噴施誘導(dǎo)的基因沉默(SIGS)技術(shù)控制植物病害研究進(jìn)展

陳夕軍, 石 童, 陳 宸, 唐 滔

(揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院, 揚(yáng)州 225009)

在自然情況下,生態(tài)系統(tǒng)是一個(gè)動態(tài)、復(fù)雜的系統(tǒng),其演替至頂級后能實(shí)現(xiàn)自我更新并能維持自身功能處于較高水平和較小波動的狀態(tài)[1]。但當(dāng)某些干擾超過其承受閾值時(shí),生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能就會發(fā)生變化[2]。農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)是受到人類強(qiáng)烈干預(yù)的自然經(jīng)濟(jì)復(fù)合生態(tài)系統(tǒng),不同于自然系統(tǒng)的是,農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)是以農(nóng)業(yè)產(chǎn)出的物質(zhì)和服務(wù)為基礎(chǔ)的[3-4]。片面地追求農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量與品質(zhì),使得遺傳背景相似的高產(chǎn)品種、高肥密植的栽培措施、防治對象廣譜的化學(xué)藥劑等被廣泛應(yīng)用。農(nóng)作物病害的發(fā)生、病原菌的抗藥性、環(huán)境的污染等也越來越嚴(yán)重[5-10]。近年來,研究者們開始尋求一些綠色的農(nóng)作物病害防控措施,如抗性品種、生物源誘抗物質(zhì)、生防菌劑和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等的應(yīng)用[11-14]。但由于傳統(tǒng)的抗性育種花費(fèi)時(shí)間長,獲得的品種易因病菌變異失去抗性[15-16];作物對某些病菌的抗性僅由數(shù)量性狀基因控制,生產(chǎn)上無高抗或免疫的種質(zhì)資源[17];生物源誘抗物質(zhì)雖可提高植物內(nèi)稟抗性,但對病害防效較低[18-19];生防菌劑的防效易受環(huán)境影響,持效期較短[20-22];很多植物不能進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,以及人們對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的接受程度和倫理[23-24]等原因,這些措施的運(yùn)用均受到一定程度的限制。因此,亟須發(fā)展高效、可持續(xù)、對環(huán)境友好的病害防治方法,以符合人們對高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的需求。噴霧誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)因其專一性、高效性、不需要轉(zhuǎn)基因和對環(huán)境友好等特性,展示出良好的應(yīng)用前景。

1 SIGS技術(shù)的由來

1998年,Fire等[25]首次發(fā)現(xiàn)外源雙鏈RNA(double-stranded,dsRNA)可根據(jù)同源性促發(fā)對相應(yīng)基因活性的抑制;且小RNA(small RNAs,sRNAs)作為一類新的調(diào)節(jié)分子可通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)來沉默相關(guān)基因,從而抑制該基因的功能[26-27]。這些外源RNA沉默分子均源自外源基因的轉(zhuǎn)入、病毒、類病毒和轉(zhuǎn)座子,并通過核酸酶和向?qū)NA(guide RNA,gRNA)的作用進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾[28]。在此研究基礎(chǔ)上,病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、寄主誘導(dǎo)的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)和絲狀生物誘導(dǎo)的基因沉默(filamentous organism-induced gene silencing,FIGS)等技術(shù)很快被建立,并用于植物病害的防控[28-31]。但這些技術(shù)均建立于基因工程基礎(chǔ)之上,而許多植物或病原真菌很難被進(jìn)行遺傳操作,再加上許多國家對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的接受程度較低,這些轉(zhuǎn)基因方法的廣泛適用性一直備受質(zhì)疑。因此,非轉(zhuǎn)基因方法也一直是人們尋求的目標(biāo)。

一直以來,人們普遍認(rèn)為,由于病原真菌和寄主植物的基因組及RNA分別被兩套質(zhì)膜和細(xì)胞外基質(zhì)分開,侵染植物的病原真菌不可能在與寄主的互作中發(fā)揮RNA沉默作用,反之植物體也不可能通過與病原菌互作而沉默其相關(guān)基因[28]。但越來越多的研究表明,寄主植物和病原真菌之間可以利用RNA沉默機(jī)制來相互影響,病毒、sRNAs和dsRNA等均可在病原真菌與寄主之間進(jìn)行跨界傳播[32-34],這種跨界傳播的基因沉默信號使RNAi和sRNAs在寄主-病原真菌通信中發(fā)揮重要作用[35-36]。但這些也僅是在寄主與病原物互作過程中通過特殊途徑進(jìn)行RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)。直到最近才有研究表明,真菌可以像線蟲、昆蟲一樣從環(huán)境中吸收dsRNA[37-39]。Koch等[39]通過在大麥表面噴施靶向禾谷鐮孢Fusariumgraminearum細(xì)胞色素P450羊毛甾醇C-14α-甲基化酶的長鏈非編碼dsRNA(791 ntCYP3-dsRNA),然后接種病原菌,病菌中的CYP51A、CYP51B和CYP51C基因表達(dá)量明顯下調(diào),病菌的生長顯著受到抑制,病害嚴(yán)重程度降低,該技術(shù)被稱為噴施誘導(dǎo)的基因沉默(spray-induced gene silencing),簡稱SIGS。

2 SIGS在植物病害防治中的應(yīng)用

作為一種新型的植物病害防控技術(shù),SIGS已被用于多種植物病害的治理研究,并展示出良好的應(yīng)用前景(表1)。將根據(jù)灰葡萄孢Botrytiscinerea核酸內(nèi)切酶基因Bc-DCL1和Bc-DCL2序列體外合成的Bc-DCL1/2-sRNAs和Bc-DCL1/2-dsRNA分別噴施于番茄、草莓、葡萄、萵苣、洋蔥和玫瑰的果實(shí)、葉片或花的表面,能減少寄主中病菌量的積累,并減小病斑面積[23]。將灰葡萄孢BcCYP51、Bcchs1和BcFE2基因經(jīng)重疊PCR產(chǎn)生的長鏈dsRNA噴施于葡萄葉片、果實(shí)或經(jīng)葉柄吸收,均能顯著減輕病害的發(fā)生[40]。以靶向核盤菌Sclerotiniasclerotiorum中編碼tRNA酰胺連接酶和硫氧還蛋白還原酶基因的dsRNA處理病菌,48 h后靶基因表達(dá)量下降50%左右;油菜葉面噴施該dsRNA后接種病原菌,病斑面積最多可減小85%[41]。分別以致病疫霉Phytophthorainfestans的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合G蛋白β-亞基PiGPB1基因、吸器膜蛋白PiHmp1基因、角質(zhì)酶PiCut3基因和內(nèi)切1,3(4)-β-葡聚糖酶PiEndo3基因?yàn)榘袠?biāo),將體外合成的dsRNA噴施于馬鈴薯葉片后,dsRNAPiGPB1強(qiáng)烈抑制病菌孢子的形成;dsRNAPiEndo3和dsRNAPiCut3雖不能完全抑制孢子的產(chǎn)生,但處理葉片上的孢子量明顯較低;4種dsRNA均能使致病疫霉在馬鈴薯葉片上導(dǎo)致的病斑面積變小[42]。以靶向大豆銹病病菌Phakopsporapachyrhizi乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因ATC、核糖體蛋白S16基因RP_S16和甘氨酸裂解系統(tǒng)H蛋白基因GCS_H的dsRNA噴施于離體大豆葉片表面,可使葉面孢子堆數(shù)減少73%，葉片中菌量減少75%,有效控制了大豆銹病的發(fā)生[43]。

除被用于絲狀生物引起的植物病害的防控,dsRNA還被應(yīng)用于防治病毒病。將靶向煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV)p126和CP基因的dsRNA外源噴施于煙草葉片表面,3 d后,只接種TMV的植株中80%以上的植株出現(xiàn)脈明和褪綠斑,而TMV/dsRNA_p126和TMV/dsRNA_CP處理株則無癥狀;10 d后,所有只接種TMV的植株均表現(xiàn)嚴(yán)重花葉癥狀,而TMV/dsRNA_p126和TMV/dsRNA_CP處理株的病株率僅為35%和50%,且這種效果可持續(xù)20 d以上[57]。

表1 SIGS在植物病害控制領(lǐng)域的研究進(jìn)展

3 影響SIGS對病害防控效果的因素

3.1 病原菌攝取環(huán)境dsRNA的能力

病原菌可以攝取環(huán)境中的dsRNA是利用SIGS進(jìn)行病害控制的基礎(chǔ),但不同病原菌從環(huán)境中攝取dsRNA的能力是不同的。Qiao等[44]以熒光素標(biāo)記的YFP-dsRNA分別處理常見病原真菌灰葡萄孢、核盤菌、黑曲霉Aspergillusniger、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、大麗輪枝菌Verticilliumdahliae、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和病原卵菌致病疫霉,以及非致病真菌綠色木霉Trichodermavirens,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然灰葡萄孢、核盤菌、黑曲霉、立枯絲核菌等均能很好地從環(huán)境中攝入dsRNA,但綠色木霉攝入dsRNA的量很少,而膠孢炭疽菌中根本檢測不到。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),可以攝入外源dsRNA的病菌,在使用靶向致病基因的dsRNA處理后,其致病性均明顯減輕[39-41, 44]。致病疫霉從外源環(huán)境中攝入dsRNA的效率比較低,因此外源噴施不同致病基因的dsRNA對致病疫霉在馬鈴薯葉片上的生長發(fā)育和病斑的擴(kuò)展均無抑制作用[44]。

有趣的是,關(guān)于致病疫霉從環(huán)境中攝取dsRNA,Kalyandurg等[42]的研究結(jié)果與Qiao等[44]的結(jié)論完全相反。Kalyandurg等[42]首先將GFP基因轉(zhuǎn)入致病疫霉,然后用以青色素3-UTP標(biāo)記的dsRNAGFP(Cy3-dsRNAGFP)和根據(jù)MEGAscript試劑盒中對照模板合成的dsRNA(Cy3-dsRNACt)處理轉(zhuǎn)化的菌株孢子囊,24 h后Cy3-dsRNAGFP處理的致病疫霉孢子囊中GFP熒光減弱,而對照組無變化;將20 ng/μL的Cy3-dsRNACt噴施在馬鈴薯離體葉片表面,24 h后接種轉(zhuǎn)化GFP標(biāo)記的致病疫霉孢子懸浮液,5 d后病部致病疫霉的菌絲和孢子囊中GFP和Cy3-dsRNACt呈共定位,說明外源的Cy3-dsRNACt可以通過噴施在馬鈴薯葉片表面而被致病疫霉吸收。兩者研究結(jié)果的不同是因?yàn)檫x用了不同的菌株,還是由于其他原因,還有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同dsRNA片段的沉默效應(yīng)

SIGS防控植物病害的基本原理是通過吸收環(huán)境中的dsRNA或sRNAs,沉默病菌生長發(fā)育或致病相關(guān)基因,從而減輕病害的發(fā)生。dsRNA可通過2種途徑進(jìn)入病菌體內(nèi):一是外源dsRNA先進(jìn)入植物細(xì)胞,然后由植物細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至病菌體內(nèi),并被植物或病菌體內(nèi)的DCL(dicer-like)蛋白剪切成sRNAs;另一種是dsRNA直接進(jìn)入病菌體內(nèi),并由病菌DCL蛋白切割,形成sRNAs[23,39,44]。無論哪種途徑,最終起作用的均為sRNAs,而sRNAs對mRNA的結(jié)合部位堿基有偏好性,GC含量較低的mRNA被沉默效果較好,而且靶RNA的剪切位點(diǎn)主要是由gRNA的5′端序列決定的,因此源自不同dsRNA片段的sRNAs引起的沉默效應(yīng)是不同的[45-47]。將亞洲鐮孢F.asiaticum肌球蛋白5基因Myo5不同區(qū)段的cDNA序列構(gòu)建至干涉載體,雖然多數(shù)陽性轉(zhuǎn)化子呈現(xiàn)生長速率變慢、對滲透壓更敏感、分生孢子分隔變少、液泡數(shù)量增加、細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量降低、無性和有性繁殖體數(shù)量變少、致病能力變?nèi)醯茸兓?但部分轉(zhuǎn)化子的所有性狀與野生型菌株相比并無顯著差異[48]。

禾谷鐮孢CYP51基因簇包含3個(gè)基因,分別為FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C,將分別靶向單基因、雙基因和三基因的dsRNA CYP-A、CYP-B、CYP-C、CYP-AB、CYP-AC、CYP-BC和CYP3RNA噴施于大麥葉片表面,發(fā)現(xiàn)靶向3個(gè)基因的CYP3RNA可減少病部面積達(dá)93%,效果遠(yuǎn)好于靶向單個(gè)和2個(gè)基因的dsRNA[49]。即使靶向單個(gè)基因,250 bp的dsRNA的沉默效果均在60%以下,而800 bp的dsRNA沉默效果在80%以上[50]。而一般認(rèn)為,RNAi片段的長度在98～853 bp之間都是可行的,不會對沉默效率產(chǎn)生影響[51]。因此,在進(jìn)行SIGS防治植物病害過程中,可以在允許范圍內(nèi),以多個(gè)致病相關(guān)基因?yàn)榘袠?biāo),合成靶向多個(gè)基因的dsRNA,以取得更好的防病效果。Qiao等[44]分別以多種真菌的液泡分揀蛋白51基因VPS51、動力蛋白激活蛋白基因DCTN1和肌動蛋白抑制子基因SAC1為靶標(biāo),經(jīng)重疊PCR并構(gòu)建至T7啟動子進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到靶向多基因的dsRNA,噴施到植物葉片表面或進(jìn)行蘸根處理,除不能攝取環(huán)境中dsRNA的膠孢炭疽菌與致病疫霉外,其他幾種病菌的致病性均受到顯著抑制。

3.3 dsRNA的穩(wěn)定性及對病害控制的持效性

SIGS是通過外源噴施dsRNA誘導(dǎo)與病菌生長發(fā)育和致病相關(guān)的基因沉默,從而降低病菌致病性。dsRNA雖不像單鏈RNA(single-stranded,ssRNA)那樣極易被降解,但由于病原菌體內(nèi)外環(huán)境中存在大量RNA酶,可能使dsRNA失去活性。特別是在田間條件下,紫外線照射、雨水沖刷和微生物降解等,更是其降解和失活的主要原因[58-59]。有研究表明,具有殺蟲活性的DvSnf7 dsRNA在土壤中被降解50%的時(shí)間小于30 h,被降解95%的時(shí)間小于35 h,而且其降解動力學(xué)不受初始施用濃度的影響[60]。盡管在無菌水中dsRNA相對穩(wěn)定,但在自然水系中,dsRNA極不穩(wěn)定,水系中有或無沉淀物其被降解50%的時(shí)間均小于6 d[61]。關(guān)于dsRNA施用于植物表面防控植物病害,目前的報(bào)道表明, 在dsRNA處理后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)接種相應(yīng)的病原菌,可明顯減輕病害嚴(yán)重度,若dsRNA處理與接種病菌的間隔時(shí)間延長,則病害防控效率降低[39-44]。Mitter等[24]研究發(fā)現(xiàn),利用裸露的CMV2b-dsRNA處理豇豆和煙草葉片,5 d后接種CMV,其對病害防效顯著,若20 d后接種,則完全失去作用;但用納米黏土片作載體,因納米黏土片可很好地保護(hù)dsRNA不被降解,20 d后接種,其防病效果依然可達(dá)68%。Song等[48]也發(fā)現(xiàn),如果不能持續(xù)的供應(yīng)dsRNA,沉默效應(yīng)僅僅只能持續(xù)9 h;但若噴施于植物表面的dsRNA被植物細(xì)胞吸收,則其持續(xù)效應(yīng)較長。

至于為何dsRNA處理葉片要比直接處理病菌沉默效果持續(xù)時(shí)間更長,Song等[48]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),靶向真菌致病基因的dsRNA被植物細(xì)胞吸收后,可以在植物體內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn),并在植物體內(nèi)被切割成18～27 bp的sRNAs,轉(zhuǎn)移進(jìn)病菌細(xì)胞;同時(shí)植物還可利用自身的依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)以dsRNA核酸鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)生大量二次擴(kuò)增的dsRNA產(chǎn)物,并轉(zhuǎn)移至病菌細(xì)胞內(nèi),從而維持較長時(shí)間的基因沉默效應(yīng)。

除上述因素外,由于不同基因?qū)Σ【虏×τ绊懖煌?因此針對不同靶基因設(shè)計(jì)的dsRNA噴施后對病害的防控效果亦會有顯著差異。而對病菌如何攝取外源dsRNA和dsRNA在寄主-病原菌間如何相互轉(zhuǎn)運(yùn)并產(chǎn)生作用的分子機(jī)制不明,成熟地應(yīng)用外源dsRNA防控植物病害的技術(shù)還未研發(fā),這些均影響到SIGS在田間的應(yīng)用及其防效。

4 有關(guān)SIGS應(yīng)用的未來研究方向

如前所述,不同病原菌對外源dsRNA的攝取能力是不同的,但至目前為止,有關(guān)病原真菌如何攝取外源dsRNA還未有報(bào)道。Koch等[52]研究發(fā)現(xiàn),在HIGS過程中植物細(xì)胞的囊泡系統(tǒng)起到關(guān)鍵作用,在植物的胞外囊泡和非原質(zhì)體液中均能檢測到靶基因dsRNA源的小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA);轉(zhuǎn)化所需的核內(nèi)體分選復(fù)合物Ⅲ(endosomal sorting complex required for transport Ⅲ,ESCRT-Ⅲ)突變后HIGS效應(yīng)受損,進(jìn)一步說明了內(nèi)源囊泡運(yùn)輸支持轉(zhuǎn)基因來源的siRNA在植物細(xì)胞和病原真菌細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移。但植物體外囊泡和非原質(zhì)體液中的dsRNA,以及直接用dsRNA處理真菌菌絲、孢子時(shí),dsRNA是如何進(jìn)入真菌細(xì)胞的還完全未知,明確真菌攝入dsRNA機(jī)制及真菌攝取dsRNA能力差異的原因,是未來研究的方向之一。

由于存在紫外線、化學(xué)物質(zhì)和RNA酶等,裸露的dsRNA在自然環(huán)境中并不穩(wěn)定,為了提高SIGS的應(yīng)用效果,必須延緩用于SIGS的dsRNA在自然界中的降解速度。對于化學(xué)農(nóng)藥來說,一些表面活性劑、助劑、無機(jī)鹽和長效緩釋添加劑等均有增加農(nóng)藥在植物表面的滯留量、延長滯留時(shí)間和提高對作物表面穿透的能力。而對于dsRNA,已有研究表明,選用納米黏土片層作為載體可以有效延長dsRNA的SIGS效應(yīng)[24]。但是否有其他方法或加入某些助劑可有效保護(hù)dsRNA的穩(wěn)定性、延長SIGS的效應(yīng),還未見報(bào)道。

RNAi的沉默效應(yīng)與起始dsRNA的濃度有關(guān),雖然起始dsRNA的濃度在1.5～100 nmol/L間產(chǎn)生的沉默效果相似,但當(dāng)起始dsRNA濃度低至0.05 nmol/L時(shí),沉默效應(yīng)完全消失[53]。在進(jìn)行SIGS技術(shù)應(yīng)用時(shí),真菌攝取dsRNA的能力、植物中dsRNA向真菌中轉(zhuǎn)移的能力、初始dsRNA的施用濃度,均會影響基因沉默效應(yīng),也終將影響SIGS技術(shù)對病害的控制效果。Qiao等[44]在研究SIGS控制植物病害時(shí),分別使用20、40 ng/μL和100 ng/μL dsRNA處理果實(shí)與花瓣、馬鈴薯葉片和番茄葉片以達(dá)到較好的防病效果。此外,由于病菌對化學(xué)農(nóng)藥的抗藥性越來越嚴(yán)重,導(dǎo)致許多花費(fèi)了巨大人力、物力、財(cái)力研發(fā)的藥劑已失去或即將失去應(yīng)用效果,是否可以將這些藥劑與dsRNA進(jìn)行復(fù)配從而提高病害的防控效果,延緩病菌抗藥性的產(chǎn)生？甚至靶向病原菌的抗藥性基因,使抗藥菌株失去抗藥性,從而使失去病害防控效果的舊的藥劑能重新在田間加以應(yīng)用。

尋找廣譜性化學(xué)農(nóng)藥和對病原菌高效、特異的控制靶點(diǎn)一直是人們追求的目標(biāo),人們希望使用一種農(nóng)藥就可以防治多種有害生物。但大量廣譜性化學(xué)農(nóng)藥的使用,造成了嚴(yán)重的生態(tài)災(zāi)難,如有益微生物、天敵的無差別殺滅,生態(tài)環(huán)境中非靶標(biāo)生物的種群數(shù)量的改變和多次使用單一藥劑導(dǎo)致的靶標(biāo)對象的高抗藥性等。因此,應(yīng)用SIGS技術(shù)控制植物病害時(shí),同樣要考慮dsRNA的廣譜性和脫靶效應(yīng)。如靶向FgCYP51B基因的dsRNA CYP-B噴施于大麥葉片表面,同樣可以沉默非靶標(biāo)的FgCYP51A和FgCYP51C基因,而CYP-AC、CYP-AB和CYPBC同樣可以靶向非靶標(biāo)基因FgCYP51B、FgCYP51C和FgCYP51A[49]。這樣的脫靶效應(yīng)如果對其他生物起作用,則會出現(xiàn)與化學(xué)農(nóng)藥同樣的環(huán)境破壞效果。而且,由于外源dsRNA在植物體內(nèi)可以進(jìn)行二次擴(kuò)增,即使噴施的dsRNA并未與非靶標(biāo)生物直接接觸,也會因?yàn)楹笃诜前袠?biāo)生物與寄主植物的接觸而引起脫靶效應(yīng)。因此,借助生物信息學(xué)工具,精心設(shè)計(jì)和精準(zhǔn)預(yù)測需要合成與使用的dsRNA是非常必要的,以免對相關(guān)或非相關(guān)生物產(chǎn)生非靶標(biāo)效應(yīng)[54]。

盡管施用外源dsRNA不是直接對生物體遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾,但仍可能存在一定風(fēng)險(xiǎn)。如Heinemann[56]所述:1)dsRNA并非如人們想象的那樣,只在細(xì)胞質(zhì)中起作用,它可以與一些蛋白(如Dicer和NRDE-3)協(xié)同一起進(jìn)入細(xì)胞核,從而對DNA和組織蛋白進(jìn)行修飾;2)生物體的基因并不全部存在于細(xì)胞核中,如線粒體、葉綠體也都有自己的基因組,外源dsRNA有可能會對這些基因進(jìn)行修飾;3)外源施用的dsRNA有可能會被逆轉(zhuǎn)錄,形成的DNA則可能會被整合到宿主基因組中,從而改變宿主的遺傳信息;4)dsRNA可以通過對基因進(jìn)行敲除、改變拷貝數(shù)、影響染色質(zhì)壓實(shí)程度及調(diào)控序列對轉(zhuǎn)錄因子的接受程度等,影響宿主遺傳物質(zhì)組成及其表達(dá);5)外源dsRNA可以在宿主細(xì)胞中遺傳,從而改變了生物體的遺傳信息等。當(dāng)然,這些報(bào)道均基于通過轉(zhuǎn)基因手段獲得的外源dsRNA,直接外源噴施影響施用植物安全或食品安全的例子還未有報(bào)道。但Song等[48]發(fā)現(xiàn),外源施用的dsRNA進(jìn)入植物體內(nèi),植物可以利用自身的RdRP以dsRNA核酸鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)生大量二次擴(kuò)增的dsRNA產(chǎn)物。至于這些二次擴(kuò)增的產(chǎn)物是否在植物體內(nèi)有其他效應(yīng),或者能否對植物體遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾,甚至直接遺傳給后代,均還有待于進(jìn)一步研究。

5 展望

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展及寄主-病原物互作分子機(jī)制研究的深入,基于遺傳物質(zhì)的病害防控技術(shù)因其專一性、高效性和環(huán)境友好性而廣受青睞。但在多數(shù)國家對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品接受程度普遍較低的情況下,多種通過轉(zhuǎn)基因控制病害的技術(shù)措施在大多數(shù)作物上被限制應(yīng)用。SIGS因?yàn)椴恍枰D(zhuǎn)基因,解決了許多植物不能進(jìn)行遺傳操作的難題,而且dsRNA來源于病原菌本身,不會在土壤和環(huán)境中留下有毒殘留物而對環(huán)境造成污染,從而具有更廣闊的應(yīng)用前景。雖然目前世界各國對dsRNA產(chǎn)品的應(yīng)用與管理還未有共識,但包括歐洲科學(xué)界在內(nèi)的各國科學(xué)家和相關(guān)組織已經(jīng)開始評估此類產(chǎn)品的監(jiān)管框架[55-56]。西方國家中,美國暫未有相關(guān)要求,但歐盟對噴施或外源施用的dsRNA農(nóng)藥管理則參照生物化學(xué)農(nóng)藥執(zhí)行,其技術(shù)級材料和產(chǎn)品均需進(jìn)行哺乳動物或非靶標(biāo)生物毒性測定;如特定的產(chǎn)品配方阻礙或促進(jìn)了dsRNA的吸收,還必須提供這些特定配方的非靶標(biāo)生物毒理學(xué)數(shù)據(jù),以更好的確認(rèn)其潛在危害[62]。此外,如利用工程菌株生產(chǎn)dsRNA,工程菌作為中間體必須受有毒物質(zhì)控制法案監(jiān)管,在生產(chǎn)前提交微生物商業(yè)活動通知函[62-63]。在我國,目前還未有dsRNA農(nóng)藥相關(guān)登記管理規(guī)定。但作為新興的植物病害防控措施,基于dsRNA的農(nóng)藥在不久的將來肯定會在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用,這也要求監(jiān)管部門要立即對這一類農(nóng)藥進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估,以滿足生產(chǎn)與社會需求。