d-α-生育酚預(yù)防仔豬肝臟急性炎癥損傷的效果

趙嘉楠，任 穎，余鎮(zhèn)東，孫海輝，甘歡華，張 斌，黃輝其，馬立保

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.宜春大海龜生命科學(xué)有限公司，江西 宜春 336000）

斷奶是仔豬生長(zhǎng)發(fā)育的重要階段之一，早期斷奶可以提高仔豬飼料利用率、減少被母豬壓死和母豬傳染仔豬疾病的機(jī)會(huì)，有利于提高仔豬成活率。但早期斷奶也會(huì)使體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），引發(fā)仔豬氧化應(yīng)激[1-3]，破壞機(jī)體氧化還原平衡。肝臟是仔豬代謝的主要部位，含有大量的線粒體，是機(jī)體產(chǎn)生活性氧的關(guān)鍵器官[4-5]，ROS會(huì)破壞肝臟線粒體中的DNA、阻止肝細(xì)胞呼吸鏈中的酶蛋白合成和細(xì)胞膜的形成，所以肝臟是氧化應(yīng)激引起損傷的靶器官。此前有研究報(bào)道，斷奶可能導(dǎo)致仔豬肝臟氧化應(yīng)激，并通過(guò)MAPK信號(hào)影響肝細(xì)胞凋亡[6]。

細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）可引起炎癥和氧化應(yīng)激，造成不同器官的損傷，對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)能力產(chǎn)生不良影響[7]。有研究證實(shí)，LPS的過(guò)度積累會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷[8-9]，所以LPS刺激引起的應(yīng)激模型也被用作肝臟急性損傷模型。因此，我們采用LPS刺激來(lái)模擬斷奶仔豬的急性肝損傷。

維生素E包含α-、β-、γ-及δ-生育酚和α-、β-、γ-及δ-生育三烯酚等多種生物形式，而d-α-生育酚是維生素E中存在最多、分布最廣、生物活性最高的物質(zhì)。d-α-生育酚是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為了防止d-α-生育酚在飼料生產(chǎn)加工和儲(chǔ)藏中的損失，飼料中的dl-α-生育酚均以酯的形式存在，已有的研究報(bào)道斷奶仔豬更易吸收天然酚式結(jié)構(gòu)的d-α-生育酚[10]。大量的研究結(jié)果表明，d-α-生育酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、心血管保護(hù)作用及脂肪沉積調(diào)控等廣泛的生物學(xué)功能。但目前，d-α-生育酚的研究主要集中在畜禽生長(zhǎng)性能、肉品質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化性能等方面，而對(duì)于仔豬肝臟損傷的預(yù)防作用則鮮有報(bào)道。因此，本研究擬在正常飼養(yǎng)條件下，模擬仔豬斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的仔豬肝臟損傷，并在腹腔注射LPS建立仔豬急性炎癥氧化應(yīng)激模型，通過(guò)在飼料中加入天然酚式結(jié)構(gòu)的d-α-生育酚（75 mg/kg d-α-生育酚），探究其對(duì)斷奶仔豬血液生化指標(biāo)、肝臟組織形態(tài)和肝功能酶的作用效果，以期為解決仔豬斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的肝臟損傷和注射疫苗等急性炎癥反應(yīng)造成的急性肝損傷等健康問(wèn)題提供新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 時(shí)間與地點(diǎn)

飼養(yǎng)試驗(yàn)于2021年8月中旬至9月中旬在湖北龍王畜牧有限公司養(yǎng)豬場(chǎng)開(kāi)展，試驗(yàn)周期21 d。試驗(yàn)豬于2021年9月14日在湖北龍王畜牧有限公司進(jìn)行屠宰測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的d-α-生育酚由米糠油提取純化，總生育酚含量為87.58%，其中d-α-生育酚純度為99.8%，由宜春某生命科學(xué)有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇21日齡、體重和胎次相近、健康狀況良好的長(zhǎng)大二元雜種斷奶仔豬72頭，按體重相近原則隨機(jī)分為2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭仔豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧（簡(jiǎn)稱(chēng)C組），試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)飼糧+75 mg/kg d-α-生育酚（簡(jiǎn)稱(chēng)TP組），試驗(yàn)周期21 d。在試驗(yàn)第22天上午，分別從兩個(gè)處理組（C組和TP組）中隨機(jī)挑選6頭仔豬腹腔注射脂多糖LPS溶液（100 mg/kg體重），建立氧化應(yīng)激模型，分別簡(jiǎn)稱(chēng)為CL組和TPL組；兩個(gè)處理組（C組和TP組）中剩下的仔豬中再分別隨機(jī)挑選6頭仔豬注射相同劑量滅菌生理鹽水作為對(duì)照，分別簡(jiǎn)稱(chēng)為CC組、TPC組。注射LPS溶液4 h以后，24頭仔豬全部屠宰，采集血清和肝臟樣品。

1.4 飼糧配制與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧參照仔豬的飼糧配方適當(dāng)調(diào)整配制（NRC，2012），其飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

試驗(yàn)期間仔豬飼養(yǎng)在全封閉式的保育仔豬舍內(nèi)，塑料漏縫地板，通風(fēng)良好。試驗(yàn)期間自由采食和飲水，每天定時(shí)清掃豬圈和消毒，仔豬的免疫按常規(guī)程序進(jìn)行，仔豬飼養(yǎng)管理措施嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生防疫制度。

1.5 樣品采集

LPS注射4 h后，所有仔豬頸靜脈放血處死。屠宰后立即收集仔豬的血清和肝臟組織樣本。取1 cm左右肝臟組織塊固定在4%多聚甲醛溶液中，另取幾塊收集于2 mL的冷凍管中，置于-80 ℃保存待用。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 肝臟組織病理學(xué)觀察取肝組織在4%聚甲醛中4 ℃固定48 h。然后對(duì)組織塊進(jìn)行修整、脫水、透明、石蠟包埋，以5 μm厚度為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行切片、攤片和烘片。然后將切片脫蠟，用無(wú)水乙醇反復(fù)浸泡，后用蒸餾水浸泡后進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）染色。染色后脫水，用中性樹(shù)膠封片備用。每組組織標(biāo)本取2片，用光學(xué)顯微鏡觀察，確定肝臟切片的組織學(xué)損傷程度。

1.6.2 血液生化指標(biāo)和肝功能酶活性測(cè)定 采集每組6頭豬的血清樣品，用試劑盒進(jìn)行血液生化指標(biāo)及肝功能酶指標(biāo)測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成股份有限公司（中國(guó)南京）。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 肝臟組織病理學(xué)觀察

為了探討d-α-生育酚對(duì)肝臟的保護(hù)作用，筆者采用H&E染色法觀察了肝組織的病理變化。如圖2所示，CC組仔豬未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞完整；TPC組仔豬肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞核位于中心，呈圓形；CL組肝竇內(nèi)白細(xì)胞增多，間質(zhì)里有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；TPL組仔豬有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞形態(tài)完整。在飼糧中添加d-α-生育酚減輕了LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。

2.2 d-α-生育酚對(duì)斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響

由表2可以看出，TPC組的血清總抗氧化能力（T-AOC）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性顯著高于CC組（P＜0.05），丙二醛（MDA）含量顯著低于CC組（P＜0.05）。用LPS處理過(guò)后，CL組的血清總抗氧化能力和過(guò)氧化氫酶活性低于CC組，且差異顯著（P＜0.05），丙二醛含量顯著高于CC組（P＜0.05）；TPL組的血清總抗氧化能力、過(guò)氧化氫酶活性顯著高于CL組（P＜0.05），與CC組不存在顯著性差異（P＞0.05），TPL組丙二醛含量顯著低于CL組（P＜0.05）。

表2 d-α-生育酚對(duì)斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響

2.3 d-α-生育酚對(duì)斷奶仔豬肝臟肝功能酶的影響

由表3可知，CL組的谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性、堿性磷酸酶（ALP）活性是4個(gè)組中最高的，且分別與CC組、TPC組存在顯著差異（P＜0.05），CL組的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、堿性磷酸酶活性雖高于TPL組，但差異不顯著（P＞0.05）；各組間的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 d-α-生育酚對(duì)斷奶仔豬肝功能酶的影響

3 討論

早期斷奶對(duì)于仔豬來(lái)說(shuō)是一個(gè)心理和生理上壓力很大的時(shí)期。仔豬在斷奶后，營(yíng)養(yǎng)來(lái)源、生活環(huán)境、飼養(yǎng)管理方式等發(fā)生改變，同時(shí)與母豬分離、注射豬瘟疫苗，這些原因都會(huì)導(dǎo)致仔豬發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。脂多糖（LPS）是一種細(xì)菌內(nèi)毒素，大量LPS積累會(huì)引發(fā)炎癥及細(xì)胞損傷[8]，可以很好地模擬仔豬遭受外界刺激后的急性應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。肝臟是活性氧（ROS）產(chǎn)生的主要部位，但幼齡時(shí)肝臟抗氧化系統(tǒng)發(fā)育不成熟，仔豬難以應(yīng)對(duì)較嚴(yán)重的氧化應(yīng)激[11]。因此，補(bǔ)充抗氧化劑成為一種可行的治療策略，以使肝臟損傷和疾病的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。

3.1 d-α-生育酚對(duì)斷奶仔豬肝臟組織病理學(xué)的影響

在正常的生理環(huán)境中，細(xì)胞中存在許多抗氧化劑，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、維生素E等，均可以清除體內(nèi)有害的自由基，使自由基的消除和產(chǎn)生處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[12]。然而，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激或是其它應(yīng)激時(shí)，活性氧（ROS）含量增加，超過(guò)了抗氧化劑清除ROS的最大限度，使ROS動(dòng)態(tài)平衡失衡，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。本研究中發(fā)現(xiàn)受斷奶應(yīng)激的仔豬，在斷奶21 d后，應(yīng)激對(duì)肝臟組織病理學(xué)形態(tài)沒(méi)有顯著影響，肝臟結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯改變、水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有可能與斷奶時(shí)間太長(zhǎng)，仔豬自行修復(fù)了損傷有關(guān)。LPS刺激引起肝竇內(nèi)白細(xì)胞增多，間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)明顯的肝臟損傷。有文獻(xiàn)表明，TLRs和NODs均是LPS的受體[13-14]，LPS刺激可誘導(dǎo)仔豬肝臟中TLRs（TLR4、MyD88和TRAF6）和NODs（NOD1、NOD2）mRNA和蛋白的產(chǎn)生以及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因NF-kB、COX2、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8的上調(diào)，而促炎細(xì)胞因子的過(guò)度產(chǎn)生可引起宿主肝臟損傷[13，15]，這可能是CL組肝臟組織病理學(xué)變化的主要原因。而維生素E可以有效清除體內(nèi)有害的自由基，抑制ROS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞被炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度，減緩肝損傷。試驗(yàn)中TPL組肝臟組織病理切片也證明了這一點(diǎn)。因此，在飼糧中添加d-α-生育酚，可以有效地改善肝損傷。Wong等在大鼠中的研究也表明維生素E的攝入減少了心臟和肝臟炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，對(duì)肥胖大鼠的代謝紊亂和肝功能損傷具有保護(hù)作用[16]。

3.2 d-α-生育酚對(duì)斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響

酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)是細(xì)胞反應(yīng)和生理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激所必需的[17-18]。過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶等抗氧化酶是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的指標(biāo)。TPC組的CAT高于CC組，TPL組的CAT和總抗氧化能力（T-AOC）高于CL組，說(shuō)明在飼糧中添加75 mg/kg d-α-生育酚可提高仔豬抗氧化酶的活性。丙二醛（MDA）是一種三碳細(xì)胞毒性分子，由多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化作用產(chǎn)生[19]。血清MDA濃度作為脂質(zhì)過(guò)氧化狀態(tài)的標(biāo)志，在之前的研究中已經(jīng)報(bào)道過(guò)豬血清中丙二醛濃度會(huì)因?yàn)轱暭Z中抗氧化劑含量的降低而增加[20-21]。本研究中，TPC組的丙二醛含量顯著低于CC組（P＜0.05），TPL組的丙二醛含量也顯著低于CL組（P＜0.05），這與總抗氧化能力變化相對(duì)應(yīng)。

3.3 d-α-生育酚對(duì)斷奶仔豬肝功能酶的影響

谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）是主要存在于肝細(xì)胞中的重要轉(zhuǎn)氨酶。正常情況下，AST、ALT、ALP存在于肝細(xì)胞內(nèi)。然而，在肝損傷的情況下，這些酶會(huì)從肝細(xì)胞釋放到機(jī)體循環(huán)中[22]。因此，我們測(cè)定了血漿中AST、ALT和ALP的水平，反映仔豬肝損傷和氧化應(yīng)激程度。在CC組高水平的AST、ALT表示由氧化應(yīng)激引起的仔豬肝功能明顯受損，進(jìn)一步說(shuō)明了氧化應(yīng)激是肝細(xì)胞功能受損的常見(jiàn)機(jī)制[23-24]，這與Hyder等的研究結(jié)果一致。CL組仔豬血清中AST、ALP水平顯著升高，明確提示了LPS所致急性肝損傷的發(fā)生。而在飼糧中添加75 mg/kg d-α-生育酚，TPC組、TPL組分別比CC組、CL組降低了血清中ALT、AST、ALP等的含量，這與組織學(xué)觀察結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，d-α-生育酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷和氧化應(yīng)激引起的肝臟組織和功能損傷有一定的抑制作用。在小鼠中也報(bào)道了類(lèi)似的結(jié)果，Chung等[25]研究發(fā)現(xiàn)α-和γ-生育酚都能阻止LPS誘導(dǎo)的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性的增加，并通過(guò)降低血清ALT活性來(lái)減輕脂質(zhì)性肝臟損傷。Abdel-Maboud等[26]對(duì)發(fā)表的15項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)回顧和薈萃分析發(fā)現(xiàn)，維生素E顯著降低了成人和兒童的ALT活性。但具體作用機(jī)制目前還未有研究報(bào)道，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，在斷奶仔豬飼糧中添加75 mg/kg d-α-生育酚提高了斷奶仔豬的抗氧化能力、降低了斷奶仔豬血清中肝功能酶的含量，從而改善了仔豬氧化應(yīng)激引起的肝臟損傷。同時(shí)，在仔豬飼料中加入75 mg/kg d-α-生育酚，可以減少環(huán)境變化、注射疫苗等應(yīng)激帶來(lái)的急性肝臟損傷。