云南三種特色柑橘屬果皮精油成分及活性研究

李 漁， 陳 波， 施建蓮， 馬海玲， 習(xí)楊彥彬， 劉 佳*

( 1. 昆明醫(yī)科大學(xué) 海源學(xué)院， 昆明 650101； 2. 云南省藥品評價中心， 昆明 650101； 3. 昆明醫(yī)科大學(xué) 科技成果孵化中心， 昆明 650500； 4. 云南新興職業(yè)學(xué)院， 昆明 650501； 5. 昆明醫(yī)科大學(xué) 神經(jīng)科學(xué)研究所， 昆明 650500 )

蕓香科柑橘屬(L.)植物常稱柑橘。中國是柑橘發(fā)源中心之一，種植歷史久遠，栽培面積居世界前列(方德秋, 1993)。柑橘屬植物是柑橘類果實的重要來源，包括具有重要經(jīng)濟價值的物種橙()、柚()、柑()、檸檬 ()等(方德秋, 1993)。雖然柑橘的果皮具有重要藥用價值，但僅一部分得到利用(葉蔭民,2010)。同時，果皮精油(張薇等,2005)也是柑橘屬植物重要的特征性指標(黃遠征等, 1998)，其開發(fā)利用能提高其附加值(丁曉波等，2012；樊二齊等，2012)，從而推動云南貧困地區(qū)的脫貧致富。

云南西雙版納曼賽龍柚 (cv. Mansailong)，是中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園研究人員60年前從西雙版納勐臘縣勐捧鎮(zhèn)曼賽龍村的實生柚培育出的優(yōu)良品種，其果實扁球形或近球形,果肉紅色艷麗、細嫩化渣、酸甜適宜, 含豐富的維生素C等營養(yǎng)物質(zhì)。云南元江綠皮冰糖橙(Osbeck)是中國唯一的綠皮冰糖橙(曾柏全等，2003)，成熟果實中含有豐富的氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸等17種人體必需的氨基酸。云南德宏青檸()，又稱來檬，其成熟果實為黃綠色，有球形、橢球形或倒卵形，可作為天然香料、食品添加劑和保健品、藥品、化妝品等的原料。國內(nèi)外學(xué)者對柑橘屬植物包括柑橘、柚、橙、檸檬等果肉進行了研究，從中發(fā)現(xiàn)黃酮類、香豆素、檸檬苦素、胡蘿卜素類等天然小分子化合物，部分化合物具有顯著抗腫瘤活性(丁曉波等，2012)。然而，西雙版納曼賽龍柚、元江綠皮冰糖橙、德宏青檸的果皮精油成分的相關(guān)研究仍鮮有報道，尤其是西雙版納曼賽龍柚，并且三者的精油成分相關(guān)活性研究目前尚未見有報道(王毓煒等，2008)。

本研究選取云南近年來高產(chǎn)熱銷的西雙版納曼賽龍柚、元江綠皮冰糖橙、德宏青檸作為材料，對其果皮中提取的精油進行研究，分析其精油的產(chǎn)油率、化學(xué)成分差異，探討其香氣成分及抗腫瘤活性，為云南三種特色柑橘屬植物的應(yīng)用及開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和具科學(xué)價值的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

云南西雙版納曼賽龍柚，2016年11月購自中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園曼賽龍柚種植示范基地；云南元江綠皮冰糖橙，2016年11月購自元江縣哀牢山綠皮冰糖橙種植示范基地；云南德宏青檸，2017年7月購自云南德宏州青檸種植示范基地。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：購自美國Perkin Elmer公司，型號為CLARUS 600 GC-MS。酶聯(lián)免疫檢測儀(酶標儀)：購自美谷分子儀器有限公司，型號為SpectraMax M5。移液槍：購自艾本德(eppendorf)公司。

1.2 方法

1.2.1 精油提取 將所購曼賽龍柚、綠皮冰糖橙和青檸各取果皮1 000 g，用水洗凈、晾干，分2次置于圓底燒瓶中，加超純水1 000 mL，連接揮發(fā)油測定器和球形冷凝管，保持水沸騰穩(wěn)定產(chǎn)生蒸汽，連續(xù)提取9 h。加熱停止后，收集精油，以10 mL乙醚沖洗精油，并將提取液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，充分搖勻后靜置分層，收集乙醚層，加入無水NaSO干燥，低溫回收乙醚得到淡黃色透明液態(tài)精油，用以氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.2.2 GC-MS聯(lián)用儀分析 氣相色譜工作條件：毛細管柱DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氦(純度≥99.999%)，流速為1.0 mL·min；進樣方式為分流進樣，進樣量為1 μL，分流比為30∶1。程序升溫條件：首先，初始溫度50 ℃，保持5 min；然后，2 ℃·min升至80 ℃，3 ℃·min升至230 ℃，保持16 min；最后，12 ℃·min升至250 ℃，保持20 min。

質(zhì)譜工作條件：電離方式為EI；離子化電壓為70 eV；掃描范圍為35～450 amu；離子源溫度為230 ℃；傳輸線溫度為260 ℃；在WILEY、NIST08譜庫進行譜圖檢索。

1.2.3 抗瘤活性測定

1.2.3.1 細胞培養(yǎng)與培養(yǎng)基 人乳腺癌細胞(MCF-7)、結(jié)直腸癌細胞(HCT-116)、胃癌細胞(MKN-45)3株細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。1640培養(yǎng)基、McCoy5A 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)均購自GIBCO有限公司，噻唑藍(MTT)購自炎熙生物，二甲基亞砜(DMSO)購自索萊寶公司。

1.2.3.2 用MTT法檢測三種精油抗腫瘤活性 取對數(shù)生長期細胞用胰蛋白酶消化后，用細胞完全培養(yǎng)液每1 mL稀釋至1×10個，接種于 96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔90 μL。在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，待細胞貼壁后，實驗組按倍半稀釋法設(shè)置 5 個不同濃度精油(15、30、60、120、200 μg·mL)，每孔加入10 μL的精油，同時設(shè)置陰性對照組和正常對照組，每組 5 個復(fù)孔。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT(5 mg·mL)溶液 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 100 mL DMSO使結(jié)晶充分溶解，用酶標儀測定在570、630 nm雙波長下各孔的吸光度()值，計算各藥物濃度對腫瘤細胞生長抑制率。腫瘤細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組值陰性對照組值)×100。用graphpad prism 5軟件計算半數(shù)抑制濃度(IC)。半數(shù)抑制濃度(IC) 是衡量藥物抑制腫瘤增殖能力的標準之一(劉夢瑤等，2019)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種云南特色柑橘屬果皮精油產(chǎn)率對比

德宏青檸的果皮精油出油率最高，為0.72%；元江綠皮冰糖橙的次之，為0.59%；西雙版納曼賽龍柚的最低，為0.51%。

2.2 三種云南特色柑橘屬果皮精油組分分析

根據(jù)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀，獲得三種精油樣品的總離子流色譜(圖1，圖2，圖3)，將其與計算機質(zhì)譜庫匹配，進行人工解析后確定精油樣品化學(xué)組分的名稱，并采用峰面積歸一法計算出各組分含量(趙文紅等，2007)(表1，表2，表3)。

圖1 西雙版納曼賽龍柚精油樣品的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion flow chromatogram of Citrus maxima cv. Mansailong peel essential oil samples

圖 2 元江綠皮冰糖橙精油樣品的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatogram of Citrus sinensis Osbeck peel essential oil samples

圖 3 德宏青檸果皮精油樣品的總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion chromatogram of Citrus aurantiifolia peel essential oil samples

表 1 西雙版納曼賽龍柚精油樣品組分分析Table 1 Component analysis of essential oil samples from Citrus maxima cv. Mansailong peel

表 2 元江綠皮冰糖橙精油樣品組分分析Table 2 Component analysis of essential oil samples from Citrus sinensis Osbeck peel

表 3 德宏青檸果皮精油樣品組分分析Table 3 Component analysis of essential oil samples from Citrus aurantiifolia peel

本研究發(fā)現(xiàn)西雙版納曼賽龍柚、元江綠皮冰糖橙、德宏青檸的精油成分比較復(fù)雜，并且其所含的多種成分具有重要的藥用價值和化學(xué)工業(yè)價值，如三種植物的果皮共有成分月桂烯、萜品烯。通常情況下，大多數(shù)植物中月桂烯的含量很少(郝靜梅等,2017)，滿足不了香料工業(yè)的需求，國際上主要依靠-蒎烯的裂解(甘芝霖等，2019)，而-蒎烯在西雙版納曼賽龍柚和元江綠皮冰糖橙果皮精油中含量分別為0.255%和0.558%。近年來，月桂烯被廣泛用于合成香茅醛、l-薄荷醇、新鈴蘭醛和龍涎酮等名貴香料產(chǎn)品和有機合成中間體(楊陽等,2012；何金洞,2012)。據(jù)最新研究報道，萜品烯具有成為天然抗氧化劑的潛力，有望基于此開發(fā)各類抗氧化藥物和保健品。此外， 西雙版納曼皮精油中有13種，其中化合物種類含量高低排序為烯烴>醛>(環(huán))烷烴>醇。

2.3 西雙版納曼賽龍柚果皮精油抑瘤活性測定

不同濃度的西雙版納曼賽龍柚果皮精油對胃癌細胞(MKN-45)、人乳腺癌細胞(MCF-7)和結(jié)直腸癌細胞(HCT-116)的增殖有不同程度的抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系(圖4)，半數(shù)抑制濃度(IC)分別為44.14、54. 69、39. 10 μg·mL。

圖 4 西雙版納曼賽龍柚果皮精油對腫瘤細胞抑制的量效關(guān)系Fig. 4 Dose-effect relationship of Citrus maxima cv. Mansailong peel essential oil on tumor cell inhibition

2.4 元江綠皮冰糖橙皮精油抑瘤活性測定

不同濃度的元江綠皮冰糖橙皮精油對胃癌細胞(MKN-45)、人乳腺癌細胞(MCF-7)和結(jié)直腸癌細胞(HCT-116)的增殖有不同程度的抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系(圖5)，半數(shù)抑制濃度(IC)分別為72.76、67. 70、68. 25 μg·mL。

圖 5 元江綠皮冰糖橙皮精油對腫瘤細胞抑制的量效關(guān)系Fig. 5 Dose-effect relationship of Citrus sinensis Osbeck peel essential oil on tumor cell inhibition

2.5 德宏青檸果皮精油抑瘤活性測定

不同濃度的德宏青檸果皮精油對胃癌細胞(MKN-45)、人乳腺癌細胞(MCF-7)和結(jié)直腸癌細胞(HCT-116)的增殖有不同程度的抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系(圖6)，半數(shù)抑制濃度(IC)分別為87.90、69.39、65. 74 μg·mL。

圖 6 德宏青檸果皮精油對腫瘤細胞抑制的量效關(guān)系Fig. 6 Dose-effect relationship of Citrus aurantiifolia peel essential oil on tumor cell inhibition

3 討論與結(jié)論

從通過GC-MS開展定性定量成分分析可以看出，西雙版納曼賽龍柚果皮精油中含有24種含量在0.01%以上的化學(xué)成分，其中化合物種類含量高低排序為酯>烯烴>醛>(環(huán))烷烴>醇>酚、萘；元江綠皮冰糖橙皮精油中有11種，其中化合物種類含量高低排序為烯烴>(環(huán))烷烴>醇； 德宏青檸果賽龍柚和元江綠皮冰糖橙果皮精油中都含有3，7-二甲基-1,6辛二烯-3-醇和活性物質(zhì)檸檬烯，并且檸檬烯在西雙版納曼賽龍柚果皮精油中含量高達72.097%。檸檬烯在美國食用香料與提取物制造商協(xié)會認為其毒性屬于GRAS級(連建偉等,2001)，還有在體外對諸如李斯特菌、青霉菌、綠霉菌和黃曲霉菌等真菌(李泰然,2003)、熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌兩種食源性致病菌均存在抑菌效果(郭苗苗等,2013)。

此外，本研究為國內(nèi)首次對西雙版納曼賽龍柚、元江綠皮冰糖橙、德宏青檸果皮揮發(fā)油進行體外抗腫瘤活性研究，并發(fā)現(xiàn)對胃癌細胞(MKN-45)、人乳腺癌細胞(MCF-7)和結(jié)直腸癌細胞(HCT-116)具有一定的抗腫瘤細胞增殖活性(楊麗華等,2020)。本研究結(jié)果可以為西雙版納曼賽龍柚、元江綠皮冰糖橙、德宏青檸果皮在食品、保健食品、化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，有助于柑橘屬果皮的利用，以及變廢為寶提高其附加值(趙文紅等,2009)。