響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲法提取菊芋花青素工藝

李娟，彭健瑋，孫雪梅*

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室,西寧 810016；2.滬青蔬菜種質(zhì)資源創(chuàng)新與基因組學(xué)聯(lián)合實驗室，西寧 810016)

菊芋(HelianthustuberosusL.)，又名洋姜，是菊科植物，原產(chǎn)于北美洲[1]。菊芋塊莖是無污染的綠色食品[2]，其中豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、微量Mg2+等元素使得菊芋成為一種優(yōu)良的多汁飼料[3]。菊芋塊莖既可作為菊芋果干生食，也可腌制后食用[4]。菊芋的塊莖表皮有白、粉、紫、紅等不同顏色，其差異主要是由花青素組分及含量不同導(dǎo)致的[5]。有色塊莖菊芋表皮中含有較高的花色苷等酚類物質(zhì)，目前可用于天然色素和抗氧化劑的生產(chǎn)，從而增大了菊芋的利用范圍[6]。目前，針對菊芋塊莖花青素提取工藝優(yōu)化的相關(guān)研究較少，且目前花青素的提取方法主要為超聲波輔助提取法[7]，因此本文以超聲法輔助提取菊芋塊莖花青素。

在菊芋超聲輔助提取花青素過程中，料液比、超聲時間等因素對花青素的提取都有一定影響, 為了獲得較為高效的提取工藝,必須對工藝參數(shù)進行優(yōu)化。響應(yīng)面法已在植物花青素等物質(zhì)提取工藝優(yōu)化方面得到廣泛的應(yīng)用[8-9]。遺傳算法具有全局尋優(yōu)的特征[10]。為了探究適合超聲輔助提取菊芋花青素工藝的優(yōu)化方法，將兩者結(jié)合可以達到較好的預(yù)測和優(yōu)化效果，實現(xiàn)優(yōu)化工藝參數(shù)的目的，以期為菊芋花青素的提取工藝提供基礎(chǔ)，使菊芋得到更好的利用與發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊芋樣品(JA88 紫色)：由青海省農(nóng)林科學(xué)院提供；試驗試劑：國產(chǎn)AR。

1.2 儀器與設(shè)備

SPECORD 210 Plus紫外可見分光光度計;SB25-12DT超聲波清洗機;4-16KS離心機;101-2A鼓風(fēng)干燥箱；Milli-Q IQ7000水純化系統(tǒng)；MS303S/01天平。

1.3 方法

1.3.1 菊芋塊莖表皮粉末的制備

將成熟收獲的菊芋塊莖用超純水洗凈，取其表皮烘干，粉碎，過篩。

1.3.2 菊芋表皮花青素的提取

準(zhǔn)確稱取菊芋表皮粉末0.1 g，根據(jù)料液比添加乙醇和鹽酸的混合溶液，搖勻。在一定的溫度下，采用超聲法提取花青素，取出，離心10 min后，取得溶液上清液。

1.3.3 緩沖液的配制

pH 1.0的緩沖溶液：配制0.2 mol/L KCl與0.2 mol/L HCl溶液，借助pH計調(diào)pH至1.0±0.1。

pH 4.5的緩沖溶液：配制0.2 mol/L NaAc與0.2 mol/L HCl溶液，借助pH計調(diào)pH至4.5±0.1[11]。

1.3.4 最大吸收波長的選擇

將樣品分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液稀釋處理，測定樣品最佳吸光值[12]。

1.3.5 花青素含量的測定

取1 mL上清液，將其分別加入9 mL pH 1.0和pH 4.5的緩沖液中，搖勻，充分反應(yīng)，在Max nm和700 nm波長條件下，用1 cm比色皿，測定吸光值,計算出花青素的含量(mg/g),由此作為計算菊芋表皮花青素含量的指標(biāo)。每組進行3個重復(fù)樣本,每次試驗做取超純水進行試驗的空白對照。菊芋表皮花青素得率按下式計算[13]:

A=(AMax nm-A700 nm)pH 1.0-(AMax nm-A700 nm)pH 4.5。

式中:A為總吸光值；ε為26900 L/(mol·cm)；L為1 cm；MW為449.2 g/mol；DF為稀釋10倍；V為10 mL；Mt為0.1 g。

1.3.6 超聲法提取菊芋花青素單因素試驗

按1.3.2和1.3.5試驗。一次只變化一個選定因素，把該因素最優(yōu)取值選為考察另外因素的已知條件, 每個試驗重復(fù)3次，完成所有因素的最優(yōu)取值。

1.3.7 Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計

PB試驗采用較少的試驗次數(shù)，但卻可以從多個因素中尋找到對試驗?zāi)繕?biāo)起到顯著影響的一些因素[14]。根據(jù)之前單因素試驗結(jié)果，PB試驗選擇5個因素，以花青素含量為響應(yīng)值。PB試驗設(shè)計見表1。

表1 PB試驗因素與水平

1.3.8 最陡爬坡試驗

在之前所做PB試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進行最陡爬坡試驗，獲得最佳條件區(qū)間，同時可將結(jié)果設(shè)為響應(yīng)面中心點進行試驗[15]。

1.3.9 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在之前試驗的基礎(chǔ)上，以Box-Behnken原理為依據(jù)，料液比(A)、超聲時間(B) 和乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)作為試驗因素，其余因素為超聲溫度40 ℃、鹽酸濃度0.3 mol/L，見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016、Origin 2021、SPSS 26.0、Design-Expert 13和Matlab 2016完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對花青素提取量的影響

由圖1可知，用95%乙醇提取菊芋塊莖表皮花青素，超聲溫度40 ℃、超聲時間40 min、鹽酸濃度0.1 mol/L，菊芋花青素的提取值在1∶30 (g/mL) 條件下達到最大，在更高料液比下，提取的花青素含量沒有差異顯著(P>0.05)。綜上，料液比選為1∶30 (g/mL)。

圖1 料液比對花青素提取量的影響

2.1.2 超聲時間對花青素提取量的影響

由圖2可知，選擇料液比1∶30 (g/mL)，95%乙醇、超聲溫度40 ℃、鹽酸濃度0.1 mol/L，超聲時間不斷變化，菊芋花青素的提取量也不斷變化，但其并沒有呈現(xiàn)顯著變化，且超聲時間為90 min時，提取的花青素含量最高。綜上，超聲時間90 min為最佳單因素。

圖2 超聲時間對花青素提取量的影響

2.1.3 超聲溫度對花青素提取量的影響

由圖3可知，選擇料液比1∶30 (g/mL)、95%乙醇、超聲時間90 min、鹽酸濃度0.1 mol/L，隨著超聲溫度不斷上升，提取的花青素含量先上升后下降，40 ℃時提取量達到最大值27.02 mg/g，且溫度上升至80 ℃時，含量大幅度降低，符合花青素遇高溫降解的特性[16]。因此，超聲溫度選擇40 ℃。

圖3 超聲溫度對花青素提取量的影響

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取量的影響

由圖4可知，選擇料液比1∶30 (g/mL)、超聲溫度40 ℃、超聲時間90 min、鹽酸濃度0.1 mol/L，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大, 提取量呈現(xiàn)“Z”形趨勢，在50%的條件下，提取量達到最大值17.63 mg/g，隨后降低再升高。綜上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)50%為最佳單因素。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取量的影響

2.1.5 鹽酸濃度對花青素提取量的影響

圖5 鹽酸濃度對花青素提取量的影響

選擇料液比1∶30 (g/mL)、超聲溫度40 ℃、超聲時間90 min、乙醇濃度50%，不斷增加鹽酸濃度,菊芋花青素的提取量呈現(xiàn)升高的趨勢，在濃度為0.3 mol/L時獲得最大值27.79 mg/g，隨后降低再升高并且趨于穩(wěn)定。綜上，選擇鹽酸濃度0.3 mol/L為最佳單因素。

2.2 PB試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)構(gòu)建模型，其P值為0.0016<0.01，為非常顯著水平，說明設(shè)計的該模型符合標(biāo)準(zhǔn)，PB試驗設(shè)計與結(jié)果及效應(yīng)分析見表3和表4。試驗因素對菊芋花青素提取量的影響程度是：乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>超聲時間>鹽酸濃度>超聲溫度，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)為極顯著水平(P<0.001)，對花青素含量的提取為正向影響；料液比為非常顯著水平(0.001>P>0.01)，對花青素含量的提取為負向影響；超聲時間為顯著水平(0.01>P>0.05)，對花青素含量的提取為正向影響，其余因素沒有顯著影響。BB試驗最少需要3個試驗因素[17]，因此，結(jié)合試驗結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和超聲時間進行最陡爬坡試驗。

表3 PB試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 PB試驗設(shè)計效應(yīng)分析

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素的提取為正向影響，料液比為負向影響(見表4)，所以增大超聲時間及乙醇體積分?jǐn)?shù)，縮小料液比有助于花青素的提取，綜合以上3個因素，根據(jù)正負影響，設(shè)計步長和爬坡方向，與此同時更改因素區(qū)間，從而快速篩選出因素的最佳區(qū)域。由表5可知，組4為最合適的方案，故以此為響應(yīng)面的中心設(shè)計。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果及方差分析

根據(jù)之前的試驗結(jié)果，經(jīng)過BB試驗，得到數(shù)據(jù)結(jié)果，見表6和表7。同時獲得相關(guān)方程：花青素提取量(mg/g)=30.55-3.13A+2.3B+2.51C-1.67AB-6.26AC-0.4175BC-2.33A2-6.51B2-6.09C2。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表7 響應(yīng)面試驗方差分析

模型的P值為0.0027，極顯著，失擬項的P值為0.1501，大于0.05，不顯著，R2=0.9304，表明模型擬合度良好，同時表明模型可以反映對菊芋花青素提取的預(yù)測(見表7)。

2.4.2 響應(yīng)面分析

對響應(yīng)面得到的試驗結(jié)果進行分析，從而獲得各因素交互對菊芋花青素獲得提取值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖，見圖6。獲得的響應(yīng)面圖都較為平緩，說明因素變化對響應(yīng)值的影響不敏感。等高線圖d、e的橢圓形狀都較明顯，表明AB、AD之間交互作用顯著[18-20]，等高線圖f為圓形，說明BD交互作用不顯著。

圖6 因素交互對花青素提取量影響的響應(yīng)面圖與等高線圖

綜合之前的結(jié)論,其回歸模型預(yù)測的最適合工藝條件為：超聲溫度40 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲時間112.79 min，料液比1∶15 (g/mL),鹽酸濃度0.3 mol/L，花青素理論提取值為35.019 mg/g。

2.5 基于遺傳算法的多目標(biāo)優(yōu)化

根據(jù)上述響應(yīng)面進行數(shù)學(xué)模型的參數(shù)優(yōu)化(見圖7)，根據(jù)遺傳算法來編程，從而找到最優(yōu)解。模型約束情況為：Lower=[-1，-1，-1]；Upper=[1,1,1]。相關(guān)參數(shù):種群數(shù)為180，最大代數(shù)為120，其他為系統(tǒng)的默認取值。

圖7 遺傳算法函數(shù)變化曲線

經(jīng)過算法計算，運行結(jié)果為: X={-1, 0.2768, 0.7105}，即料液比1∶15 (g/mL)、超聲時間112.76 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)71.05%，目標(biāo)函數(shù)值為-35.0053。

考慮到實際操作的可行性, 將工藝條件改進為超聲溫度40 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲時間113 min，料液比1∶15 (g/mL)，鹽酸濃度0.3 mol/L。遺傳算法優(yōu)化的試驗結(jié)果與響應(yīng)面結(jié)果大致相同，證明該提取工藝可行。

3 討論

通過響應(yīng)面法分析，對設(shè)計變量進行探討：研究各因素對菊芋塊莖花青素提取量的影響，從而建立模型，進行相關(guān)分析，其模型顯著,說明該模型較為可信，可模擬不同因素情況下菊芋花青素的提取值。同時本研究發(fā)現(xiàn)，料液比為1∶15 (g/mL)、鹽酸濃度為0.3 mol/L，與張臘臘等[21]在紫薯花青素提取方面的研究結(jié)論基本相同；乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，與熊穎等[22]對藍莓酒渣花青素提取的工藝優(yōu)化相同；超聲溫度為40 ℃，與蔡珊等[23]關(guān)于鳳仙花花青素的超聲輔助提取工藝的優(yōu)化因素大體一致；超聲時間為113 min，與許娟妮等[24]研究的紫馬鈴薯塊莖花青素的提取工藝相一致。

在單因素試驗分析中，超聲溫度40 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲時間90 min、料液比1∶15 (g/mL)、鹽酸濃度0.3 mol/L為菊芋花青素的最優(yōu)提取條件。綜上，提取菊芋花青素實際的最優(yōu)情況為：料液比1∶15 (g/mL)，超聲時間113 min，超聲溫度40 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。菊芋花青素模型理論提取值為35 mg/g。經(jīng)過遺傳算法優(yōu)化，實際值為34.52 mg/g，與理論值基本相符，從而證明此模型合理可靠。

本試驗所優(yōu)化的菊芋塊莖花青素提取工藝較為可靠，可為菊芋塊莖表皮花青素的提取提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。