MC4R基因在5個豬群體內(nèi)的多態(tài)性分析

吳華莉，張鶯鶯，黃 濟，涂尾龍，王洪洋，曹建國，范 春，王勝昌，趙 瑩，談永松

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 閔行 201106；2.上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 浦東新區(qū) 201302；3.上海實驗動物研究中心，上海 浦東新區(qū) 201302）

黑素皮質(zhì)激素受體基因家族（The melanocortin receptor gene family, MCR）由5個位于常染色體上的單外顯子組成。在人、小鼠、牛和狗的基因組中MC2R、MC4R和MC5R是共聯(lián)的，而在豬的基因組中，共聯(lián)組包括MC1R、MC2R和MC5R。MC4R（黑素皮質(zhì)激素受體4基因）的變異與脂肪組織沉積相關(guān)[1]。MC4R在下丘腦室旁核表達，在食物攝入和能量平衡的中樞控制中起著重要作用[2]。豬MC4R基因定位于1號染色體q22-q27[3]。豬MC4R基因存在一個錯義突變（G→A），導(dǎo)致MC4R蛋白第298位天冬氨酸轉(zhuǎn)變成天冬酰胺，該突變與胸腰椎間膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、眼肌寬度、眼肌面積、皮率呈顯著性相關(guān)[4]。MC4R基因多態(tài)性與淮豬日增重和活體背膘厚顯著相關(guān)[5]。本研究檢測豬MC4R基因突變位點在杜洛克豬、長白豬、大白豬、申農(nóng)豬和梅山豬群體內(nèi)的基因型和等位基因頻率，以及群體遺傳學(xué)指標(biāo)，期望為尋找與豬生長指標(biāo)相關(guān)的分子標(biāo)記提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

試驗于2022年6—7月在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所進行。5個豬群體樣品中，杜洛克（90頭）、長白豬（78頭）和大白豬（151頭）來自上海祥欣畜禽有限公司，梅山豬（113頭）來自于上海豬狀元牧場，申農(nóng)豬（76頭）來自上海富民農(nóng)場，共計508個樣品，采用部位為豬耳組織塊。PCR試驗所用試劑和內(nèi)切酶ClaⅠ購于寶生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用AXYGEN基因組試劑盒提取豬耳組織DNA，測定DNA濃度，統(tǒng)一稀釋樣品濃度為80.0 ng/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物及PCR反應(yīng)條件 上游引物：5'-ATGA ACTCAACCCATCACC-3'；下游引物：5'-TTAATA TCTGCTAGACAAATCACAG-3'[6]。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 27.5 μL，DNA模板1.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNase-Free ddH2O 20.5 μL，總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測試驗結(jié)果。

1.2.3 基因型分析 豬MC4R基因PCR擴增片段長度為999 bp，存在ClaⅠ內(nèi)切酶位點。選取PCR擴增條帶單一的樣品，進行限制性內(nèi)切酶試驗，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。限制性內(nèi)切酶消化試驗的反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物5 μL，10×Buffer 2 μL，ClaⅠ0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，總體積為16 μL。酶切溫度為37 ℃，反應(yīng)時間為1 h。豬MC4R基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的不同基因型判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 豬MC4R基因酶切后的3種基因型

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

計算MC4R基因在5個豬群體內(nèi)的基因型頻率、等位基因頻率，計算方法參見參考文獻[7]。采用GENEPOP 3.1軟件計算基因雜合度（Heterozygosity, He）、純合度（Homozygosity,Ho）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles,Ne）和多態(tài)信息含量（polymorphism information content, PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測PCR

結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳檢測MC4R基因PCR結(jié)果，如圖1所示，目的片段大小為999 bp。

2.2 檢測PCR-RFLP結(jié)果

采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測內(nèi)切酶試驗結(jié)果。如圖2所示，AA型為1條帶，GG型為2條帶，AG型雜合子為3條帶。根據(jù)電泳檢測結(jié)果統(tǒng)計MC4R基因在5個群體中的個體基因型。

2.3 豬MC4R基因在5個豬群體內(nèi)的基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳學(xué)指標(biāo)

由表2可知，MC4R基因在5個豬群體內(nèi)的基因型頻率和等位基因頻率表現(xiàn)為：在杜洛克豬群體內(nèi)檢測出AG基因型為優(yōu)勢基因型，AA基因型略少，GG基因型較少，A等位基因為優(yōu)勢等位基因；在長白豬群體內(nèi)檢測出GG基因型為優(yōu)勢基因型，AG基因型略少，少量AA基因型，G等位基因為優(yōu)勢等位基因；在大白豬群體內(nèi)檢測AG基因型為優(yōu)勢基因型，AA基因型略少，GG基因型最少，A等位基因為優(yōu)勢等位基因。在申農(nóng)豬群體內(nèi)檢測GG基因型為優(yōu)勢基因型，AG基因型較少，少量AA基因型，G等位基因為優(yōu)勢等位基因。在梅山豬群體內(nèi)檢測出GG基因型為優(yōu)勢基因型，AG基因型較少，未檢測出AA基因型。

表2 MC4R基因在5個豬群體內(nèi)的基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳學(xué)指標(biāo)

群體遺傳學(xué)指標(biāo)分析結(jié)果顯示，MC4R基因在杜洛克豬和大白豬群體內(nèi)PIC值在0.25～0.5之間，表現(xiàn)為中度多態(tài)；在長白豬、申農(nóng)豬和梅山豬PIC值小于0.25，表現(xiàn)低度多態(tài)。

3 討論

黑素皮質(zhì)激素4受體（MC4R）是一種與體重調(diào)節(jié)有關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體。人類基因研究已表明MC4R基因的兩種移碼突變與顯性遺傳形式的肥胖有關(guān)[8]。機體的體重維持是由復(fù)雜系統(tǒng)控制的，MC4R是調(diào)控豬生產(chǎn)性能性狀的候選基因，在基因的高度保守區(qū)域發(fā)現(xiàn)Asp298Asn突變，并證實該突變位點產(chǎn)生的基因型與豬品系的背膘、生長速度以及總體采食量顯著相關(guān)[9]。本試驗檢測在梅山豬，以及培育品種申農(nóng)豬群體內(nèi)GG基因型為優(yōu)勢基因型。這與劉桂蘭等、強巴央宗等、陳敏等研究證實在中國地方品種群體內(nèi)GG基因型為優(yōu)勢基因型的結(jié)果是一致的[4，10-11]。肖石軍等研究證實GG基因型個體的胸、腰和臀部膘厚比AA基因型和AG基因型的厚，GG基因型生長速度快[12]。有研究表明，申農(nóng)豬和梅山豬的背膘厚比外來品種杜洛克、長白豬和大白豬的要厚[13-18]。由此推測申農(nóng)豬和梅山豬群體中GG基因型背膘厚可能高于AA基因型和AG基因型，但MC4R基因突變究竟是如何影響群體生長指標(biāo)的，還需要收集性狀加以驗證。本試驗檢測G等位基因在長白豬呈高頻分布，而A等位基因在大白豬群體內(nèi)呈高頻分布。這一結(jié)果與劉桂蘭等、肖石軍等研究結(jié)果是一致的[4，12]。