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    西藏大花紅景天RcCATs與RcSODs基因克隆及功能分析

    2022-10-14 04:04:30王宏鵬李一丹滕彥嬌陳成彬張力鵬
    廣西植物 2022年9期
    關(guān)鍵詞:大花紅景天酵母

    王宏鵬, 李一丹, 滕彥嬌, 陳成彬, 張力鵬

    (南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,天津 300071)

    大花紅景天()是一種多年生草本植物,為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(),主要分布于我國(guó)的青藏高原及其毗鄰一帶,包括西藏、云南和四川等地。中國(guó)藥典記載大花紅景天干燥根及根莖中含有多種活性成分,如紅景天苷、酪醇及其衍生物,具有益氣活血,通脈平喘的功能。現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究證明,大花紅景天根部浸出液能夠保護(hù)神經(jīng),治療抑郁、焦慮和癌癥等多種疾病(Qu et al., 2012; Yuan et al., 2020)。但是,因其常伴有寒冷、低氧、強(qiáng)紫外照射等環(huán)境特點(diǎn),主要分布于海拔3 500 ~5 000 m的山坡草地和大塊石灰?guī)r的縫隙中,生長(zhǎng)環(huán)境較為嚴(yán)酷,使得大花紅景天的采集和研究應(yīng)用都十分困難(Fu et al., 2017)。目前,分子生物學(xué)研究多集中于大花紅景天活性成分及其種質(zhì)資源多樣性研究,關(guān)于其生境適應(yīng)性的分子機(jī)制,尚缺乏豐富的報(bào)道(Ma et al., 2007; Gyorgy et al., 2009)。

    為了進(jìn)一步研究和基因家族的功能,本研究以西藏大花紅景天為材料,對(duì)ROS途徑中的CAT和SOD基因家族成員進(jìn)行克隆,基于在線軟件和實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)其生物信息學(xué)和特異性表達(dá)進(jìn)行分析,并構(gòu)建和1的酵母表達(dá)載體與酵母雙雜交誘餌載體,分別進(jìn)行酵母脅迫分析和篩選擬南芥酵母文庫(kù)中的互作蛋白,以揭示西藏大花紅景天對(duì)其高原惡劣環(huán)境適應(yīng)的分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    研究材料為西藏大花紅景天,于2015年7月采集自西藏地區(qū)米拉山山脈(海拔4 868.4 m、92.34° E、29.78° N)。經(jīng)南開大學(xué)宋文芹教授鑒定為景天科藥用植物大花紅景天。部分材料經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃;其余材料以葉片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得無菌再生苗并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 基因序列擴(kuò)增、和基因序列來源于本實(shí)驗(yàn)室已完成的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),基于拼接的unigene注釋信息,分別以CAT和SOD為關(guān)鍵詞對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,獲得、和序列,然后根據(jù)所獲得的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增全長(zhǎng),以大花紅景天葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后與pMD19-T vector連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在氨芐抗性平板上進(jìn)行篩選,經(jīng)菌液PCR和電泳檢測(cè)后,挑選陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。

    1.2.2 總RNA提取與cDNA第一條鏈的合成 總RNA提取依照改良CTAB-異丙醇法進(jìn)行(張力鵬等, 2017)。利用可見光分光光度計(jì)NanoDrop 1 000檢測(cè)RNA的純度和濃度,并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。cDNA第一條的合成利用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(Takara, Japan),采用50 μL體系,反轉(zhuǎn)錄總RNA量為5 μg RNA。將反轉(zhuǎn)產(chǎn)物用無菌dd HO稀釋10倍后-20 ℃保存。

    1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過生物信息學(xué)在線網(wǎng)站對(duì)獲得的、和基因氨基酸序列進(jìn)行分析。利用Blastx(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blastx)進(jìn)行序列驗(yàn)證;利用ORF Finder(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)獲得編碼框;利用BlastP尋找同源基因(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov);利用DNAMAN計(jì)算、和與各自同源基因的同源性比值;利用ProtComp分析基因的亞細(xì)胞位置(http://linux1.softberry.com/);利用TMHMM Server, v. 2.0分析基因的跨膜結(jié)構(gòu)域有無(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);利用ExPASy預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)(https://web.expasy.org/protparam/) (張世鑫等, 2021; 解盛等, 2021)。

    1.2.4 基因表達(dá)分析 組織特異性表達(dá)分析,采用同一株組培苗的根、莖、葉三個(gè)器官。非生物脅迫采用低溫誘導(dǎo),將處于同一生長(zhǎng)時(shí)期的組培苗浸于冰水混合物中黑暗脅迫處理0、3、7 d。植物激素脫落酸(ABA)誘導(dǎo),將同一生長(zhǎng)時(shí)期的組培苗浸于含有50 μmol·LABA的MS液體培養(yǎng)基中,黑暗處理6、24、36 h,每個(gè)處理均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。脅迫處理后,所有材料均經(jīng)無菌水洗凈并擦干后于液氮速凍,-80 ℃超低溫保存。脅迫處理材料的葉片用于提取總RNA(張力鵬等, 2019)。

    1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR 采用Bio-Rad公司熒光定量PCR儀iQ5進(jìn)行qRT-PCR,檢測(cè)目的基因在不同組織和不同脅迫條件下表達(dá)水平。反應(yīng)體系為20 μL,包含10 μL SYBRGreen(Takara, Japan),1 μL cDNA,0.5 μL上下游引物。以為內(nèi)參基因,每個(gè)樣品均采用三次生物學(xué)重復(fù)(Zhang et al., 2018)。

    1.2.6 酵母表達(dá)載體構(gòu)建和脅迫分析 利用無縫克隆法構(gòu)建大花紅景天和1的pYES2.0表達(dá)載體,大腸桿菌陽(yáng)性克隆經(jīng)菌液PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證。將空載質(zhì)粒、重組載體質(zhì)粒按照LiTE/PEG法轉(zhuǎn)入釀酒酵母INVSCI中。分別取INVSCI(pYES2.0、pYES2.0-、pYES2.0-1)單克隆于20 mL含2%葡萄糖的SC/-Ura液體培養(yǎng)基中,30 ℃/180 r·min培養(yǎng)至OD600位于0.5~0.8之間。收集菌體重懸于含2%半乳糖的SC/-Ura液體培養(yǎng)基中,調(diào)整OD600=2.0,30 ℃/180 r·min誘導(dǎo)24 h。將誘導(dǎo)后的陽(yáng)性菌株按照10倍梯度稀釋,取6 μL分別滴于不同YPDA平板中進(jìn)行脅迫處理。脅迫條件為熱脅迫(37 ℃處理1 d)、冷脅迫(-20 ℃處理6 h)、過氧化氫脅迫(YPDA平板中加入0.8、1.6、3.2 mmol·LHO)、鹽脅迫(YPDA平板中加入200、400、600 mmol·LNaCl)、重金屬和堿脅迫(平板中加入5、10 mmol·LCoCl或20 mmol·LNaCO)。將上述平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后拍照(Wang et al., 2008)。

    1.2.7和1自激活鑒定與互作蛋白篩選 酵母雙雜交篩選擬南芥文庫(kù)依Clontech公司Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual說明書進(jìn)行。構(gòu)建和1基因的誘餌載體,通過LiTE/PEG法轉(zhuǎn)化Y2H Gold菌株;經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證陽(yáng)性菌并進(jìn)行自激活和毒性驗(yàn)證,以排除基因本身對(duì)雜交結(jié)果的影響;進(jìn)行文庫(kù)篩選,將誘餌載體與文庫(kù)混合后涂布于SD/-Trp-Leu-His+β-gal培養(yǎng)基進(jìn)行初篩,挑選藍(lán)斑菌落搖菌提取質(zhì)粒;利用T7/3’AD進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序,根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定基因;將比對(duì)后的陽(yáng)性克隆,正對(duì)照pGBKT7-53+pGADT7-T,負(fù)對(duì)照pGBKT7-(1)+pGADT7分別滴于SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu+β-gal培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)3 d后拍照(Zhang et al., 2018)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大花紅景天RcCATs和RcSODs基因的鑒定與克隆

    因大花紅景天沒有參考基因組信息,同時(shí)NCBI網(wǎng)站公布的有關(guān)紅景天屬基因序列多為DNA條形碼。因此,為解決其基因序列的缺乏,本實(shí)驗(yàn)室對(duì)西藏大花紅景天進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過拼接技術(shù)獲得unigenes序列并進(jìn)行功能注釋。最終得到2條編碼過氧化氫酶CAT的基因分別命名為和1,得到3條編碼超氧化物歧化酶SOD的基因分別命名為1、2、3,1條編碼超氧化物歧化酶的銅伴侶的基因。

    根據(jù)各基因unigenes序列分別設(shè)計(jì)引物,以大花紅景天葉片cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見圖1。由圖1可知,和1基因長(zhǎng)度均為1 479 bp,編碼為492個(gè)氨基酸,分子量稍有不同,RcCAT為56 701.04 Da,RcCAT1為56 818.29 Da。1和2基因編碼Cu/Zn SOD,核苷酸大小為471/669 bp,編碼156/222個(gè)氨基酸,分子量為16 070.12/21 870.7 Da;3基因編碼Fe SOD,核苷酸數(shù)量為804 bp,可編碼267個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為30 816.31 Da?;虼笮? 008 bp,編碼335個(gè)氨基酸。

    圖 1 大花紅景天CAT、SOD、CCS基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 1 PCR amplification electrophoresis result of CAT, SOD, CCS genes of Rhodiola crenulata

    2.2 大花紅景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因生物信息學(xué)分析

    對(duì)大花紅景天、和基因的氨基酸序列進(jìn)行分析,通過在線BlastP比對(duì),獲得NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源基因,利用DNAMAN計(jì)算各自基因與其同源基因的序列相似度,并利用多個(gè)在線網(wǎng)站基于其氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,6個(gè)基因與其同源基因的序列一致性在60%以上,基因最高(95.51%),基因最低(66.37%), 各自同源基因均為雙子葉植物, 且尚未下載到景天科紅景天屬的相關(guān)序列。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示1和3蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)高于7.0,其余4個(gè)基因均為酸性蛋白質(zhì),其中的等電點(diǎn)最低,為5.7。脂溶指數(shù)均在70%以上,其中1和2較高,分別為91.86和88.93,說明其為明顯的脂溶性蛋白??偲骄H水性除2(0.085)外,其他均為負(fù)值,說明其具有一定的親水性。此外,對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域和其發(fā)揮生物學(xué)功能的主要亞細(xì)胞位置進(jìn)行分析,結(jié)果顯示6個(gè)基因均無跨膜結(jié)構(gòu)域,定位于過氧化物酶體,1和2定位于細(xì)胞質(zhì),3和定位于線粒體。蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示6個(gè)基因均具有可磷酸化氨基酸位點(diǎn),說明其可能受到蛋白磷酸激酶的調(diào)控(表1)。利用MEGA7.0構(gòu)建和的N-J進(jìn)化樹,結(jié)果顯示基因與棉花()的遺傳距離最近,而1與所列物種的CAT基因遺傳距離較遠(yuǎn)。1與獼猴桃()最近,2與甜瓜()最近,3與西葫蘿()、苦瓜()遺傳距離最近(圖2)。

    表 1 大花紅景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因序列信息Table 1 RcCATs, RcSODs and RcCCS gene sequence information in Rhodiola crenulata

    圖 2 RcCATs和RcSODs基因的N-J進(jìn)化樹Fig. 2 N-J phylogentic tree of RcCATs and RcSODs

    2.3 RcCATs、RcSODs和RcCCS基因組織特異性表達(dá)模式

    因不同基因發(fā)揮其分子功能的部位不同,基因常具有組織器官表達(dá)特異性。利用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)、和基因的mRNA在三個(gè)組織部位(根、莖、葉)的表達(dá)水平,可進(jìn)一步了解各基因在大花紅景天生長(zhǎng)周期內(nèi)所扮演的角色。結(jié)果顯示基因的兩個(gè)成員在不同組織的表達(dá)水平差異很大,相比于根組織,在葉片中表達(dá)量最高呈2.5倍的顯著差異,莖中的表達(dá)稍低,約為0.6左右;而1在葉片和莖中表達(dá)均較低,僅為根中的1/5?;虻谋磉_(dá)模式十分相似,即在根與莖中表達(dá)量相近而遠(yuǎn)低于葉中的表達(dá)量,如1在葉片中表達(dá)量是根莖中的2倍,2可達(dá)4倍左右;3基因在葉片中超表達(dá)是根的6.7倍,莖的3.7倍?;虻谋磉_(dá)模式與2相似,在葉片中高表達(dá)是根/莖組織的3.5倍左右(圖3)。

    A. 根; B. 葉; C. 莖。*表示顯著性差異(P<0.05); **表示極顯著性差異(P<0.01)。下同。A. Root; B. Leaf; C. Stem. * indicates significant differences (P<0.05); ** indicates extremely significant differences (P<0.01). The same below.圖 3 大花紅景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因組織特異性表達(dá)模式圖Fig. 3 Expression pattern graph of RcCATs, RcSODs and RcCCS tissue-specificity

    2.4 冷脅迫與植物激素ABA誘導(dǎo)下RcCATs、RcSODs和RcCCS基因表達(dá)模式

    大花紅景天生長(zhǎng)的環(huán)境惡劣,主要表現(xiàn)為溫度較低,而低溫會(huì)降低呼吸作用和光合作用速率,同時(shí)誘發(fā)產(chǎn)生大量活性氧,以阻礙植物的生長(zhǎng)發(fā)育。因此對(duì)大花紅景天組培苗進(jìn)行了低溫脅迫處理,以進(jìn)一步分析、和基因在低溫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式變化。結(jié)果顯示基因隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的上調(diào)趨勢(shì),尤其是的表達(dá)量較對(duì)照組提高2倍左右;相反3個(gè)基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì),僅2在脅迫第7天時(shí)有微弱的上調(diào)趨勢(shì),且與基因的表達(dá)模式一致。

    植物內(nèi)源激素脫落酸(abscisic acid,ABA)作為一種廣泛應(yīng)答脅迫的信號(hào),在調(diào)節(jié)植物體內(nèi)平衡以及提高脅迫耐受性方面發(fā)揮重要的作用,因此本研究繪制了大花紅景天、和基因在不同ABA處理時(shí)間下的表達(dá)譜。結(jié)果顯示的兩個(gè)成員表達(dá)變化完全不同,在脅迫24 h時(shí)下調(diào)表達(dá)相比于對(duì)照組下降5倍以上;1上調(diào)表達(dá)為對(duì)照組的6倍左右?;虻?個(gè)成員中,1隨ABA脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而下調(diào)表達(dá)僅為對(duì)照組的40%,2和3表現(xiàn)出先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)。此外,基因的表達(dá)模式與2一致,即24 h下調(diào)表達(dá),36 h上調(diào)表達(dá)(圖4)。

    圖 4 大花紅景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因響應(yīng)低溫和ABA脅迫表達(dá)水平Fig. 4 Expression levels of RcCATs, RcSODs and RcCCS genes under cold and ABA treatment conditions by qRT-PCR

    2.5 RcCAT和RcSOD1的酵母異源表達(dá)與脅迫分析

    為進(jìn)一步分析和基因在調(diào)節(jié)大花紅景天應(yīng)對(duì)高原惡劣環(huán)境時(shí)的生理意義,我們分別構(gòu)建了和1的pYES2.0重組載體,并轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌株INVSCI中(圖5)。由圖5可知,在6種脅迫下,轉(zhuǎn)pYSE2.0空載的酵母菌株生長(zhǎng)的數(shù)量、菌斑大小和生命能力均不如和1基因的陽(yáng)性菌株。低溫處理6 h后,空載菌株已失去了生活能力,而對(duì)和1菌株影響較??;過氧化氫能夠明顯抑制酵母生長(zhǎng),空載菌株在1.6、3.2 mol·L時(shí)已基本失去了細(xì)胞活性,但異源表達(dá)和1的菌株仍可在細(xì)胞濃度較高時(shí)具備一定的生命能力;對(duì)于不同濃度的鹽脅迫而言,對(duì)空載菌株的影響非常大,而對(duì)和1菌株影響較??;同樣,重金屬和NaCO脅迫也對(duì)陽(yáng)性菌株影響較低。

    圖 5 過表達(dá)RcCAT和RcSOD1基因的酵母非生物脅迫誘導(dǎo)分析Fig. 5 Yeast abiotic stress induction analysis of RcCAT and RcSOD1 overexpressions

    2.6 RcCAT和RcSOD1互作蛋白的篩選

    為了進(jìn)一步研究和基因的功能,分別對(duì)和1基因進(jìn)行克隆,并篩選擬南芥文庫(kù)。首先驗(yàn)證其自激活活性和細(xì)胞毒性。如圖6所示,轉(zhuǎn)化pGBKT7-和pGBKT7-1的酵母細(xì)胞均在SD/-Trp培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng),但在SD/-Trp-His培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng),負(fù)對(duì)照pGBKT7在SD/-Trp-His培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng),正對(duì)照在SD/-Trp-His培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),表明RcCAT和RcSOD1蛋白均沒有自主激活活性和細(xì)胞毒性。

    圖 6 RcCAT和RcSOD1基因酵母自激活和毒性驗(yàn)證Fig. 6 Transcription activity and toxicity detection of RcCAT and RcSOD1

    通過擬南芥酵母文庫(kù)篩選和點(diǎn)對(duì)點(diǎn)滴板驗(yàn)證,篩選到了4個(gè)與互作明顯的基因,分別為(AT3G19860)、2(AT2G23070)、4(AT5G50750)和1(AT3G08850)(圖7);3個(gè)與1互作明顯的基因,分別是(AT5G11890)、2(AT1G52030)和8(AT4G00660)(圖8)。擬南芥文庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的基因功能描述見表2。

    圖 7 RcCAT互作蛋白驗(yàn)證Fig. 7 Validation of interaction proteins for RcCAT

    圖 8 RcSOD1互作蛋白驗(yàn)證Fig. 8 Validation of interaction proteins for RcSOD1

    表 2 RcCAT和RcSOD1基因互作基因信息Table 2 Interaction genes function information of RcCAT and RcSOD1

    3 討論與結(jié)論

    活性氧作為植物體內(nèi)源分子,一方面在正常條件下可由光合作用和呼吸作用中電子傳遞鏈產(chǎn)生;另一方面當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變時(shí)會(huì)引起生物膜系統(tǒng)或電子傳遞鏈的損傷,從而誘發(fā)產(chǎn)生大量ROS,對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷,因此ROS作為信號(hào)分子可直接參與植物對(duì)脅迫的應(yīng)答。本研究中,共分離了ROS清除途徑中的2條CAT酶基因、3條SOD酶基因和1條SOD銅伴侶基因。組織表達(dá)特異性分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明基因主要在葉片中大量表達(dá),亞細(xì)胞位置定位于過氧化物酶體,并受到低溫脅迫誘導(dǎo)大量表達(dá),這與羊茅1基因亞細(xì)胞定位于過氧化物酶體,其在冷處理的葉片中被顯著誘導(dǎo)(楊文龍等, 2006)以及表達(dá)小麥CAT基因的水稻提高了對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答(Matsumura et al., 2002)等的研究結(jié)果一致。同時(shí),F(xiàn)aCAT1是一種ⅰ型過氧化氫酶,有報(bào)道稱ⅰ型過氧化氫酶在葉片中高度表達(dá)并參與清除光呼吸中HO的去除(Willekens et al., 1995)。因此,基因可能共同參與了大花紅景天光呼吸作用和對(duì)外界脅迫的應(yīng)答。此外,2和基因在組織表達(dá)特異性、低溫或ABA脅迫誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)模式十分相近,推測(cè)可能特異性將銅離子傳遞給2,將其激活生成有活性的酶分子(Yamasaki et al., 2009)。經(jīng)同源序列比對(duì),1和2雖均編碼Cu/Zn SOD,3編碼Fe SOD,但1在低溫下的表達(dá)模式與3相似,在ABA誘導(dǎo)下的表達(dá)模式與2有所差異。劉家林等人報(bào)道的水稻基因也存在類似的情況,即同一類型基因在同一逆境下的表達(dá)量也有所不同(劉家林等, 2018),說明在大花紅景天體內(nèi)均可將超氧陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫,但存在功能上的冗余和分歧。

    通過構(gòu)建表達(dá)載體pYES2.0,將和1基因異源過表達(dá)于釀酒酵母菌株INVSCI中,并以空載質(zhì)粒作為對(duì)照,分析其在不同處理下細(xì)胞生長(zhǎng)的水平,結(jié)果可見和1均可應(yīng)對(duì)冷、熱、鹽、堿、HO、重金屬等脅迫壓力,班巧英等(2008)將紫桿檉柳MnSOD基因轉(zhuǎn)入酵母,也提高了酵母抵抗鹽、堿和紫外線脅迫的能力。因此,推測(cè)兩個(gè)基因在大花紅景天體內(nèi)可能直接參與ROS分子的清除并協(xié)助其應(yīng)對(duì)復(fù)雜的外界環(huán)境,同時(shí),進(jìn)一步證實(shí)了CAT和SOD基因能夠廣泛參與植物的非生物脅迫以維持體內(nèi)ROS含量的平衡(陳金峰等, 2008; 劉家林等, 2018)。此外,酵母雙雜交也篩選到基因的互作基因如121,該基因?yàn)閎HLH類轉(zhuǎn)錄因子,在鐵元素缺乏時(shí)可引起磷酸化,繼而誘導(dǎo)HLH38/39/100/101基因表達(dá),這些轉(zhuǎn)錄因子反過來與FIT二聚化驅(qū)動(dòng)IRT1和FRO2的基因的轉(zhuǎn)錄以增加鐵的攝取(Lei et al., 2020)。另一互作基因2為質(zhì)體酪蛋白激酶2,是葉綠體基質(zhì)蛋白特異性Ser/Thr磷酸化酶,其活性可受到氧化還原信號(hào)調(diào)控,并可參與ABA調(diào)控?cái)M南芥種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)(Wang et al., 2014; Kim et al., 2016)。說明或1也可通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)代謝網(wǎng)絡(luò),但其調(diào)控機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

    大花紅景天的生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆基因的表達(dá)密切相關(guān)。本研究已對(duì)大花紅景天ROS途徑中2個(gè)關(guān)鍵基因和進(jìn)行分離和分析。分析表明,大花紅景天的和基因家族在進(jìn)化過程中發(fā)生了分化,并廣泛參與調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)等代謝途徑。這種發(fā)現(xiàn)有利于了解大花紅景天應(yīng)對(duì)高原惡劣環(huán)境的適應(yīng)性,在隨后的研究中借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)其生境適應(yīng)性機(jī)制進(jìn)行深入研究,有望實(shí)現(xiàn)大花紅景天的人工引種馴化和規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化種植,同時(shí)提高研究人員對(duì)高原植物生長(zhǎng)繁衍的認(rèn)知。

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