，其次是RV，最后是TGEV。

表3 豬病毒性腹瀉病料RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

新疆維吾爾自治區(qū)不同地區(qū)的PEDV、TGEV和RV的陽性率有所差異，其中PEDV在石河子和庫(kù)爾勒陽性率最高，分別為58.3%和57.9%，TGEV在庫(kù)爾勒和福海最高，分別為15.8%和15.4%，RV陽性率在昌吉和石河子最高，分別為18.2%和15.0%，說明豬病毒性腹瀉流行特點(diǎn)存在地域性差異，這可能與地貌差異、天氣變化、溫濕度不同等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究分析[7]。

2.2 不同季節(jié)PEDV、TGEV和RV陽性率

PEDV、TGEV和RV在一年四季的陽性率見表4。春、冬季節(jié)PEDV陽性率分別為52.1%和52.9%，均高于夏季（34.8%）和秋季（34.6%）的陽性率；春、冬季節(jié)的TGEV陽性率分別為8.3%和5.9%，均高于夏季（4.3%）和秋季（3.8%）的陽性率；春、冬季節(jié)的RV陽性率分別為6.2%、8.8%，均高于夏季（4.3%）和秋季（3.8%），表明豬病毒性腹瀉在不同季節(jié)的陽性率有差異，冬季和春季暴發(fā)嚴(yán)重，陽性率高。PEDV在一年四季的陽性率均大于TGEV和RV[8]。

表4 PEDV、TGEV和RV在一年四季的陽性率

2.3 豬不同發(fā)育階段PEDV、TGEV和RV陽性率

豬不同發(fā)育階段的PEDV、TGEV和RV陽性率見表5。在豬不同發(fā)育階段PEDV、TGEV和RV的陽性率存在顯著差異，PEDV、TGEV和RV主要在7d內(nèi)哺乳仔豬和7～25d哺乳仔豬陽性率較高，分別為PEDV 62.5%和65.1%、TGEV 7.1%和9.3%、RV 5.4%和9.3%。仔豬在出生25d內(nèi)易受病毒感染引起腹瀉，到了保育期階段，PEDV、TGEV和RV陽性率均有明顯下降，且到了肥育期階段，幾乎沒有檢測(cè)到由TGEV和RV引起的病毒性腹瀉情況。

表5 豬不同發(fā)育階段PEDV、TGEV和RV陽性率

3 討論

豬病毒性腹瀉是目前我國(guó)規(guī)模化豬場(chǎng)常見的疾病，一旦豬感染了豬病毒性腹瀉，則會(huì)出現(xiàn)消瘦、脫水、嚴(yán)重腹瀉等癥狀，死亡率極高，嚴(yán)重制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，對(duì)豬場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。為了解新疆部分地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)的豬病毒性腹瀉情況，研究使用了RT-PCR對(duì)新疆維吾爾自治區(qū)的50個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)（包括石河子、阜康、庫(kù)爾勒、昌吉、福海）疑似131份豬病毒性腹瀉病料進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，結(jié)果表明，PEDV陽性率最高，為56.5%；TGEV和RV陽性率較低，分別為13.0%和13.7%。不同地區(qū)的陽性率有一定的差異，說明豬病毒性腹瀉流行特點(diǎn)存在地域性差異，這可能與地貌差異、天氣變化、溫濕度不同等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究分析。春、冬季節(jié)PEDV陽性率分別為52.1%和52.9%，均高于夏季（34.8%）和秋季（34.6%）的陽性率，春、冬季節(jié)的TGEV陽性率分別為8.3%和5.9%，均高于夏季（4.3%）和秋季（3.8%）的陽性率，春、冬季節(jié)的RV陽性率分別為6.2%、8.8%，均高于夏季（4.3%）、秋季（3.8%），表明豬病毒性腹瀉在不同季節(jié)的陽性率有差異，冬季和春季暴發(fā)嚴(yán)重，陽性率高，可能是因?yàn)榇杭?、冬季比較寒冷，導(dǎo)致豬的免疫力低下，更容易感染豬腹瀉病毒。通過本文的數(shù)據(jù)不難發(fā)現(xiàn)，PEDV在一年四季的陽性率均大于TGEV和RV。在豬不同發(fā)育階段PEDV、TGEV和RV陽性率存在顯著差異，PEDV、TGEV和RV主要在7d內(nèi)仔豬和7～25d哺乳仔豬陽性率較高，分別為PEDV 62.5%和65.1%、TGEV 7.1%和9.3%、RV 5.4%和9.3%，仔豬在出生25d內(nèi)易受病毒感染引起腹瀉。到了保育期階段，PEDV、TGEV和RV陽性率均有明顯下降，而到了肥育期階段，幾乎沒有檢測(cè)到由TGEV和RV引起的病毒性腹瀉情況，這是因?yàn)樽胸i的免疫力比較低下，更容易受到腹瀉病毒的侵襲。本研究通過對(duì)豬病毒性腹瀉流行情況調(diào)查，為新疆維吾爾自治區(qū)豬病毒性腹瀉研究提供科學(xué)依據(jù)和防控方向。