臍血來源NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增及其抗腫瘤細(xì)胞活性的研究

韓強(qiáng)，張志剛，劉坤，朱賢兌，金媛媛，張志斐，楊兆勇

·論著·

臍血來源NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增及其抗腫瘤細(xì)胞活性的研究

韓強(qiáng)*，張志剛*，劉坤，朱賢兌，金媛媛，張志斐，楊兆勇

063210 唐山，華北理工大學(xué)藥學(xué)院（韓強(qiáng)、劉坤、朱賢兌、張志斐）；061000 滄州，滄州市人民醫(yī)院病理科（張志剛）；100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所代謝工程室（金媛媛、楊兆勇）

研究臍血單個核細(xì)胞來源 NK 細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其對不同類型腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。自臍靜脈消毒后全封閉采集臍血，肝素抗凝，分離單個核細(xì)胞，用 NK細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng) 14 d，流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志，并使用 RTCA 實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)檢測細(xì)胞增殖曲線，觀察 NK 效應(yīng)細(xì)胞按效靶比 1:1、5:1 與 10:1 對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。培養(yǎng) 14 d 的臍血單個核細(xì)胞，細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增 294 倍，其中 NK 細(xì)胞擴(kuò)增5580 倍。NK 細(xì)胞 CD3-CD56+陽性率為 97.93%，與殺傷功能相關(guān)的重要分子 CD16、NKG2D、NKp30、NKp44 的表達(dá)陽性率均在 95% 以上。對 A549 肺癌細(xì)胞株作用 6 h 的殺傷活性，在 1:1 ～ 10:1 效靶比范圍內(nèi)，隨著效靶比增加，殺傷活性從（78.16 ± 2.41）% 逐漸增強(qiáng)到（95.71 ± 3.21）%；并且在效靶比 1:1 的情況下，隨著作用時間從 6 h 延長到 24 h，殺傷活性也從（78.16 ± 2.41）% 逐漸增強(qiáng)到（96.33 ± 2.15）%。建立了無需分選細(xì)胞、無需滋養(yǎng)層細(xì)胞、操作簡單、通用性強(qiáng)的臍血 NK 細(xì)胞培養(yǎng)方法，獲得的 NK 細(xì)胞純度高，對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)。

自然殺傷細(xì)胞； 臍血； 表面標(biāo)志； 實(shí)時無標(biāo)記動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)； 體外擴(kuò)增； 抗腫瘤

自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK 細(xì)胞）是區(qū)別于特異性免疫，在人體內(nèi)執(zhí)行非特異性免疫功能的一類大顆粒淋巴細(xì)胞群，可以監(jiān)視并且對體內(nèi)衰老、感染和畸變細(xì)胞進(jìn)行快速清除[1]。目前有多種途徑能夠獲得 NK 細(xì)胞，較為成熟的來源有臍帶血、外周血等；也有通過基因編輯如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來進(jìn)行 NK 細(xì)胞制備。使用臍帶血制備的 NK 細(xì)胞有許多優(yōu)勢，例如不需要基因編輯，相較于外周血制備的 NK 細(xì)胞，臍帶血制備的 NK 細(xì)胞具有較低的免疫原性等?；诋愺w回輸 NK 細(xì)胞的免疫療法已被證明在人體內(nèi)幾乎不會發(fā)生嚴(yán)重排異反應(yīng)[2]，經(jīng)過特定方式誘導(dǎo)培養(yǎng)的臍帶血 NK 細(xì)胞能夠滿足數(shù)十次臨床回輸需求，展現(xiàn)了臍帶血 NK 細(xì)胞較強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力。

本研究探索了一種簡單、穩(wěn)定的臍帶血來源 NK 細(xì)胞的體外大規(guī)模擴(kuò)增方法，并且對獲得的高活性 NK 細(xì)胞進(jìn)行了體外實(shí)體腫瘤細(xì)胞殺傷作用研究，以期為 NK 細(xì)胞治療實(shí)體瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

A549 和 HCT8 細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；X-VIVO 培養(yǎng)基購自瑞士 Lonza 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱?離心機(jī)與AIM V CTS 無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基（RUO）均購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；APC anti-human CD56?FITC anti-human CD3?PE anti-human CD16、PE-anti-human CD337（NKp30）、PE-anti-human CD336（NKp44）、PE anti-human CD314（NKG2D）單克隆抗體購自美國 Biolegend 公司；IL-2 購自美國 PeproTech 公司；E-Plate 16 PET 和實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀購自美國 Agilent 公司；倒置熒光顯微鏡購自日本 Olympus 公司；流式細(xì)胞儀購自美國 BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

⑴A549 和 HCT8 細(xì)胞：用含有 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，每2 ～ 3 天換液一次。

⑵臍血單個核細(xì)胞分離：在產(chǎn)婦知情同意情況下，采集足月妊娠產(chǎn)婦經(jīng)產(chǎn)道或剖宮產(chǎn)分娩的胎兒臍靜脈血（倫理審批件號：CGYJ-BD-080-V2），經(jīng) 3000 r/min 離心 10 min，取上層血漿放入水浴鍋中 56 ℃加熱 30 min 以滅活補(bǔ)體，將滅活后的血漿經(jīng) 3000 r/min 離心 10 min，保留上層血漿備用。使用生理鹽水對下層血細(xì)胞進(jìn)行等體積稀釋，使用 1 體積淋巴分離液對 2 體積血細(xì)胞進(jìn)行分離以獲得臍血單個核細(xì)胞，之后使用生理鹽水清洗 2 次。

⑶ NK 細(xì)胞體外擴(kuò)增：在無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基（RUO）中加入 10% 自體血漿、2000 IU/ml 重組人 IL-2、25 ng/ml 重組人IL-15 和 NK 細(xì)胞活化因子（實(shí)驗(yàn)室自研，成分主要涉及小分子抑制劑和蛋白類活性因子）配置成完全培養(yǎng)基 1。使用完全培養(yǎng)基 1 接種細(xì)胞，數(shù)量為（1 ～ 3）× 106個/ml。細(xì)胞置于 37 ℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng) 4 d 后離心棄去上層培養(yǎng)基。用包含 2000 IU/ml 重組人 IL-2 的 X-VIVO 完全培養(yǎng)基 2 重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為 1 × 106個/ml 后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，依據(jù)細(xì)胞生長情況補(bǔ)充新鮮 X-VIVO 完全培養(yǎng)基 2。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至 14 d 左右，收獲細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測 取 1 × 106個 NK 細(xì)胞進(jìn)行表型檢測，1500 r/min 離心 3 min。棄去離心管內(nèi)上層培養(yǎng)液后使用 5 ml PBS 重懸下層細(xì)胞，再次進(jìn)行離心后棄去上層 PBS 液。使用 300 μl PBS 重懸細(xì)胞，對照管和試驗(yàn)管每管加入 50 μl 細(xì)胞懸液，試驗(yàn)管加入 CD56-APC、CD3-FITC、CD16-PE?NKG2D-PE?NKp44-PE 和 NKp30-PE 單克隆抗體，避光孵育 15 min 后每管使用 1 ml PBS 離心洗去未結(jié)合的抗體，150 μl PBS 重懸細(xì)胞，上機(jī)進(jìn)行 NK 細(xì)胞表型分析。

1.2.3 實(shí)時無標(biāo)記動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)檢測 NK 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 將狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前一天進(jìn)行鋪板，以處在對數(shù)生長期為宜。離心消化細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)基調(diào)整腫瘤細(xì)胞數(shù)量至 1 × 104個/孔接種于 E-Plate 16 板中，置于實(shí)時無標(biāo)記動態(tài)細(xì)胞分析（RTCA）儀實(shí)時動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞增殖曲線。

第二天配制合適的 NK 細(xì)胞濃度，取出 E-Plate 16 板，按相同體積加入不同效靶比 NK 細(xì)胞，對照組加入等體積培養(yǎng)基，使用 RTCA技術(shù)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，觀察 NK 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK 細(xì)胞培養(yǎng)及表型鑒定

對臍帶血提取出的單個核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)前 4 天細(xì)胞增殖較慢，細(xì)胞由分散的單個細(xì)胞逐漸生長成為包含數(shù)個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞培養(yǎng)至第 7 天后開始進(jìn)入大量擴(kuò)增時期。培養(yǎng)至第 14 天，每 20 ml 臍血，細(xì)胞總數(shù)從 2.03 × 107個擴(kuò)增至 5.98 × 109個，擴(kuò)增 294 倍；NK 細(xì)胞從1.05 × 106個擴(kuò)增至 5.86 × 109個，擴(kuò)增 5580 倍（圖 1）。表型為 CD3-CD56+的 NK 細(xì)胞由培養(yǎng)前的 5.18% 增加到培養(yǎng)后的 97.93%（圖 2）。

該結(jié)果表明，單個核細(xì)胞已基本誘導(dǎo)成 NK 細(xì)胞。擴(kuò)增后 NK 細(xì)胞表面活化性受體 CD16?NKp44?NKp30 和 NKG2D 的表達(dá)均大于 95%，表明擴(kuò)增后 NK 細(xì)胞具有較好的活化程度（圖 3）。

圖 1 NK 細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增情況（A）與顯微鏡下形態(tài)（200 ×）（B）

Figure 1 Amplification (A) and microscopic morphology (B) of NK cells (200 ×)

圖 2 培養(yǎng)前（A）和培養(yǎng) 14 天后（B）流式細(xì)胞術(shù)檢測 NK 細(xì)胞純度

Figure 2 The purity of NK cells was detected by flow cytometry before (A) and 14 days after culture (B)

圖 3 NK 細(xì)胞表達(dá) CD16（A）和 NKG2D（B）、NKp30（C）、NKp44（D）等活化性受體情況

Figure 3 Expression of CD16 (A), NKG2D (B), NKp30 (C) and NKp44 (D) activated receptors in NK cells

2.2 NK 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性

以培養(yǎng) 14 d 的 NK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，肺癌細(xì)胞株 A549 和結(jié)腸癌細(xì)胞株 HCT8 為靶細(xì)胞，驗(yàn)證 NK 細(xì)胞對實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。以 A549 細(xì)胞為靶細(xì)胞時，隨著作用時間的延長和效靶比的提高，殺傷作用逐漸增強(qiáng)。以作用 6 h 的殺傷活性為例，在 1:1 ～ 10:1 效靶比范圍內(nèi)，隨著效靶比增加，NK 對腫瘤細(xì)胞殺傷活性從（78.16 ± 2.41）%逐漸增強(qiáng)到（95.71 ± 3.21）%；并且在效靶比 1:1 的情況下，隨著作用時間從 6 h 延長到 24 h，殺傷活性也從（78.16 ± 2.41）% 逐漸增強(qiáng)到（96.33 ± 2.15）%，說明 NK 細(xì)胞對 A549 的殺傷活性具有時間和劑量依賴性（圖 4）。以 HCT8 細(xì)胞為靶細(xì)胞時，殺傷活性隨效靶比的提高，增強(qiáng)效果雖然不明顯，但即使在 1:1 效靶比的情況，NK 細(xì)胞對 HCT8 細(xì)胞的殺傷作用已非常顯著（圖 5），說明與 A549 相比，NK 細(xì)胞對 HCT8 細(xì)胞的殺傷活性更強(qiáng)，因此可在更低效靶比的條件下，進(jìn)一步考察 NK 細(xì)胞對 HCT8 的殺傷活性。

圖 4 NK 細(xì)胞對肺癌細(xì)胞株 A549 殺傷作用（與效靶比1:1 組相比，*P < 0.05；與作用6 h 組相比，#P < 0.05）

Figure 4 Killing effect of NK cells on lung cancer cell line A549 (Compared with the effect-target ratio 1:1 group,*< 0.05;Compared with the 6 h group,#< 0.05)

圖 5 NK 細(xì)胞對結(jié)腸癌細(xì)胞株 HCT8 殺傷作用

Figure 5 Killing effect of NK cells on colon cancer cell line HCT8

3 討論

近些年，腫瘤的免疫治療成為繼常規(guī)手術(shù)、放化療之后的新興治療方法。細(xì)胞治療作為免疫治療的重要組成部分，其原理為依據(jù)人體的非特異性免疫作用，啟動并維持腫瘤-免疫循環(huán)，恢復(fù)機(jī)體正常的抗腫瘤免疫反應(yīng)。細(xì)胞治療通過給患者回輸體外擴(kuò)增的具有高活性的免疫細(xì)胞[3-4]，增加免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的清除能力。

作為人體抗腫瘤的主力軍，NK 細(xì)胞能夠通過多種途徑發(fā)揮作用，包括顆粒酶與穿孔素途徑、細(xì)胞因子途徑、Fas/FasL 途徑、ADCC 途徑等。同時，NK 細(xì)胞還能夠通過分泌某些細(xì)胞因子來促進(jìn)調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞凋亡、招募樹突狀細(xì)胞增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞周圍的免疫細(xì)胞浸潤等方式調(diào)節(jié)免疫功能[5-6]。

基于回輸 NK 細(xì)胞的免疫治療要求，NK 細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)充足、活性應(yīng)穩(wěn)定。因此，通過特定培養(yǎng)方式獲得大量且穩(wěn)定的 NK 細(xì)胞是開展臨床試驗(yàn)的前提。現(xiàn)階段開展免疫細(xì)胞回輸治療成本較高，通過不斷優(yōu)化現(xiàn)有細(xì)胞制備工藝，探索新的細(xì)胞制備工藝，盡可能降低生產(chǎn)成本依然十分重要。目前，關(guān)于 NK 細(xì)胞培養(yǎng)主要有以下兩種方式：一是使用輻照后基因工程改造過的細(xì)胞（一般為腫瘤細(xì)胞系）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞與 NK 細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，在飼養(yǎng)細(xì)胞的作用下可使 NK 細(xì)胞增殖至數(shù)萬倍，純度在 90% 左右。但飼養(yǎng)細(xì)胞的存在會增加細(xì)胞產(chǎn)品的使用風(fēng)險(xiǎn)[7-9]；二是首先通過流式細(xì)胞儀或者磁珠分選儀分選富集造血干細(xì)胞，在 NK 細(xì)胞的培養(yǎng)過程中加入 SCF、TPO、IL-7、Flt3L、IL-2 和 IL-15 等細(xì)胞因子刺激造血干細(xì)胞的分化以及 NK 細(xì)胞的大量增殖[10-13]。目前 NK 細(xì)胞擴(kuò)增體系正在朝著無需預(yù)先分選、無需飼養(yǎng)層細(xì)胞、無需血清的方向發(fā)展[14]。

國外有研究通過使用磁珠分選技術(shù)在臍帶血中分離出以 CD34+為主的造血干細(xì)胞，經(jīng)過 40 d 左右培養(yǎng)后，細(xì)胞擴(kuò)增超過 2000 倍，所得到的 NK 細(xì)胞純度能夠達(dá)到 90% 以上[15]。也有研究建立了以胚胎干細(xì)胞為起點(diǎn)的 NK 細(xì)胞培養(yǎng)體系，經(jīng)過 30 d 左右的培養(yǎng)得到純度超過 90% 的 NK 細(xì)胞[16-17]。使用商品化試劑盒培養(yǎng) 50 ml 臍血中提取出的單個核細(xì)胞，在 14 d 左右單個核細(xì)胞擴(kuò)增 213 倍，表型為 CD3-CD56+的 NK 細(xì)胞占比為 76.4%[18]。本研究通過使用實(shí)驗(yàn)室自研的 NK 細(xì)胞活化因子，體外培養(yǎng)單個核細(xì)胞 14 d 即可獲得純度高達(dá) 98%，擴(kuò)增倍數(shù)超過 5000 倍的 NK 細(xì)胞，且 NK 細(xì)胞表面多種激活性受體表達(dá)量均在 95% 以上，表明該培養(yǎng)方法優(yōu)于已有文獻(xiàn)報(bào)道方法。在體外實(shí)驗(yàn)中，也驗(yàn)證了擴(kuò)增的 NK 細(xì)胞對某些實(shí)體瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷活性。

本實(shí)驗(yàn)成功探索出一種可在體外大規(guī)模培養(yǎng) NK 細(xì)胞的方法，無需滋養(yǎng)層細(xì)胞，無需分選，直接誘導(dǎo)臍血單個核細(xì)胞成高純度的 NK 細(xì)胞，并且培養(yǎng)出來的 NK 細(xì)胞高度活化，對肺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞均具有顯著的殺傷活性，殺傷作用隨效靶比和作用時間的增加而增強(qiáng)。本研究為臍血源 NK 細(xì)胞的臨床研究和應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Efficient expansion of NK cells derived from cord bloodand their killing activity of tumor cells

HAN Qiang, ZHANG Zhi-gang, LIU Kun, ZHU Xian-dui, JIN Yuan-yuan, ZHANG Zhi-fei, YANG Zhao-yong

Author Affiliations: School of Pharmacy, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China (HAN Qiang, LIU Kun, ZHU Xian-dui, ZHANG Zhi-fei); Department of Pathology, Cangzhou People's Hospital, Hebei 061000, China(ZHANG Zhi-gang); Department of Microbial Pathway Engineering, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (JIN Yuan-yuan, YANG Zhao-yong)

To study the culture method of NK cells derived from cord blood mononuclear cells and their killing activity of different types of tumor cells.After disinfection of umbilical vein, umbilical cord blood was collected completely and anticoagulated with heparin, then the umbilical cord blood mononuclear cells were isolated and cultured in NK cell culture medium for 14 days. Their surface markers were detected by flow cytometry. The cell proliferation curve and the killing effects of NK effector cells on tumor cells were examined according to the effective target ratio of 1:1, 5:1 and 10:1 by RTCA real-time unlabeled cell analysis technology.Cord blood mononuclear cells cultured for 14 days expanded 294 times in total, including 5580 times in NK cells. The positive rate of CD3-CD56+cell subsets of NK cells cultured for 14 days was 97.93%, and the positive rate of CD16, NKG2D, NKp30 and NKp44 importantly for killing function were more than 95%. When the NK-killing activity of A549 lung cancer cell line for 6 h was in the range of 1:1 - 10:1 of effector: target ratio, the killing activity gradually increased from (78.16 ± 2.41)% to (95.71 ± 3.21)% with the increase of the ratio; The killing activity increased from (78.16 ± 2.41)% to (96.33 ± 2.15)% with the extension of action time from 6 h to 24 h when the effective target ratio was 1:1.This method does not need cell sorting and trophoblast cells. It has the advantages of simple operation, strong universality, high purity of cultured umbilical cord blood NK cells and strong lethality to tumor cells.

natural killer cell; cord blood; surface marking; real time cellular analysis; in vitro amplification; anti-tumor

JIN Yuan-yuan, Email: jinyuanyuan@imb.pumc.edu.cn; ZHANG Zhi-fei, Email: zhangzhifeifei7208@ 163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.004

河北省自然科學(xué)基金（B2020209001）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81872782）

金媛媛，Email：jinyuanyuan@imb.pumc.edu.cn；張志斐，Email：zhangzhifeifei7208@163.com

2022-02-07

*同為第一作者