慢腎康寧對腎間質(zhì)纖維化大鼠的影響*

張 靜 孫升云 葛茂功 朱詩平 馮偉峰

腎間質(zhì)纖維化(Renal Interstitial Fibrosis，RIF)指在各種致病因子如炎癥、損傷、藥物等的作用下，細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)大量堆積，RIF是導(dǎo)致腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因素[1]，它是各種原因?qū)е履I臟疾病進(jìn)展到慢性腎臟病的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是致纖維化的關(guān)鍵路徑[2]。慢腎康寧是在臨床上用來治療慢性腎衰的經(jīng)驗(yàn)方,取得了較好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腺嘌呤誘導(dǎo)的以腎間質(zhì)纖維化為主要病理表現(xiàn)的慢性腎臟病大鼠模型觀察慢腎康寧對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟病理形態(tài)學(xué)、Smad2、P-smad2及SARA蛋白表達(dá)的影響，探討慢腎康寧保護(hù)腎臟功能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康、雄性Wistar大鼠60只(體質(zhì)量160～200 g，清潔級，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號scxk粵2006-004)。

1.1.2 主要試劑Smad2、P-smad2抗體由Cell Signaling Technology公司提供，SARA抗體由Epitomic公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用藥慢腎康寧使用顆粒劑由黃芪30 g，黨參15 g，麥冬12 g，淫羊藿20 g，生地黃12 g，丹參10 g，大黃9 g，山萸肉 9 g，茯苓15 g，海螵蛸15 g組成。該藥由三九醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，購于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院。上藥按比例稱取后，每日沖服。氯沙坦鉀片(科素亞，100 mg /片)由杭州默沙東制藥有限公司提供(批號：H20000371)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型和分組動(dòng)物隨機(jī)分為正常組，模型組(給予同等量生理鹽水經(jīng)口灌服)，氯沙坦組，慢腎康寧高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。根據(jù)大鼠的用藥量(mg/kg)= 臨床常用量(mg/kg)×老鼠等效面積系數(shù)(6.25)。以此公式結(jié)果為中劑量，按15 g/(kg·d)給藥。低劑量為中劑量的一半[7.5 g/(kg·d)]，高劑量為中劑量的2倍[30 g/(kg·d)]。氯沙坦給予10 mg/(kg·d)經(jīng)口灌服。共給藥21 d。

1.2.2 標(biāo)本收集治療21 d結(jié)束后稱量各組大鼠體質(zhì)量，當(dāng)天用代謝籠收集大鼠24 h尿液，記錄24 h尿量。第22天于采用戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采集血液，同時(shí)迅速取雙側(cè)腎臟組織，取左側(cè)腎臟以4%多聚甲醛固定進(jìn)行病理學(xué)觀察；另留取部分置于-80 ℃冰箱保存，進(jìn)行蛋白的提取、測定。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生化指標(biāo)的測定檢測血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)， 24 h尿微量蛋白(24 h MTP)取樣送暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科測定。

1.3.2 病理學(xué)染色腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水，石蠟包埋制成切片，進(jìn)行HE染色及Masson染色。

1.3.3 Smad2 P-smad2及SARA蛋白分析取-80 ℃保存的腎組織100～150 mg,經(jīng)RIPA蛋白裂解液成勻漿，4 ℃，12 000 g離心2 min，取上清液。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，每泳道上取變性的蛋白各10 μl/孔，蛋白質(zhì)經(jīng)10%或8%SDS-PAGE垂直凝膠進(jìn)行電泳。恒壓下將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h或4 ℃過夜，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃ 孵育2 h。每步驟后均經(jīng)TBST漂洗，10 min×3次。最后加ECL發(fā)光試劑，雜交信號在Imagetool圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行吸光度分析。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織HE染色情況HE染色在正常組大鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)皆正常，組織結(jié)構(gòu)無明顯病理變化。模型組大鼠腎臟組織內(nèi)見大量腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死，部分腎小管擴(kuò)張；腎間質(zhì)與腎小管界限不清，腎間質(zhì)內(nèi)有大量纖維組織增生、肉芽形成，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤；腎間質(zhì)、腎小管內(nèi)有大量褐色結(jié)晶物沉積；病變腎小球有不同程度的硬化、萎縮，甚至壞死，部分腎小球呈代償性擴(kuò)張。慢腎康寧各劑量組腎組織內(nèi)也可見炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)纖維化，腎小管萎縮、壞死、擴(kuò)張，腎小管及間質(zhì)內(nèi)有褐色結(jié)晶物沉積等改變，但程度輕于模型組。見圖1。

圖1 慢腎康寧對RIF大鼠腎組織病理學(xué)變化的影響 (HE染色，×200)

2.2 腎臟組織Masson染色情況正常組腎組織皮質(zhì)、髓質(zhì)皆正常，腎小球、腎小管無結(jié)構(gòu)改變，腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)無異常改變，個(gè)別間質(zhì)含有少量的膠原纖維。模型組：腎間質(zhì)面積明顯增大，小管萎縮或擴(kuò)張情況明顯，腎小球及腎間質(zhì)有明顯的膠原纖維聚集，棕黃色結(jié)晶顆粒占據(jù)整個(gè)腎小管，腎小球中亦有較多沉積。與模型組相比，慢腎康寧各劑量組間質(zhì)纖維化均有不同程度的減輕，腎小管萎縮或擴(kuò)張情況不同程度好轉(zhuǎn)，腎間質(zhì)的面積明顯縮小，棕黃色顆粒在腎小球、腎小管沉積明顯減少；慢腎康寧高劑量組間質(zhì)纖維化改變與氯沙坦組接近。見圖2。

圖2 慢腎康寧對RIF大鼠腎組織病理學(xué)變化的影響 (Masson染色，×200)

2.3 慢腎康寧對RIF大鼠血Scr BUN 24 h MTP及eGFR影響模型組Scr、BUN和24 h MTP都明顯高于正常組(P<0.05)；慢腎康寧高劑量組、中劑量組、低劑量組及氯沙坦組Scr、BUN和24 h MTP都明顯低于模型組(P<0.05)；其中，慢腎康寧高劑量組與氯沙坦組Scr、BUN和24 h MTP差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明慢腎康寧和氯沙坦在降低Scr、BUN和24 h MTP的療效相當(dāng)。 見表1。

表1 慢腎康寧對RIF大鼠血Scr BUN 24 h MTP eGFR的影響 (只，

2.4 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織Smad2 P-smad2及SARA蛋白相對表達(dá)量影響模型組大鼠腎臟Smad2、P-smad2蛋白表達(dá)水平均升高，與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；慢腎康寧高劑量組、中劑量組和氯沙坦組Smad2蛋白表達(dá)較模型組降低(P<0.01)；低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慢腎康寧高劑量組、中劑量組、低劑量組和氯沙坦組P-smad2蛋白表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.01)。模型組SARA蛋白表達(dá)較正常腎組織顯著升高(P<0.01)；慢腎康寧高劑量組、中劑量組和氯沙坦組SARA蛋白表達(dá)較模型組增加(P<0.01)；低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2，圖3～圖5。

表2 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織Smad2 P-smad2及SARA蛋白表達(dá)影響

圖3 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織Smad2蛋白表達(dá)的影響

圖4 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織P-smad2蛋白表達(dá)的影響

圖5 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織SARA蛋白表達(dá)的影響

3 討論

研究證實(shí)，慢性腎病患者人數(shù)在世界范圍內(nèi)已達(dá) 6.975 億，中國患病人數(shù)占18.97%，達(dá)到了1.323 億人[3]，但是對于大多數(shù)已經(jīng)進(jìn)入終末期腎病的慢性腎病患者，透析和腎移植是惟一選擇，據(jù)統(tǒng)計(jì)，6%的患者在等待移植中即已死亡,能接受腎移植的患者只有25%[4]。腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)進(jìn)展到終末期腎臟病(End Stage Renal Disease，ESRD)的共同表現(xiàn)和病理基礎(chǔ)，這一觀點(diǎn)已得到專家一致認(rèn)可[5]。阻斷腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Tubular Epithelial To Mesenchymal Transition，TEMT) 可以有效延緩慢性腎臟病的腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程[6]，下調(diào)TGF-β1/ Smad信號傳導(dǎo)通路，可以有效減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚[7-9]。

根據(jù)慢性腎臟病的臨床表現(xiàn)及發(fā)病特點(diǎn)，可歸屬于中醫(yī)水腫、癃閉、關(guān)格等范疇。病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，正不勝邪，本虛以脾腎兩虛為主，標(biāo)實(shí)以濕濁、痰濁、水毒為主。慢腎康寧中以黃芪、淫羊藿、山萸肉益氣補(bǔ)腎，腎氣、腎陽充盛則氣化固攝功能可復(fù)，津液代謝正常；丹參、生地黃益腎、活血涼血祛瘀，改善血液循環(huán)；麥冬歸肺經(jīng)，助黃芪以益肺祛痰濕以益元陽；山藥益氣養(yǎng)陰，平補(bǔ)三焦，大黃通腑降濁，既防黨參、黃芪、淫羊藿等補(bǔ)藥壅滯，又佐眾滋補(bǔ)藥之溫。全方攻補(bǔ)兼施，標(biāo)本同治，共奏益氣補(bǔ)腎，活血養(yǎng)血，通腑瀉濁之功效[10]。前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明慢腎康寧可以改善CKD大鼠的一般形態(tài)，降低尿蛋白，減少Scr、BUN、24 h MTP，減輕大鼠腎臟組織病理損傷，保護(hù)腎功能，延緩腎損害進(jìn)程，其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究[11]。

Smad2作為TGF-β1在細(xì)胞內(nèi)特有的作用底物介導(dǎo)了信號由細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核，Smad2/3蛋白的磷酸化代表了TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路的激活[12]，抑制P-Smad2/3的表達(dá)可減緩RIF進(jìn)程[13]。SARA與Smad2和Smad3的磷酸化有關(guān)[14]，在Smad2/Smad3和TGF-β受體之間起到橋梁作用，靶向SARA可以調(diào)控TGF-β的靶效應(yīng)，從而具有潛在的治療價(jià)值[15]。已有研究證實(shí)[16]，SARA通過調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞Smad2和Smad3的激活來調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的EMT和ECM排泄，以此推論SARA可能在EMT前狀態(tài)下成為潛在的新型靶標(biāo)，以改善在慢性腎臟疾病中發(fā)現(xiàn)的腎纖維化。

本實(shí)驗(yàn)選用陽性對照藥物氯沙坦，能減少蛋白尿，阻斷腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展，改善慢性腎臟病的預(yù)后，是目前臨床上運(yùn)用明確有效的降壓保腎藥物[17，18]。前期的研究顯示[19]：氯沙坦具有使Smad7 mRNA的表達(dá)增加，干預(yù)了TGF-β1/Smads信號通路的傳遞，延緩了腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，在正常腎組織，Smad2和P-smad2蛋白呈低水平表達(dá)，在模型組中的表達(dá)均增加，提示Smad2蛋白參與了腎臟纖維化的過程；各治療組的Smad2和P-smad2蛋白的表達(dá)低于模型組，提示藥物治療能降低Smad2和P-smad2蛋白的表達(dá)。SARA蛋白在正常腎組織高水平表達(dá)，在腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織中的表達(dá)均減少，各治療組的SARA蛋白的表達(dá)高于模型組。由此可以推測，慢腎康寧可能是通過降低Smad2和P-smad2蛋白及升高SARA蛋白的表達(dá)，抑制TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路，減少ECM的進(jìn)行性積聚，從而延緩腎纖維化進(jìn)程。