煙芽夜蛾囊泡病毒3h株3h-122基因于棉鈴蟲幼蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

趙 瑩, 譚 赟, 黎 妮, 陳 斌, 于 歡, 黃國華

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長沙 410128)

囊泡病毒科Ascoviridae病毒是專性感染昆蟲的一類大型雙鏈環(huán)狀DNA病毒,于1983年首次被報(bào)道[1]。因其在感毒昆蟲的血淋巴中形成包裹著許多病毒粒子的大型囊泡而得名[2-3]。囊泡病毒可通過寄生蜂產(chǎn)卵在鱗翅目昆蟲中傳播,導(dǎo)致昆蟲慢性致死[4]。囊泡病毒的宿主范圍相對較廣,能感染包括甜菜夜蛾Spodopteraexigua、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、煙芽夜蛾Heliothisvirescens等在內(nèi)的多種農(nóng)業(yè)害蟲,有著巨大的生防應(yīng)用潛力[5]。目前,在NCBI數(shù)據(jù)庫中已登錄有11株囊泡病毒毒株的全基因組序列,大小都在100～200 kb之間,編碼100～200個開放閱讀框(open reading frames, ORF)[6]。

煙芽夜蛾囊泡病毒3h(Heliothis virescens ascovirus 3h,HvAV-3h)由本實(shí)驗(yàn)室在2012年分離并報(bào)道[7],并于2017年完成基因組測序[8]。其基因組全長為190 519 bp,G+C含量為45.5%,預(yù)測編碼185個開放閱讀框,其中包括44個核心基因、4個特有基因、24個bro基因。此前已在粉紋夜蛾囊泡病毒6b株(Trichoplusia ni ascovirus 6b,TnAV-6b)、草地貪夜蛾囊泡病毒1a株(Spodoptera frugiperda ascovirus 1a,SfAV-1a)和煙芽夜蛾囊泡病毒3i株(Heliothis virescens ascovirus 3i,HvAV-3i)中分別鑒定出了9、21個和67個結(jié)構(gòu)蛋白[9-11]。迄今為止,已鑒定的囊泡病毒的結(jié)構(gòu)蛋白主要有衣殼蛋白MCP、DNA結(jié)合蛋白P64、3H-21、3H-117[12-15]。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)檢測系統(tǒng)的發(fā)展,對囊泡病毒粒子的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行更全面的分析,對囊泡病毒結(jié)構(gòu)蛋白的研究至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室前期已鑒定出HvAV-3h病毒粒子攜帶78個病毒蛋白,為初步鑒定病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其功能研究打下良好基礎(chǔ)。本試驗(yàn)通過構(gòu)建原核表達(dá)載體獲得了HvAV-3h的第122個基因(3h-122)編碼的蛋白并制備了多克隆抗體、通過RT-PCR、蛋白免疫印跡檢測(Western blotting)及免疫組化分析明確了3H-122蛋白在HvAV-3h感染過程中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時相,確定其為HvAV-3h病毒粒子的一個結(jié)構(gòu)蛋白。為進(jìn)一步深入研究3h-122的功能及對病毒組裝復(fù)制的具體作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

棉鈴蟲種群由本實(shí)驗(yàn)室長期室內(nèi)飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件為(27±1)℃,相對濕度70%,光照周期為L∥D=16 h∥8 h[16]。煙芽夜蛾囊泡病毒3 h株(HvAV-3h)于2012年分離并于2017年完成全基因組測序,在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒研究所長期保存[7-8]。

1.2 3h-122基因的克隆及序列分析

根據(jù)Li等[17]報(bào)道的方法,以針刺法將HvAV-3h接種至3齡棉鈴蟲(蛻皮后12～24 h)血腔內(nèi),并于接種后72 h收集試蟲;用TRI Reagent 試劑盒(RNA/DNA/Protein Isolation Reagent, Invitrogen, Cincinnati, USA)提取試蟲總RNA,隨后采用Go ScriptTMReverse Transcription Mix, Oligo (dT)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, USA)合成cDNA,貯存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)Huang等報(bào)道的HvAV-3h基因組序列(GenBank登錄號:KU170628.1)及預(yù)測的開放閱讀框[8],設(shè)計(jì)3h-122基因的特異性引物3h-122-F(5′-GGATCCATGGATTGCTCACTGGTG-3′,下劃線為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))和3h-122-R(5′-AAGCTTTTACAACGGTTTAATAGAAGAT-3′,下劃線為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)),從制備的cDNA中擴(kuò)增3h-122基因的CDS區(qū)。反應(yīng)產(chǎn)物在含有4S Green Plus Nucleic Acid Stain的1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離,并使用V-ELUTE Gel Mini purification Kit(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)回收目的片段。

將3h-122與pGEM-T載體(Promega,北京)連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中,獲得含重組質(zhì)粒的菌株。向菌液中加入1 mL S.O.C培養(yǎng)基，于37℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h后涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素、24 μg/mL異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)和40 μg/mL X-Gal 的LB固體培養(yǎng)基上,挑取陽性單菌落至3 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)10～12 h后收集菌液,采用Fast Plasmid Miniprep Kit(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)提取質(zhì)粒,將篩選獲得的陽性克隆送至擎科生物技術(shù)有限公司測序。

通過NCBI ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)把DNA序列翻譯成氨基酸序列,使用Expert Protein Analysis System ExPASy工具(http:∥expasy.org/tools/)分析3H-122的物理和化學(xué)性質(zhì)。利用Geneious 4.8.4 (Biomatters Ltd)、DNAMAN(Lynnon corporation)軟件進(jìn)行序列比對、SignalP 5.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)軟件預(yù)測信號肽、TMHMM Server 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析跨膜區(qū)。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

對含有3h-122基因的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠分離;并使用V-ELUTE Gel Mini purification Kit回收目的基因。將目的基因與表達(dá)載體pET-28a(+)連接,連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中,并在含50 μg/mL卡那霉素(Kna+,下同)的固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng),挑取含有重組質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移至3 mL LB液體培養(yǎng)基(Kna+)中37℃,200 r/min培養(yǎng)過夜。采用Fast Plasmid Miniprep Kit從該菌液中提取質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ對構(gòu)建好的pET-28a-3h-122載體雙酶切,酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離,檢驗(yàn)表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。

1.4 3H-122蛋白的表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備

將pET-28a-3h-122轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,并在含50 μg/mL Kna+(下同)的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選,挑取單個菌落至的LB(Kna+)液體培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min培養(yǎng)過夜。取該培養(yǎng)物接種于3 mL LB(Kna+)液體培養(yǎng)基中并在37℃,200 r/min培養(yǎng)2～3 h(直到OD600達(dá)到0.6～0.8),加入3 μL IPTG,在25℃下160 r/min培養(yǎng)24 h誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。將培養(yǎng)物離心,棄上清,用平衡緩沖液(pH 8.0, 300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L咪唑, 10 mmol/L Tris base)重懸菌體，于冰上超聲破碎后12 000 r/min離心15 min。分別收集上清和沉淀,沉淀經(jīng)8 mol/L尿素溶解后通過Ni2+-NTA親和層析柱純化蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分離獲得純化的目的蛋白。將純化后的蛋白送至中國科學(xué)院武漢病毒研究所制備多克隆抗體。

1.5 Western blotting檢測3H-122蛋白

參考Zhao等[15]的方法純化病毒粒子,并用高效RIPA裂解液(索萊寶科技,北京)提取純化病毒粒子的總蛋白,SDS-PAGE分離蛋白,割取含目的蛋白的膠塊轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(nitrocellulose, NC)膜上。將NC膜于封閉液TBST(含5%脫脂奶粉的Tris Buffered Saline Tween緩沖液)中室溫封閉1 h,分別與1∶3 000的比例稀釋的3H-122抗體和以1∶4 000比例稀釋的GAPDH(甜菜夜蛾甘油醛-3-磷酸脫氫酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)抗體(本實(shí)驗(yàn)室前期制備)[18]4℃孵育過夜。TBST洗膜3次,每次5 min,將洗滌后的NC膜轉(zhuǎn)移到以1∶5 000比例稀釋的二抗溶液(山羊抗兔)中,室溫孵育1 h,再次用TBST洗滌3次,每次5 min。NC膜上均勻滴加顯色液(ClarityTMWestern ECL Substrate, Luminlo/enhancer solution: Peroxide solution=1∶1, Bio-Rad),避光反應(yīng)5 min,濾紙吸干后使用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)成像儀(ChemiDocTMXRS+, Bio-Rad)觀察結(jié)果。

1.6 3h-122基因轉(zhuǎn)錄分析

為了分析3h-122在感染HvAV-3h的棉鈴蟲幼蟲中的轉(zhuǎn)錄時相,按照1.2所述方法接種HvAV-3h病毒,以針刺但不接種病毒的試蟲為對照(后文稱針刺對照)。分別于接種后3、6、12、24、48、72、96、120 h和168 h提取棉鈴蟲幼蟲總RNA并合成cDNA,使用引物3h-122-F/3h-122-R以及本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的甜菜夜蛾甘油醛-3-磷酸脫氫酶gapdh基因的特異性引物:se-gapdh-F: 5′-ATGTCCAAAATCGGTATCAACG-3′,se-gapdh-R: 5′-TTAATCCTTGGTCTGGATGTACT-3′進(jìn)行PCR。隨后將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上分析。

1.7 3H-122蛋白表達(dá)分析

接種方法和對照設(shè)置同1.6。分別于處理后3、6、12、24、48、72、96、120 h和168 h提取接種HvAV-3h以及針刺對照棉鈴蟲幼蟲蛋白質(zhì)。使用12%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),并使用特異性兔抗血清進(jìn)行Western blotting分析。GAPDH用作內(nèi)參蛋白。

1.8 免疫組織化學(xué)分析

收集接種HvAV-3h后24、72、120 h的棉鈴蟲幼蟲,以針刺但不接種病毒的幼蟲作為對照。加入1 mL 4%多聚甲醛固定后,送往武漢賽維生物科技有限公司完成石蠟切片的制作。制作完成的石蠟切片置于60℃電熱恒溫烘箱中加熱20 min后使用二甲苯洗滌3次,每次10 min;再將切片依次放入無水乙醇洗滌2次、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各洗滌1次、蒸餾水洗滌2次,每次5 min。常規(guī)脫蠟水化后,切片放入裝有0.01 mol/L檸檬酸鈉(pH 6.0)的燒杯中,放置于高壓鍋中隔水加熱10 min;自然降至室溫后,在切片上滴入0.01 mmol/L,PBS緩沖液(pH 7.4)配制的1% Triton-X 100,室溫孵育1 h后用PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌3次,每次5 min。在切片上滴入蒸餾水配制的3% H2O2,室溫下孵育10 min后用PBS緩沖液洗滌3次,每次5 min。最后將切片放入PBS緩沖液配制的10%牛血清蛋白液,室溫下孵育30 min進(jìn)行封閉。加入用PBS緩沖液以1∶500比例稀釋的3H-122蛋白多克隆抗體,4℃孵育12 h。取出放置于室溫45 min,復(fù)溫后用PBS緩沖液洗滌5次,每次5 min。然后滴加用PBS緩沖液以1∶5 000比例稀釋的二抗(山羊抗兔),室溫下孵育1 h。封片后,在倒置熒光顯微鏡(Asio Valt A1;ZeSSIS,GER)下觀察切片并拍攝。最后的圖像用ZEN(ZESSIS,GER)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3h-122基因擴(kuò)增與序列分析

以1.2制備的cDNA為模板,使用3h-122-F/3h-122-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的426 bp的特異性條帶(圖1)。測序結(jié)果表明,擴(kuò)增的條帶序列與HvAV-3h基因組中所對應(yīng)的基因序列同源性為100%,僅在基因的兩端各增加6 bp酶切位點(diǎn)序列。

圖1 煙芽夜蛾囊泡病毒3h株3h-122基因電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 3h-122 gene of Heliothis virescens ascovirus 3h

3H-122由141個氨基酸殘基組成,相對分子量為16.1 kD,理論蛋白等電點(diǎn)pI(protein isoelectric point)為5,無預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域。序列分析表明(圖2):3H-122(登錄號:AYD68232.1)與來自HvAV-3e的ORF113(登錄號: YP_001110966.1)、HvAV-3g的ORF129(登錄號:YP_009702122.1)最為相近,相似性均為99.29%;與HvAV-3i的ORF116(登錄號:AXN77299.1)、HvAV-3j的ORF124(登錄號:BBB16594.1)、HvAV-3f的ORF120(登錄號:YP_009701586.1)具有90%以上的序列相似性。

圖2 煙芽夜蛾囊泡病毒3h株3H-122與其同源蛋白的多重序列對比Fig.2 Multiple sequences alignment of 3H-122 of Heliothis virescens ascovirus 3h and its homologues proteins

2.2 3h-122重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

對pET-28a-3h-122以BamHⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切檢測,除約5 369 bp的載體片段之外,在對應(yīng)3h-122基因大小的位置可見清晰的條帶(圖3),表明表達(dá)載體構(gòu)建成功,可用于后續(xù)的原核表達(dá)。

圖3 pET-28a-3h-122雙酶切鑒定Fig.3 Confirmation of pET-28a-3h-122 by double-enzyme digestion

2.3 3H-122蛋白的表達(dá)及純化

含有pET-28a-3h-122的大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示,約20 kD處有1條蛋白條帶,與預(yù)期3H-122蛋白大小相符(圖4)。超聲破碎后的上清幾乎不存在3H-122的可溶性蛋白(泳道2),證明重組蛋白主要以包涵體的形式溶解于8 mol/L尿素中(圖4，泳道3)。利用His-tag親和層析柱純化融合蛋白,純化的蛋白如圖4黑色箭頭(泳道9)所示,用于制備多克隆抗體。

圖4 重組3H-122蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein 3H-122

2.4 3H-122蛋白的鑒定

對純化的HvAV-3h病毒粒子進(jìn)行了蛋白質(zhì)免疫印跡分析。通過SDS-PAGE分離接種HvAV-3h后120 h的棉鈴蟲3齡幼蟲的蛋白提取物,并使用3H-122特異性兔抗血清和GAPDH兔抗血清分別進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(圖5)。作為宿主中的內(nèi)參蛋白,GAPDH與針刺對照和感毒幼蟲的提取物有反應(yīng),但不與病毒粒子蛋白提取物反應(yīng),表明病毒粒子純化質(zhì)量較高,無雜蛋白的干擾。而3H-122的特異性抗體對針刺對照幼蟲沒有反應(yīng),與病毒粒子蛋白提取物發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng),表明3H-122是HvAV-3h病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白之一。

圖5 HvAV-3h純化病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白免疫印跡分析Fig.5 Western blotting analysis of the structural protein in HvAV-3h virions

2.5 3h-122基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)分析

從針刺對照和HvAV-3h感染的棉鈴蟲3齡幼蟲中提取總RNA進(jìn)行RT-PCR分析,3h-122在針刺對照幼蟲中無轉(zhuǎn)錄,接種后3 h在感毒幼蟲體內(nèi)檢測到轉(zhuǎn)錄,直至168 h均可檢測到穩(wěn)定條帶(圖6a)。用12% SDS-PAGE分離不同時間的針刺對照和3齡棉鈴蟲幼蟲的蛋白提取物,并進(jìn)行蛋白免疫印跡分析,結(jié)果表明3H-122在針刺對照幼蟲中無表達(dá),在感毒幼蟲體內(nèi)于接種后24 h可檢測到表達(dá),直至接種后168 h 仍可檢測到其表達(dá)。蛋白質(zhì)大小16.1 kD,與預(yù)測的分子量一致(圖6b)。

2.6 3H-122在棉鈴蟲體內(nèi)的組織特異性檢測

對棉鈴蟲組織進(jìn)行3H-122蛋白的免疫組織化學(xué)染色,如圖7所示,在針刺對照的幼蟲脂肪體中未觀察到綠色熒光信號,表明沒有結(jié)構(gòu)蛋白3H-122的表達(dá);在感染HvAV-3h后24 h,感毒幼蟲染色組織中檢測到微弱的綠色熒光信號,表明有3H-122蛋白的表達(dá);在感染HvAV-3h后72 h,熒光信號強(qiáng)烈且主要位于脂肪體組織和表皮周圍;在感染HvAV-3h后120 h,大片組織中檢測到綠色熒光,證明大量3H-122蛋白得到表達(dá)。

圖6 感染HvAV-3h的棉鈴蟲幼蟲中3h-122的轉(zhuǎn)錄分析與3H-122的表達(dá)分析Fig.6 Transcription analysis of 3h-122 and expression analysis of 3H-122 in HvAV-3h-infected Helicoverpa armigera larvae

3 結(jié)論與討論

本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了HvAV-3h毒株3h-122基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白(3H-122),并制備了多克隆抗體;通過RT-PCR、Western blotting以及免疫組織化學(xué)染色,對3H-122轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時相以及在棉鈴蟲幼蟲體內(nèi)的組織特異性進(jìn)行了分析。

結(jié)構(gòu)蛋白是由病毒基因組編碼,構(gòu)成病毒體所必需的成分,在病毒裝配、形態(tài)發(fā)生以及介導(dǎo)病毒感染和誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫等方面發(fā)揮著重要的作用[19-20]。目前,已證明囊泡病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基本組成包括主要衣殼蛋白(major capsid proteins, MCP)、DNA結(jié)合蛋白(DNA-binding proteins, P64)、3H-117、3H-21等[12-15]。MCP最初是從斜紋夜蛾囊泡病毒2a株(TnAV-2a)中鑒定和報(bào)道的,命名為TnAV-cp,它在其他囊泡病毒中的同源物是用于研究幾種相關(guān)dsDNA病毒進(jìn)化的病毒體中的主要結(jié)構(gòu)蛋白[19]。P64是草地貪夜蛾囊泡病毒1a株(SfAV-1a)中一種最豐富的蛋白質(zhì),作為組裝期間將病毒基因組包裝到病毒體中所需的結(jié)構(gòu)蛋白,蛋白P64能加速病毒的復(fù)制并參與病毒粒子的裝配[20]。3H-117、3H-21在所有測序的囊泡病毒中是保守的,被鑒定為HvAV-3h的結(jié)構(gòu)蛋白[14-15]。

對3h-122基因在HvAV-3h感染的棉鈴蟲幼蟲中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時相分析發(fā)現(xiàn),3h-122基因在接種HvAV-3h后3 h開始轉(zhuǎn)錄,但蛋白質(zhì)印跡分析表明3H-122在接種后24 h才檢測到表達(dá)。這種表達(dá)與轉(zhuǎn)錄之間存在時差的現(xiàn)象,在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)中也有報(bào)道,其結(jié)構(gòu)蛋白基因在接種后16 h開始轉(zhuǎn)錄,而在接種后48 h才檢測到表達(dá)[21];同時這種差異也存在于HvAV-3h其他結(jié)構(gòu)蛋白的研究中[14-15],這可能是由于早期3H-122蛋白水平低不足以被檢測到,或者也可能與囊泡病毒特殊的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特征有關(guān)。

對3H-122的組織特異性分布的研究結(jié)果表明,其在中腸、肌肉、脂肪體組織中均有表達(dá),在脂肪體中的表達(dá)水平最高。在接種后72 h時幼蟲脂肪體破碎成碎片,已有研究報(bào)道,HvAV-3h感染會導(dǎo)致宿主幼蟲脂肪體的破壞性病理變化[17],我們的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。在桿狀病毒中,菜粉蝶顆粒病毒(Pieris rapae granulovirus, PiraGV)感染會導(dǎo)致宿主多器官的急性病理變化,其編碼的PiraGV-K顆粒體蛋白也在表皮、脂肪體、氣管基質(zhì)等多個組織中表達(dá)[22]。類似地,蓖麻蠶核型多角體病毒(Philosamia cynthia ricini nuclear polyhedrosis virus, PcrNPV)的Gp64是桿狀病毒(cell-released virus, CRV)的主要囊膜蛋白,感染后在中腸、血淋巴及脂肪體組織中均有著較高的表達(dá)[23]。因此我們推測3H-122主要在脂肪體細(xì)胞中完成蛋白的合成,并在病毒侵染中發(fā)揮作用。