不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲對溫度脅迫的耐受性

彭思源, 喻 曼, 丁 中, 陽祝紅, 葉 姍*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 長沙 410128; 2. 湖南省慈利縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 張家界 427200)

擬禾本科根結(jié)線蟲Meloidogynegraminicola已成為亞洲水稻生產(chǎn)上最重要的限制性生物因素之一,可在廣泛的水稻生態(tài)系統(tǒng)包括灌溉水稻和雨養(yǎng)水稻生態(tài)系統(tǒng)、低地水稻和高地水稻生態(tài)系統(tǒng)、深水水稻和熱帶需氧水稻生態(tài)系統(tǒng)對水稻產(chǎn)量造成嚴重的經(jīng)濟損失[1-4]。該線蟲主要分布于亞洲、熱帶美洲以及南非、馬達加斯加[5]和南歐的意大利[6]等水稻種植區(qū)。我國自2001年在海南發(fā)現(xiàn)該線蟲以來[7],廣東、廣西、福建、湖南、江西、湖北、江蘇、浙江、河南等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該線蟲的分布,且發(fā)生和危害面積逐年增加,危害日益嚴重[8-10]。在如此廣泛的地理分布空間,擬禾本科根結(jié)線蟲作為變溫動物,不同地理群體對溫度可能存在不同的耐受性。對溫度的耐受性和適應(yīng)性是生物應(yīng)對氣候變化并在環(huán)境溫度變化的條件下生存所必須具備的能力[11]。同時溫度脅迫也是種群適應(yīng)性反應(yīng)的進化動力, 物種對不同溫度脅迫的適應(yīng)必然會導(dǎo)致種的分化[12]。

已有的根結(jié)線蟲對溫度的適應(yīng)性研究表明,不同地理區(qū)域的根結(jié)線蟲對冷凍具有不同的耐受性:北方根結(jié)線蟲M.hapla對低溫具有較高的耐受性,主要分布于北方寒冷和南部高海拔地區(qū)[13-14];爪哇根結(jié)線蟲M.javanica耐寒性較差,南方根結(jié)線蟲M.incognita的耐寒性則介于兩種線蟲之間[15]。由于陽光溫室設(shè)施在我國北方的普及,爪哇根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲在我國南、北方均有分布。北方根結(jié)線蟲[16]、松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus[17]、海濱斯氏線蟲Steinernemalitorale[18]以及秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans均可通過冷馴化提高對寒冷的耐受性來提高生存率。有關(guān)擬禾本科根結(jié)線蟲對溫度脅迫的耐受性目前尚無相關(guān)報道。已知擬禾本科根結(jié)線蟲的生活史相對較短,受環(huán)境溫度的影響,不同地理群體的生活史有差異。如孟加拉國的擬禾本科根結(jié)線蟲在22～29℃下完成生活史需19 d[19],美國群體在26℃下完成生活史需要23～27 d[20],我國福建政和群體在夏季26～37℃下完成生活史最短只需要18 d[8]。據(jù)報道擬禾本科根結(jié)線蟲原僅分布在我國南方沿海一帶,現(xiàn)已在長江以北的河南新鄉(xiāng)等多地發(fā)現(xiàn)其發(fā)生和危害[21-22],意味著擬禾本科根結(jié)線蟲可能已經(jīng)對長江以北冬季較低的溫度產(chǎn)生了適應(yīng),適生區(qū)逐漸往北擴展。我國不同緯度的擬禾本科根結(jié)線蟲對溫度的耐受性是否存在差異以及是否可通過冷馴化來適應(yīng)寒冷的環(huán)境目前均還未明確。為此,本試驗采集了河南新鄉(xiāng)、湖南平江、湖南益陽、湖南望城、廣西融安、廣西臨桂、廣東湛江、海南臨高等8個不同緯度的擬禾本科根結(jié)線蟲地理群體,在室內(nèi)研究了不同地理群體2齡幼蟲和卵對溫度的反應(yīng)以及冷馴化對不同地理來源線蟲耐寒性的影響,旨在為全球變暖趨勢下該線蟲病害發(fā)生的預(yù)測預(yù)報、地理群體擴張以及合理防治策略的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本試驗所用的蟲源分別于2020年6月-9月采自河南新鄉(xiāng)(35°27′N,113°46′E)、湖南平江(28°34′N,113°39′E)、湖南望城(28°15′N,112°48′E)、湖南益陽(28°37′N,112°27′E)、廣西融安(25°14′N,109°23′E)、廣西臨桂(25°20′N,110°03′E)、廣東湛江(21°17′N,110°19′E)和海南臨高(19°41′N,109°41′E)的水稻田,寄主為水稻。將具有典型危害狀的水稻根系帶回實驗室后用自來水沖洗干凈,并在體視顯微鏡下剖開根結(jié),收集卵囊,置于無菌清水中30℃黑暗條件下讓其孵化,將孵化的2齡幼蟲接種至種植于Pluronic gel F-127(Sigma)[23]的4葉期水稻根系,置于30℃人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng),光周期 L∥D=16 h∥8 h。接種20 d后收集根結(jié)內(nèi)卵囊并進行孵化,每天收集初孵的2齡幼蟲。取 F1～F3代的卵囊和初孵的2齡幼蟲用于試驗。對各地收集的2齡幼蟲采用特異性引物Mg-F3(5′-TTATCGCATCATTTTATTTG-3′)和Mg-R2 (5′-CGCTTTGTTAGAAAATGACCCT-3′)進行PCR分子鑒定[24],確定供試的各地線蟲均為擬禾本科根結(jié)線蟲。

1.2 方法

1.2.1線蟲卵粒和2齡幼蟲懸浮液的制備

卵粒懸浮液:將接種20 d的水稻根結(jié)剪下并破開,得到新鮮的卵粒懸浮液,于顯微鏡下計數(shù),稀釋至1 000粒/mL。

2齡幼蟲懸浮液:將不同地理種群的新鮮卵粒在30℃黑暗條件下孵化,每天收集獲得初孵2齡幼蟲,于顯微鏡下計數(shù),稀釋至1 000條/mL。

1.2.2溫度對不同地理來源擬禾本科根結(jié)線蟲2齡幼蟲存活的影響

將不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲的初孵2齡幼蟲懸浮液分別置于控溫冰箱(青島海爾股份有限公司,BCD-328WDGF)0、4℃低溫環(huán)境中保存1、3、5、7、10 d,處理結(jié)束后,將線蟲轉(zhuǎn)移至30℃黑暗條件下放置24 h,使其恢復(fù)活性,觀察線蟲死亡情況。同時將未經(jīng)低溫處理的2齡幼蟲直接置于30℃黑暗條件下觀察其死亡情況。分別統(tǒng)計各處理溫度下線蟲的死亡數(shù),計算其死亡率。每處理時間設(shè)置5個重復(fù)。線蟲存活判斷標準:用移液槍吸打數(shù)次,經(jīng)物理刺激后,在顯微鏡下觀察,能進行較強的卷曲和伸展運動的、頭部有輕微卷曲,或尾部微弱擺動的線蟲均判為存活線蟲,不動的線蟲判為死亡線蟲。

死亡率=死亡2齡幼蟲數(shù)/總2齡幼蟲數(shù)×100%。

1.2.3溫度對不同地理來源擬禾本科根結(jié)線蟲卵粒孵化的影響

將不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲卵粒懸浮液,置于冰箱0、4℃低溫環(huán)境和37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別保存0、1、3、5、7、10 d。處理結(jié)束后,將線蟲卵粒轉(zhuǎn)移至30℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗條件下孵化,記錄統(tǒng)計20 d的孵化線蟲數(shù)和未孵化卵粒數(shù),計算卵粒孵化率。每處理設(shè)置5個重復(fù),試驗重復(fù)3次。

孵化率=孵化的2齡幼蟲數(shù)/總卵粒數(shù)×100%。

1.2.4低溫預(yù)處理對線蟲低溫適應(yīng)性的影響

取100 μL孵化5 d的2齡幼蟲懸浮液于12孔板,置于4℃低溫處理5 d,再轉(zhuǎn)置于0℃處理5 d,設(shè)為4℃預(yù)處理組。未經(jīng)4℃低溫預(yù)處理的線蟲懸浮液30℃下放置5 d后轉(zhuǎn)入12孔板,置于0℃條件下進行低溫處理5 d,為對照組。0℃低溫處理結(jié)束后,將線蟲轉(zhuǎn)移至30℃黑暗條件下24 h,使其恢復(fù)活力,隨后觀察線蟲情況,統(tǒng)計線蟲的存活數(shù),計算其存活率。每個處理設(shè)5個重復(fù)。

存活率=存活的2齡幼蟲數(shù)/總2齡幼蟲數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 20.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲初孵2齡幼蟲存活的影響

由表1可知,不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲初孵2齡幼蟲在30℃下保存均表現(xiàn)出隨保存時間的延長死亡率逐漸增加的趨勢,但保存10 d的死亡率均低于20%。其中保存5 d時,河南新鄉(xiāng)、湖南平江、湖南望城、湖南益陽、廣西融安群體的死亡率均超過10%,廣東湛江、海南臨高群體的死亡率最低,為1.7%;保存7 d,海南臨高群體的死亡率最低,為5.6%,顯著低于除廣東湛江外的其他群體(P<0.05);保存10 d,臨桂和臨高種群死亡率最低,分別為15.0%和15.1%,顯著低于其他群體(P<0.05)。由此可知,緯度較低的海南臨高群體較其他緯度較高的地理群體在30℃下具有較高的存活率。

表1 不同地理來源擬禾本科根結(jié)線蟲2齡幼蟲在30℃下保存不同時間后的死亡率1)

由表2可知,不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲2齡幼蟲對0℃低溫的耐受性較差,隨保存時間的增加均表現(xiàn)出死亡率增加較快、死亡率較高的特點。0℃下保存3 d后,各地理群體2齡幼蟲的死亡率均在20%以上,其中廣西臨桂、廣東湛江、海南臨高群體的死亡率均高于60%,河南新鄉(xiāng)群體的死亡率最低,為24.5%;保存5、7、10 d后,新鄉(xiāng)群體的死亡率仍然最低,分別為59.9%、75.4%和84.2%,融安、臨桂、湛江和臨高群體的死亡率則明顯高于湖南3地群體的死亡率。結(jié)果表明,緯度較高的河南新鄉(xiāng)群體2齡幼蟲對0℃的耐受性最強,湖南平江、望城、益陽3地群體的次之,低緯度的融安、臨桂、湛江、臨高群體2齡幼蟲對0℃的耐受性較差。

由表3可知,不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲2齡幼蟲在4℃下隨保存時間的增加也均表現(xiàn)出死亡率增加較快、死亡率較高的特點,且緯度最高的新鄉(xiāng)群體對4℃的耐受性最強,其保存7 d和10 d后的死亡率最低,分別為56.1%和65.3%,臨高群體的死亡率分別為98.2%、100%,均顯著高于其他地理種群(P<0.05)。上述結(jié)果表明,緯度較高的河南新鄉(xiāng)的2齡幼蟲同樣對4℃的耐受性最強,較低緯度的海南臨高群體的2齡幼蟲對4℃的耐受性最差。

表2 不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲2齡幼蟲在0℃下保存不同時間后的死亡率

表3 不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲2齡幼蟲在4℃下保存不同時間后的死亡率

2.2 溫度對不同地理來源擬禾本科根結(jié)線蟲卵粒孵化的影響

由表4可知,各地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲卵粒在0℃下保存不同時間后,其孵化率均受到不同程度地影響,明顯低于未經(jīng)低溫保存在30℃下的孵化率,且隨著0℃保存時間的延長其孵化率表現(xiàn)出下降的趨勢。其中海南臨高和廣東湛江群體卵的孵化率受0℃低溫抑制最顯著,保存在0℃下1 d的卵孵化率分別為18.5%和26.8%,保存5 d其孵化率分別為2.8%和4.1%,保存10 d后則無孵化。0℃低溫對廣西融安和臨桂群體卵孵化的影響次之,其卵粒在0℃下保存5 d的孵化率分別為25.7%和28.8%,保存10 d的孵化率分別為15.4%和24.7%,均低于湖南平江、望城、益陽和河南新鄉(xiāng)群體。上述結(jié)果表明,0℃低溫對低緯度的海南臨高和廣東湛江群體卵的孵化影響大,對廣西融安和臨桂群體的影響次之,湖南平江、望城、益陽和河南新鄉(xiāng)群體的卵受0℃低溫的影響較小,孵化率較高。

表4 不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲卵粒在0℃下保存不同時間后的孵化率

由表5可知,各地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲卵粒在4℃下保存不同時間后,其孵化率也均受到不同程度地影響,4℃對各地理群體卵孵化率的影響與0℃的影響相似,但總體上對其的影響要小于0℃。在所測試的地理群體中,4℃對海南臨高群體卵的孵化率影響仍然較大,保存在4℃下1、5 d和10 d的卵粒孵化率僅為8.0%、6.9%和1.4%。4℃對廣東湛江群體的卵孵化率影響次之,其保存在4℃下5 d和10 d的卵粒孵化率為13.9%和3.3%。廣西、湖南和河南群體的卵總體上對4℃的耐受性要高于湛江、臨高群體。

由表6可知,在所測試的地理群體中,海南臨高群體的卵對37℃的高溫表現(xiàn)出與其他地理群體不一樣的特性,其保存7 d和10 d后的孵化率分別為72.1%和81.4%,高于未經(jīng)高溫處理在30℃下的孵化率,表現(xiàn)出37℃的高溫處理可刺激其孵化的特性。而其他地理群體的卵粒經(jīng)37℃保存后孵化率均有不同程度的下降,其中卵粒在37℃保存10 d后,廣東湛江、廣西融安和臨桂群體的孵化率為51.0%～68.5%,湖南平江、益陽和望城群體的孵化率為42.9%～55.7%。河南新鄉(xiāng)群體的卵受37℃高溫的影響較大,其保存10 d后的孵化率僅為36.7%。

表5 不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲卵粒在4℃下保存不同時間后的孵化率

表6 不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲卵粒在37℃下保存不同時間后的孵化率

從以上試驗結(jié)果還觀察到,在2齡幼蟲、卵的耐寒性和耐熱性方面,相似緯度的融安和臨桂群體之間以及平江、望城和益陽群體之間也存在一定的差異,但其差異明顯小于緯度差異大的群體之間的變異。

2.3 低溫預(yù)處理對不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲低溫適應(yīng)性的影響

擬禾本科根結(jié)線蟲可通過冷馴化提高其耐寒性。經(jīng)4℃低溫預(yù)處理后湖南平江群體在0℃下保存5 d的存活率最高,為62.4%,其次是新鄉(xiāng)、望城、益陽群體,其存活率為47.4%～55.7%;融安、臨桂、湛江、臨高群體的存活率為10.9%～17.1%(表7)。經(jīng)4℃低溫預(yù)處理后,低緯度海南臨高、廣東湛江和廣西融安、臨桂群體在0℃下的存活率依然明顯低于高緯度湖南平江、望城、益陽和河南群體的存活率,表明4℃低溫預(yù)處理不會改變各群體對低溫耐受性的本質(zhì)。湖南平江、望城、益陽群體通過低溫預(yù)處理后存活率提高最明顯。

表7 不同地理來源擬禾本科根結(jié)線蟲2齡幼蟲經(jīng)4℃低溫預(yù)處理5 d后在0℃下保存5 d的存活率

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明,不同地理來源的擬禾本科根結(jié)線蟲對溫度的耐受性存在差異。從2齡幼蟲的耐寒性來看,高緯度(35°N)的河南新鄉(xiāng)群體的2齡幼蟲對0℃低溫的耐受力最強,湖南平江、望城、益陽3地(28°N)的群體次之,較低緯度的廣西融安、臨桂(25°N)群體,廣東湛江(21°N)、海南臨高(19°N)群體的2齡幼蟲對0℃的耐受性較差,存活率最低;從卵的耐寒性來看,不同地理群體卵的耐寒性表現(xiàn)出與2齡幼蟲的耐寒性同樣的趨勢,低緯度臨高、湛江群體的卵對0℃和4℃的耐寒性明顯低于其他地理群體;從耐熱性來看,低緯度海南臨高群體更耐熱。這種海南群體的耐熱性較強而耐寒性較差的現(xiàn)象和耐寒性與耐熱性存在均衡的假說相符[25],也即當線蟲獲得耐熱性時,其耐寒性會因此喪失[26]。但同時本試驗也發(fā)現(xiàn),緯度較高具有較高耐寒性的湖南平江、望城、益陽群體的卵粒在37℃下保存10 d后仍然有40%以上的孵化率,經(jīng)低溫處理后2齡幼蟲的存活率和卵的孵化率均高于低緯度的廣西、廣東和海南群體,且經(jīng)低溫預(yù)處理后其存活率要明顯高于低緯度的臨高、湛江、融安和臨桂群體,表明湖南群體對溫度的耐受范圍及適應(yīng)性比低緯度的海南群體要寬且可塑性強,同時也說明了不同地理群體的擬禾本科根結(jié)線蟲在耐寒性和耐熱性的均衡上同樣也存在差異,與其他無脊椎動物相似,其耐寒性和耐熱性也可相互獨立[27]。研究表明,緯度高的生物種群通常比緯度低的種群更耐寒,這是生物通過進化途徑或自然選擇獲得的對當?shù)丨h(huán)境壓力的適應(yīng)性,且對溫度脅迫具有遺傳適應(yīng)性[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)地處溫帶的湖南、河南,年均溫度低于海南,來源于湖南、河南的線蟲的低溫存活率要高于海南,其機制除了通過階段降溫和冷馴化促進耐冷凍相關(guān)物質(zhì)的生物合成提高了生物的耐寒性[31-33]外,其耐寒性、耐熱性的差異也可能是因為不同地理群體的分化而形成了不同的生物型。

隨著全球氣候變暖加劇,中國35°N 以南的南方地區(qū)冬季整體呈升溫趨勢[34]。冬季氣溫的升高可增加冬季擬禾本科根結(jié)線蟲2齡幼蟲和卵在土壤中的存活率,影響春季土壤中的蟲口基數(shù)和危害程度。同時,在全球變暖背景下,中國冬季極端冷暖事件明顯增多[35-36],夏季南方雙季稻區(qū)極端高溫的發(fā)生頻率呈明顯增加趨勢,且高溫持續(xù)時間有所延長[37-38]。擬禾本科根結(jié)線蟲作為變溫動物,生活在寄主的根系及根際土壤,與其他線蟲一樣易受土壤溫度波動的影響,其對極端溫度的耐受性和對溫度適應(yīng)的可塑性對其生存至關(guān)重要。湖南群體對溫度具有的耐受性和可塑性的特點可能是近年來擬禾本科根結(jié)線蟲在湖南各地蔓延的原因之一。

河南新鄉(xiāng)是目前發(fā)現(xiàn)有擬禾本科根結(jié)線蟲危害緯度最高的地區(qū)[22]。該地區(qū)1月最冷,平均氣溫0.2℃,極端最低氣溫為-9.65℃,冬季0～20 cm的平均地溫在2.4℃至4.4℃之間。冬季新鄉(xiāng)稻田土壤含水量少且干燥,與南方稻田土壤環(huán)境有較大的差異。本研究發(fā)現(xiàn),新鄉(xiāng)群體的2齡幼蟲和卵較其他低緯度的群體具有較高的耐寒性,并且2齡幼蟲可通過低溫馴化獲得更高的耐寒性。該線蟲能在新鄉(xiāng)越冬,與其耐寒及耐凍有關(guān)。擬禾本科線蟲采用避免冷凍、耐凍以及低溫保護脫水三種策略[39- 40]中的哪些策略來獲得對低溫冰凍的抗性,則有待進一步研究。