廣陳皮中黃酮類化合物提取物對(duì)t-BHP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用機(jī)制

陶葉杏，余倩，劉瑞婷，張曦文，吳婷，潘思軼，徐曉云

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/果蔬加工與品質(zhì)調(diào)控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070

廣陳皮（Pericarpium Citri Reticulatae‘Chachi’，PCR-C）來(lái)源于茶枝柑（Citri reticulata‘Chachi’）的干燥成熟果皮，主要產(chǎn)于廣東省江門市新會(huì)區(qū)［1］。研究表明，PCR-C 具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗哮喘、神經(jīng)保護(hù)作用等生物活性［2-3］。黃酮類化合物是PCR-C 中的主要活性成分，主要包括橙皮苷、川陳皮素、橘皮素等糖苷黃酮類化合物和多甲氧基黃酮類化合物［4］。而且，黃酮類化合物的動(dòng)態(tài)變化對(duì)PCRC質(zhì)量和活性的影響尚不清楚。

氧化應(yīng)激與人類多種慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［5］。黃酮類化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化生物活性，可以作為一種間接抗氧化劑，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)來(lái)激活體內(nèi)的抗氧化機(jī)制，從而維持機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)［6］。調(diào)控細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的一系列抗氧化酶和解毒酶主要包括醌氧化還原酶1（NQO1）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-Ω1（GSTO1）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）以及血紅素加氧酶-1（HO-1），在氧化應(yīng)激損傷下，能夠清除體內(nèi)多余的活性氧，從而在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用［7］。而Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）是一種核因子E2 相關(guān)因子2，這些抗氧化酶的表達(dá)由Nrf2 進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)Nrf2 被激活后，Nrf2 與Keap1 蛋白發(fā)生解離，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件ARE 進(jìn)行結(jié)合，從而誘導(dǎo)下游抗氧化酶的表達(dá)，發(fā)揮維持機(jī)體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的作用［8］。黃酮類化合物可通過(guò)Nrf2-ARE 抗氧化信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化活性，成為一種潛在的Nrf2 激活劑［9］。橘皮素能夠有效抑制叔丁基過(guò)氧化氫（t-BHP）誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中ROS 水平的升高，減弱氧化應(yīng)激損傷對(duì)GSH 的消耗，通過(guò)促進(jìn)Nrf2入核激活下游抗氧化酶HO-1 和NQO1 的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化活性［10］。

本研究以新鮮干燥果皮以及貯藏1、10 a 的廣陳皮為研究對(duì)象，分析廣陳皮在陳化過(guò)程中黃酮類化合物的含量變化；以t-BHP 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的人肝癌細(xì)胞HepG2 細(xì)胞為模型，探究PCR-CF 的抗氧化活性作用，并通過(guò)qRT-PCR 和Western blot 技術(shù)研究PCR-C10F 的抗氧化作用分子機(jī)制，旨在探究廣陳皮在陳化過(guò)程中黃酮類化合物含量變化與抗氧化活性的相關(guān)性，為陳皮的品質(zhì)控制及合理使用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

人肝癌細(xì)胞（human hepatoma cell，HepG2 cell）購(gòu)買于中科院上海細(xì)胞庫(kù)干細(xì)胞庫(kù)。新鮮果皮、貯藏1 a和10 a的PCR-C 藥材，購(gòu)自廣東省江門市新會(huì)區(qū)雙水鎮(zhèn)柑澤園，樣品經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定。MEM 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)于南烏拉圭Quacell 公司；色譜級(jí)的乙腈購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；色譜級(jí)的甲酸購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；BCA 法蛋白測(cè)定試劑盒（BCA02）購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛科技有限公司；GSH（A006-2-1）、MDA（A003-4-1）、T-SOD（A001-1-2）試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技有限公司；RNApure 超純總RNA 快速提取試劑盒購(gòu)于北京艾德萊生物科技有限公司；熒光定量PCR 所用引物合成，購(gòu)于北京擎科生物科技公司；TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒和TaKaRa Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A），均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（P0028）；小鼠單抗β -actin（BM0627）、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗（BA1051）、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（BA1054）均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；兔多抗Nrf2（A0674）購(gòu)于武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔多抗HO-1（10701-1-AP）購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔多抗NQO1（DF6437）購(gòu)于美國(guó)Affinity Biosciences 公司；兔多抗SOD1（PA5-27240）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；兔單抗GSTO1（ab138491）和兔多抗GSH-Px（ab22604）購(gòu)于Abcam 公司；小鼠單抗Histone H3（bsm-33042M）購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

超聲破碎儀，VCX750，美國(guó)索尼克斯；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，MU?TISKAN GO，美國(guó)Thermo 公司；高效液相色譜儀，e2695，美國(guó)Waters 公司；微量核酸測(cè)定儀，NanoDrop2000，美國(guó)NanoDrop Technologies 公司；電泳儀，DYY-8C，北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，Gel Doc XR+，美國(guó)?I-COR 公司；熒光定量PCR 儀，Qtower2.2，德國(guó)Analytik JenaAG 公司；垂直電泳槽，DYCZ-24DN，北京六一儀器廠；電轉(zhuǎn)儀，DYCZ-40，北京六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1）HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗及MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待其長(zhǎng)至瓶壁的80%左右，用胰蛋白酶消化傳代，每隔3～4 d傳代1次。

2）廣陳皮中黃酮類化合物的提取純化。參照筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究方法［11］，用80%乙醇超聲輔助提取，料液比1∶20（g/m?），超聲輔助提取30 min，超聲頻率40 kHz，功率480 W，提取溫度25 ℃。用HPD300 樹脂進(jìn)行純化富集，最后冷凍干燥得到PCR-CF。

3）HP?C 分析。參照筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究方法［11］，使用Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）作為流動(dòng)相，梯度洗脫條件為15%～25% B（0～5 min），25%～35% B（5～20 min），35%～45% B（20～40 min），45%～75% B（40～45 min），75%～85% B（45～50 min），85%～15% B（50～55 min），保持15% B 持續(xù)5 min。色譜柱溫度為25 °C，流速為1 m?/min，進(jìn)樣量為20 μ?，設(shè)定280、330 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

4）SOD、GSH、MDA 水平的測(cè)定。參照筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究方法［11］，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞按照5×105個(gè)/m?接種于6孔板中，過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。向樣品組和樣品對(duì)照組加入50 μg/m?PCR-CF 樣品，設(shè)置空白對(duì)照組和模型組，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，藥物作用24 h 后，模型組及樣品組均加入300 μmol/?t-BHP 刺激誘導(dǎo)細(xì)胞3 h。待細(xì)胞處理結(jié)束后，收集細(xì)胞超聲破碎取上清，按SOD、GSH、MDA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作測(cè)定各個(gè)指標(biāo)，并按照BCA 蛋白試劑盒測(cè)定蛋白含量。

5）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)基因表達(dá)水平。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞按照6×105個(gè)/m?濃度接種于12 孔板中，過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。向樣品組和樣品對(duì)照組加入50 μg/m?PCR-C10F 樣品，設(shè)置空白對(duì)照組和模型組，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，藥物作用24 h 后，模型組及樣品組均加入300 μmol/?t-BHP刺激誘導(dǎo)細(xì)胞3 h。待細(xì)胞處理結(jié)束后，采用RNA pure 超純總RNA 快速提取試劑盒進(jìn)行RNA 的提取，使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒進(jìn)行qRTPCR分析。以GAPDH為內(nèi)參，采用2--ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。所用引物如表1所示。

表1 引物序列信息Table 1 Primers sequence

6）蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)蛋白表達(dá)。細(xì)胞的處理與分組與RNA 提取的細(xì)胞處理方式一致。用加入了蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA 細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取。按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒的方法得到細(xì)胞核蛋白。4 ℃、10 000 r/min，離心5 min，取上清并用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)目標(biāo)蛋白分子質(zhì)量大小選擇分離膠的濃度，先恒壓80 V 電泳至溴酚藍(lán)指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，再改為恒壓120 V 至溴酚藍(lán)到凝膠底部，約需90 min。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉的TBST 中封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，EC?顯影并進(jìn)行拍照。

7）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。試驗(yàn)至少有3 個(gè)獨(dú)立的平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean ±SD）表示。采用IBM SPSS Statistic Version 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素ANOVA方差分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-CF中主要黃酮類化合物的含量變化

PCR-CF 中主要黃酮類化合物含量如圖1 所示［12］，新鮮陳皮中，橙皮苷含量最高，其他主要黃酮類化合物如：異橙黃酮、甜橙黃酮、5，7，8，4'-四甲氧基黃酮、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮、橘皮素以及多甲氧基黃酮（PMFs）的總含量在貯藏10 a的陳皮中含量較高。

2.2 PCR-CF 對(duì)t-BHP 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化損傷的影響

細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH 和MDA 水平可以反映抗氧化活性水平。如表2所示，與模型組相比，F(xiàn)resh-F 和PCR-C10F 均能顯著提高HepG2 細(xì)胞中SOD 和GSH 的活力（P＜0.05），特別地，PCR-C10F 水平顯著高于Fresh-F（P＜0.05）；此外，F(xiàn)resh-F、PCRC01F 和PCR-C10F 均能顯著降低t-BHP 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)MDA 水平（P＜0.05），其中，PCR-C10F的MDA水平顯著低于Fresh-F 和PCR-C01F（P＜0.05）。結(jié)果表明，在t-BHP 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化損傷作用下，PCR-CF能夠有效改善細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮抗氧化作用，而且PCR-C10F 抗氧化活性較強(qiáng)。

表2 PCR-CF對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中SOD、GSH、MDA水平的影響Table 2 Effect of PCR-CF on t-BHP-induced the levels of SOD，GSH and MDA in HepG2 cells

PCR-CF 中所含的黃酮類化合物可能是其發(fā)揮抗氧化活性的關(guān)鍵成分，為了進(jìn)一步探究黃酮類化合物與抗氧化活性之間是否具有相關(guān)性，對(duì)PCR-CF中黃酮類化合物的含量與SOD、GSH 和MDA 水平進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析（表3），總PMFs 含量與SOD、GSH 水平呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（R2=0.845、0.934，P＜0.01），與MDA水平呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（R2=-0.903，P＜0.01）。在所分析的黃酮類化合物中，只有川陳皮素含量不僅與SOD、GSH 水平呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（R2=0.934、0.861，P＜0.01），而且與MDA 水平呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（R2=-0.918，P＜0.01）。結(jié)果表明，川陳皮素可能是PCR-CF減輕t-BHP 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化損傷的關(guān)鍵活性成分。

表3 PCR-CF中黃酮類化合物的含量與SOD、GSH和MDA水平相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation analysis between the content of flavonoids and the levels of SOD，GSH and MDA in PCR-CF

2.3 PCR-C10F對(duì)Nrf2 基因mRNA表達(dá)的影響

PCR-C10F 抗氧化活性較強(qiáng)，為了進(jìn)一步探究PCR-C10F 對(duì)t-BHP 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制，使用qRT-PCR 考察了PCR-C10F 對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2基因水平的影響。如圖2 所示，與模型組相比，在PCR-C10F 藥物干預(yù)作用下，細(xì)胞內(nèi)Nrf2基因mRNA 的表達(dá)水平極顯著上調(diào)（P＜0.001）。結(jié)果表明，PCR-C10F 能夠通過(guò)上調(diào)Nrf2基因mRNA 的表達(dá)，從而有效減輕t-BHP 誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷。

2.4 PCR-C10F對(duì)Nrf2蛋白轉(zhuǎn)移入核的影響

為了進(jìn)一步確定PCR-C10F 能否促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Nrf2 轉(zhuǎn)移入核，測(cè)定Nrf2 蛋白的表達(dá)情況。如圖3A，B 所示，與模型組相比，在PCR-C10F 藥物干預(yù)作用下，Nrf2 在胞核蛋白中的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。圖3A，C 表明，在PCR-C10F 藥物干預(yù)作用下，Nrf2 在總蛋白中的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。如圖3D 所示，與模型組相比，在PCR-C10F藥物干預(yù)作用下，Nrf2 入核率顯著增加（P＜0.05）。因此，以上結(jié)果表明，在t-BHP 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞氧化損傷作用下，PCR-C10F 能夠促進(jìn)HepG2 細(xì)胞中Nrf2 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，從而促使Nrf2 發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用。

2.5 PCR-C10F對(duì)抗氧化酶mRNA的影響

測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px、HO-1 基因的mRNA 表達(dá)水平，探究PCR-C10F 能否通過(guò)促進(jìn)Nrf2 入核上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)。如圖4A～E 所示，與模型組相比，在PCR-C10F藥物干預(yù)作用下，NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px基因的mRNA 表達(dá)水平極顯著上調(diào)（P＜0.001），HO-1基因的mRNA 表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.001）。以上結(jié)果表明，在t-BHP 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞氧化損傷的作用下，PCR-C10F 能夠通過(guò)上調(diào)Nrf2-ARE 抗氧化信號(hào)通路下游多種抗氧化酶基因（NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px）的表達(dá)，下調(diào)應(yīng)激反應(yīng)蛋白（HO-1）的基因表達(dá)，維持細(xì)胞氧化/抗氧化動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

2.6 PCR-C10F 對(duì)抗氧化酶和應(yīng)激反應(yīng)蛋白的影響

進(jìn)一步分析t-BHP 刺激誘導(dǎo)下HepG2 細(xì)胞中NQO1、GSTO1、SOD1、GSH-Px 抗氧化酶蛋白和HO-1 應(yīng)激反應(yīng)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5 所示，與模型組相比，在PCR-C10F 藥物干預(yù)作用下，NQO1 和SOD1 蛋白表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01），GSTO1 和GSH-Px 蛋白表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.001），HO-1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。因此，以上結(jié)果表明，在t-BHP 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞氧化損傷的作用下，PCR-C10F 能夠在基因和蛋白水平通過(guò)上調(diào)Nrf2-ARE 抗氧化信號(hào)通路下游多種抗氧化酶（NQO1、GSTO1、SOD1 和GSH-Px）的表達(dá)，下調(diào)應(yīng)激反應(yīng)蛋白（HO-1）的表達(dá)，從而維持細(xì)胞氧化/抗氧化動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞在氧化應(yīng)激損傷下的抗氧化防御能力。

3 討論

黃酮類化合物是陳皮發(fā)揮生物活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，中國(guó)藥典以橙皮苷含量作為陳皮質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，“陳久者良”在陳皮使用和市場(chǎng)定價(jià)中被廣泛認(rèn)同，然而橙皮苷含量變化與陳皮的陳化年限并不一致［14-15］。本研究結(jié)果也表明，不同貯藏年份的陳皮中橙皮苷的含量呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)，其中貯藏10 a 的陳皮中橙皮苷的含量較新鮮果皮顯著降低，提示需要引入更多的黃酮類化合物作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究顯示異橙黃酮、甜橙黃酮、5，7，8，4'-四甲氧基黃酮、川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮、橘皮素以及總PMFs，在陳化過(guò)程中雖然呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)，但PCRC10F 中的含量最高，整體上表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。這與?iang 等［15］提出的陳皮在陳化過(guò)程中，橙皮苷含量降低，橘皮素、川陳皮素等多甲氧基黃酮類化合物含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)相一致，多甲氧基黃酮類化合物的含量增加可能是陳皮在陳化過(guò)程中活性變化的重要影響因素。

t-BHP是一種氧化損傷誘導(dǎo)劑，可以與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子反應(yīng)引起氧化損傷［16］。因此，選擇t-BHP 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化損傷模型探究PCR-CF 的抗氧化活性，結(jié)果表明，PCR-CF 可通過(guò)提高SOD 活性和GSH 含量，減少t-BHP 誘導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)量MDA，發(fā)揮抗氧化活性作用；而且在陳化的過(guò)程中，呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，其中以PCR-C10F 的氧化應(yīng)激保護(hù)作用最顯著。

在正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1以二聚體的形式定位于細(xì)胞質(zhì)中；而一旦受到外界刺激，Nrf2 就會(huì)與Keap1 發(fā)生解離，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)至細(xì)胞核中，并與ARE 作用，激活下游一系列抗氧化酶的表達(dá)［17］。本研究表明，在PCR-C10F 干預(yù)下，Nrf2 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在基因和蛋白水平上均顯著上調(diào)，而且能夠促進(jìn)Nrf2 轉(zhuǎn)移入核，增加其在細(xì)胞核中的累積，從而提高細(xì)胞的抗氧化防御能力。研究表明，陳皮的多甲氧基黃酮類成分提取物能夠通過(guò)激活Nrf2 信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗氧化活性作用［18］，這與本研究結(jié)果一致。此外，PCR-C10F 使細(xì)胞保護(hù)蛋白NQO1、GSTO1、SOD1 以及GSH-Px 在基因和蛋白水平均顯著增加，并下調(diào)HO-1 的表達(dá)。與本研究結(jié)果一致的是，甜橙皮水提取物以及其主要成分橙皮苷、橘皮素和川陳皮素［19］可通過(guò)上調(diào)t-BHP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中GSH-Px 和CAT 的表達(dá)來(lái)抵御氧化應(yīng)激損傷。而且，研究表明當(dāng)HepG2 細(xì)胞暴露于氧化劑的氧化應(yīng)激損傷下，HO-1的mRNA 水平和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)［20］，黃酮類化合物可以減弱氧化劑誘導(dǎo)的HO-1的表達(dá)水平［21］。由此可見，PCR-C10F 通過(guò)促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)移入核，激活Nrf2-ARE 抗氧化信號(hào)通路下游NQO1、SOD1、GSTO1 和GSH-Px 4種抗氧化酶mRNA 和蛋白的表達(dá)，下調(diào)應(yīng)激反應(yīng)蛋白HO-1的表達(dá)，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮抗氧化活性。

綜上所述，陳皮在陳化過(guò)程中多甲氧基黃酮類化合物含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，而且其抗氧化活性也隨之增強(qiáng)，而且川陳皮素的積累可能是主要的因素。PCR-C10F表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠通過(guò)調(diào)控Nrf2-ARE 抗氧化通路下游抗氧化酶mRNA 和蛋白的表達(dá)減輕t-BHP 對(duì)HepG2 細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮抗氧化活性，為陳皮發(fā)揮間接抗氧化活性作用機(jī)制的研究提供了理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為陳皮的合理貯藏及使用提供一定的理論依據(jù)。本研究由于只選取了同一產(chǎn)地同一果園的樣本，而且不同年份的樣本量有限，還需進(jìn)一步擴(kuò)充樣品的品種來(lái)源及年份深入開展研究。