• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    耐鹽生香酵母凍干菌劑的制備及其在芫根腌菜中的應(yīng)用研究

    2022-10-13 04:00:14董平易宇文唐紅梅程利思蒲慧吳華昌鄧靜
    中國調(diào)味品 2022年10期
    關(guān)鍵詞:生香腌菜保護(hù)劑

    董平,易宇文,唐紅梅,程利思,蒲慧,吳華昌,鄧靜*

    (1.四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院,成都 610100;2.四川省雅士科技有限公司,成都 610042)

    生香酵母是一類能夠合成令人愉悅的香氣成分的酵母,在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生酯、醇、醛、酚、酮、有機(jī)酸以及芳香烴類等香味物質(zhì),對發(fā)酵食品特殊風(fēng)味與質(zhì)地的形成具有重要作用。研究表明,在各類酒、調(diào)味品、發(fā)酵蔬菜、功能飲料等食品發(fā)酵過程中加入生香酵母能夠顯著提升發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味[1-3]。然而生香酵母在長期培養(yǎng)過程中往往會因分裂次數(shù)過多而退化,并增加污染的概率[4]。因此,將具有優(yōu)良性狀的生香酵母制備成活性酵母凍干菌劑可以有效避免上述問題。同時(shí),酵母凍干菌劑還具有使用安全、穩(wěn)定性高、長期儲存不失活等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。

    真空冷凍干燥技術(shù)是制備微生物活性菌劑最常用的方法,通過將菌懸液預(yù)冷凍、升華干燥、解吸干燥幾個(gè)步驟去除水分,達(dá)到干燥的目的[7],目前在酵母[8-9]、乳酸菌[10-11]以及復(fù)合菌種[12-13]凍干菌劑的制備過程中普遍使用真空冷凍干燥技術(shù)。然而冷凍干燥過程往往會引起細(xì)胞膜通透性改變、蛋白質(zhì)變性失活以及DNA損傷,從而對微生物有一定的傷害甚至導(dǎo)致其死亡,影響細(xì)胞存活率[14]。為了減少冷凍干燥對微生物的不良影響,通常會在菌劑制備過程中添加冷凍保護(hù)劑,如王憲斌等[15]在酵母凍干菌劑制備過程中以葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、脫脂奶粉以及谷氨酸鈉作為保護(hù)劑,發(fā)現(xiàn)每種保護(hù)劑都能不同程度地增加酵母的凍干存活率,并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化明確了使用5%海藻糖∶9%乳糖∶9%蔗糖為3∶5∶4的復(fù)配保護(hù)劑,酵母的存活率最高,為85.17%,說明這些保護(hù)劑對冷凍干燥過程中的酵母具有一定的保護(hù)作用,且復(fù)配保護(hù)劑的保護(hù)效果優(yōu)于單一保護(hù)劑。此外,甘油、葡聚糖、吐溫80、可溶性淀粉等也能夠顯著提高微生物的冷凍存活率[16]。然而冷凍保護(hù)劑種類繁多,不同保護(hù)劑針對不同微生物的保護(hù)效果也有差異,且往往要考慮保護(hù)劑的價(jià)格。綜合多種因素,選擇合適的保護(hù)劑才能盡可能提高微生物的冷凍存活率[17]。

    芫根(BrassicarapaL.)在高海拔地區(qū)廣泛種植,是藏民最主要的蔬菜來源。芫根不僅營養(yǎng)豐富,還具有多種保健功效[18]。近年來,有研究者將芫根經(jīng)鹽腌、自然發(fā)酵后制成腌菜[19],風(fēng)味獨(dú)特,口感爽脆,不僅延長了芫根的儲藏期,而且豐富了芫根相關(guān)產(chǎn)品。然而自然發(fā)酵的蔬菜往往產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[20],且風(fēng)味也需要進(jìn)一步提升。因此,進(jìn)一步增加芫根腌菜的產(chǎn)品穩(wěn)定性,提高產(chǎn)品風(fēng)味是目前亟需解決的問題。

    本實(shí)驗(yàn)將前期從川南腌菜中分離得到的耐鹽生香酵母YC14經(jīng)過增殖培養(yǎng),從離心條件、保護(hù)劑兩個(gè)方面入手,以酵母存活率為指標(biāo),確定活性酵母凍干菌劑最優(yōu)離心條件及最佳保護(hù)劑配方,明確真空冷凍干燥對YC14產(chǎn)酯能力的影響。同時(shí)將自制YC14凍干菌劑應(yīng)用于芫根的發(fā)酵,探究耐鹽生香酵母在腌菜發(fā)酵中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    自篩耐鹽生香酵母菌株YC14 (Candidaparapsilosis):由實(shí)驗(yàn)室前期分離并保存;新鮮芫根:購自四川白玉縣;葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、吐溫80、蛋白胨、Vc、酵母膏、PDA培養(yǎng)基:購自成都金山化學(xué)試劑有限公司;海藻糖:購自上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司;谷氨酸鈉:購自上海源葉生物科技有限公司。

    產(chǎn)酯培養(yǎng)基:葡萄糖8 g,酵母膏1 g,蛋白胨2 g,蒸餾水100 mL。

    FD-1-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Universal 320冷凍離心機(jī) 德國Hettich公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 菌種活化與酵母培養(yǎng)液的制備

    挑取酵母培養(yǎng)物置于YPD培養(yǎng)基中活化,活化后的菌株接種至PDA培養(yǎng)基中,于28 ℃培養(yǎng)20 h制得酵母培養(yǎng)液。

    1.2.2 菌體離心分離條件研究

    根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[21],取10 mL酵母培養(yǎng)液裝入已滅菌的離心管中,在4 ℃下分別以轉(zhuǎn)速1500,3000,4500,6000 r/min,離心時(shí)間3,5,10,15 min的條件進(jìn)行離心,收集離心后的菌體,以離心存活率為指標(biāo),探究離心條件對菌株YC14的影響,以期選擇合適的離心條件。

    離心活菌率的計(jì)算方式參照文獻(xiàn)[15]。

    1.2.3 真空冷凍干燥菌劑的制備流程

    菌種增殖培養(yǎng)→離心分離→菌體洗滌→添加保護(hù)劑→分裝至培養(yǎng)皿→預(yù)凍→真空冷凍干燥→成品低溫密封保存[22]。

    1.2.4 保護(hù)劑的選擇

    1.2.4.1 凍干菌劑的制備

    選擇蔗糖、海藻糖、乳糖、脫脂乳粉、甘油、吐溫80、谷氨酸鈉、Vc 8種凍干保護(hù)劑。試驗(yàn)前各保護(hù)劑按質(zhì)量濃度配制成相應(yīng)濃度的水溶液,用0.22 μm的微孔濾膜對各保護(hù)劑過濾備用。將酵母離心后得到的菌泥與保護(hù)劑按1∶2的比例混勻制成菌懸液。取2 mL菌懸液分別裝入無菌帶塞的凍干瓶中。將上述保護(hù)劑與菌體混合物平衡30 min,于-30 ℃預(yù)凍12 h。預(yù)凍完成后,轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)中凍干,條件為:-37 ℃,真空度18 Pa,時(shí)間12 h。凍干樣品置于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。對照樣添加同等體積無菌水。以凍干存活率為檢測指標(biāo),確定最佳凍干保護(hù)劑。

    凍干活菌率的計(jì)算方式參照文獻(xiàn)[15]。

    1.2.4.2 保護(hù)劑的單因素試驗(yàn)

    8種冷凍保護(hù)劑在單因素試驗(yàn)中所采用的濃度梯度見表1。

    1.2.4.3 復(fù)配保護(hù)劑響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

    綜合考慮單因素方差分析結(jié)果、凍干保護(hù)劑協(xié)同增效途徑及各保護(hù)劑成本等方面因素,選取乳糖、脫脂乳粉、吐溫80 3種保護(hù)劑,利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行復(fù)配保護(hù)劑配方探究,見表2。

    表2 Box-Behnken Design試驗(yàn)因素與水平表

    1.2.5 總酯的測定

    取0.1 g凍干菌劑溶于100 mL無菌水,取1 mL加入50 mL產(chǎn)酯培養(yǎng)基,28 ℃、150 r/min培養(yǎng);取2.2 mL酵母培養(yǎng)液,加入50 mL產(chǎn)酯培養(yǎng)基,在同樣的條件進(jìn)行培養(yǎng)。收集2~7 d的產(chǎn)酯培養(yǎng)基,采用皂化回流法檢測總酯含量[23]。

    1.2.6 酵母凍干菌劑應(yīng)用于腌菜發(fā)酵的研究

    1.2.6.1 芫根腌菜的制作

    預(yù)處理:將新鮮芫根洗凈并去除頭尾,切成后0.5 cm3的芫根丁,晾曬2 d。

    腌漬:在晾曬后的芫根丁中按比例添加9%的食鹽,拌勻裝壇,腌漬7 d。

    發(fā)酵:將腌漬后的芫根丁脫水,按0.05%的比例接種酵母凍干菌劑,或接入相同數(shù)量的YC14活酵母,空白組不接種。將接種拌料后的芫根丁裝入消毒后的發(fā)酵罐中,置于自然環(huán)境(冬日,平均溫度14 ℃左右)與28 ℃的恒溫環(huán)境中發(fā)酵30 d,發(fā)酵過程中定期搖晃罐體放氣。

    1.2.6.2 指標(biāo)的測定

    總酯的測定:參考國標(biāo)GB/T 10345—2007,采用指示劑法進(jìn)行總酯測定,每個(gè)樣品做3組平行。

    總酸的測定:參考國標(biāo)GB/T 12456—2008,采用酸堿滴定法進(jìn)行總酸測定,每個(gè)樣品做3組平行。

    感官評價(jià):本試驗(yàn)初步探究酵母凍干菌劑對芫根發(fā)酵的影響,因此感官主要考察香氣指標(biāo),感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

    表3 芫根感官評價(jià)指標(biāo)

    1.2.7 數(shù)據(jù)處理

    采用Design Expert軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

    2 結(jié)果與分析討論

    2.1 離心條件選擇

    由圖1可知,隨著離心時(shí)間的延長,YC14存活率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,其中3000 r/min及以上的轉(zhuǎn)速條件下,離心時(shí)間為5 min時(shí),YC14存活率最高,而1500 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心10 min達(dá)到最高存活率,可見離心條件對YC14存活率有明顯影響。在幾種不同的離心條件下,3000 r/min離心5 min時(shí)YC14存活率最高,為93.46%。

    圖1 離心條件對酵母存活率的影響

    2.2 保護(hù)劑單因素試驗(yàn)

    結(jié)合表1和表4可知,8種保護(hù)劑對YC14的冷凍干燥都有保護(hù)作用,但保護(hù)效果不同,其中,蔗糖添加量為13%時(shí),凍干存活率最高,為46.93%;海藻糖添加量為11%時(shí),凍干存活率最高,為71.04%;乳糖添加量為3%時(shí),凍干存活率最高,為61.15%;脫脂乳粉添加量為6%時(shí),凍干存活率最高,為85.74%;甘油添加量為5%時(shí),凍干存活率最高,為55.92%;吐溫80添加量為5%時(shí),凍干存活率最高,為86.47%;谷氨酸鈉添加量為4%時(shí),凍干存活率最高,為78.59%;Vc添加量為1.2%時(shí),凍干存活率最高,為46.32%。不論哪種保護(hù)劑,濃度過高或過低都會影響其保護(hù)效果。

    表4 耐鹽生香酵母冷凍保護(hù)劑單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.3 單一保護(hù)劑選擇

    利用SPSS軟件進(jìn)一步對單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,判斷各保護(hù)劑對YC14凍干存活率的影響情況,以期選擇合適的保護(hù)劑,為后期保護(hù)劑復(fù)配試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

    由表5可知,幾種保護(hù)劑對YC14凍干存活率的影響均具有顯著性,影響作用由大到小為乳糖>海藻糖>谷氨酸鈉>吐溫80>甘油、脫脂乳粉>Vc>蔗糖。從凍干存活率的角度分析,幾種保護(hù)劑對YC14凍干的保護(hù)效果由強(qiáng)至弱為吐溫80>脫脂乳粉>谷氨酸鈉>海藻糖>乳糖>甘油>蔗糖>Vc。單一保護(hù)劑不足以達(dá)到理想的效果,一般采用大分子保護(hù)劑與小分子保護(hù)劑結(jié)合、滲透性保護(hù)劑與非滲透性保護(hù)劑結(jié)合、糖類保護(hù)劑與蛋白質(zhì)類保護(hù)劑結(jié)合的模式復(fù)配形成復(fù)合保護(hù)劑,以達(dá)到協(xié)同、增效的作用[24]。綜合考慮保護(hù)劑對YC14凍干存活率影響的顯著性、保護(hù)效果、成本、復(fù)配模式等方面因素,選擇乳糖、脫脂乳粉、吐溫80進(jìn)行下階段復(fù)配試驗(yàn)。

    表5 各保護(hù)劑保護(hù)效果及顯著性分析

    2.4 BBD響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    利用Design Expert 8.0.6.1 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),試驗(yàn)結(jié)果見表6。以乳糖(A)、脫脂乳粉(B)、吐溫80(C)為自變量,凍干存活率為響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合,得到回歸方程為:凍干存活率=-202.16725+92.25350A+12.41675B+42.49625C+1.95000AB+0.085000AC+1.92417BC-16.79475A2-2.09803B2-5.54725C2。

    表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    續(xù) 表 %

    由表7可知,整體模型達(dá)極顯著水平(P<0.0001),表明該二次模型高度顯著,模型的失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),說明該方程對試驗(yàn)擬合較好,能真實(shí)解釋實(shí)際響應(yīng)結(jié)果。模型C.V.為1.48%,遠(yuǎn)小于10%,說明模型的穩(wěn)定性良好。決定系數(shù)R2為0.9981,說明該方程能較好地反應(yīng)各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。信噪比為57.184>4,說明該模型有足夠的分辨能力,能反映試驗(yàn)結(jié)果。

    表7 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程方差分析

    由方差分析結(jié)果可知,A、B、AB、BC、A2、B2、C2對凍干保護(hù)效果的影響極顯著(P<0.0001),C對凍干保護(hù)效果的影響顯著(P<0.05),AC的交互作用影響不顯著(P>0.05),各因素對凍干保護(hù)效果的響應(yīng)面圖見圖2,與方差分析結(jié)果一致。由各因素對試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度F值可知,各因素對凍干保護(hù)效果的影響程度為B>A>C,即脫脂乳粉>乳糖>吐溫80,該結(jié)論與單一保護(hù)劑選擇的結(jié)論“幾種保護(hù)劑對YC14凍干存活率均具有顯著性,影響作用大小為乳糖>海藻糖>谷氨酸鈉>吐溫80>甘油>脫脂乳粉>Vc>蔗糖”不同,可能是因?yàn)閱我槐Wo(hù)劑復(fù)配成混合體系后對菌株凍干存活率的顯著性影響會發(fā)生改變。

    圖2 保護(hù)劑優(yōu)化響應(yīng)面圖

    由圖2響應(yīng)面試驗(yàn)分析可知,當(dāng)乳糖、脫脂乳粉、吐溫80的添加量分別為3.15%、6.72%、5.02%時(shí),酵母菌株凍干存活率為91.55%。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證,實(shí)際凍干存活率為90.82%,見表8。相對誤差在1%以內(nèi),說明該模型可較準(zhǔn)確地對凍干保護(hù)劑最優(yōu)配方進(jìn)行預(yù)測。

    表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

    2.5 真空冷凍干燥對耐鹽生香酵母產(chǎn)酯能力的影響

    為了研究真空冷凍干燥是否影響耐鹽生香酵母的產(chǎn)酯能力,分別取新鮮酵母菌液和現(xiàn)制的酵母凍干菌劑(活酵母數(shù)量約為2.6×108個(gè))接種至50 mL產(chǎn)酯培養(yǎng)基,于28 ℃、150 r/min進(jìn)行培養(yǎng),并對其產(chǎn)酯能力進(jìn)行檢測。由圖3可知,隨著時(shí)間的延長,新鮮菌液和凍干菌劑的產(chǎn)酯培養(yǎng)基中總酯含量逐漸增加,之后趨于穩(wěn)定,說明此時(shí)酯類物質(zhì)的生成與揮發(fā)(可能還有酯酶的水解作用[25])進(jìn)入平衡階段。在2~4 d的時(shí)間內(nèi),新鮮酵母產(chǎn)酯量高于凍干菌劑,主要原因可能是凍干菌劑在增殖前有一個(gè)活化的過程,增殖緩慢,酵母細(xì)胞數(shù)量較新鮮酵母培養(yǎng)液少,影響酯類物質(zhì)的生成。第5天開始新鮮酵母菌液和凍干菌劑之間的產(chǎn)酯量差別不大,說明真空冷凍干燥并不影響生香酵母酯類物質(zhì)的合成。

    圖3 真空冷凍干燥對耐鹽生香酵母YC14產(chǎn)酯能力的影響

    2.6 酵母凍干菌劑在芫根腌菜發(fā)酵中的應(yīng)用

    為評價(jià)凍干菌劑在芫根腌菜發(fā)酵過程中的效果,選擇室溫和28 ℃恒溫發(fā)酵30 d的芫根腌菜進(jìn)行理化測定及感官評分,見表9。在不同溫度發(fā)酵條件下,接種活菌與凍干菌劑發(fā)酵后腌菜總酯、總酸含量以及感官評分均比未接種發(fā)酵顯著提高,說明產(chǎn)酯酵母YC14能夠顯著改善腌菜的品質(zhì);而接種活菌與凍干菌劑的腌菜在總酯、感官評分以及室溫發(fā)酵條件下總酸的差異并不明顯,進(jìn)一步說明冷凍干燥對YC14菌株的影響較小。另外,較高的恒溫發(fā)酵條件更有利于酸與酯的形成,增加腌菜的感官評分,說明芫根腌菜的制備應(yīng)選擇較高的發(fā)酵溫度,但更精確的芫根腌菜發(fā)酵適宜溫度有待進(jìn)一步深入研究。

    表9 不同發(fā)酵條件下芫根腌菜理化及感官分析結(jié)果

    3 結(jié)論

    試驗(yàn)表明,在離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min、離心時(shí)間為5 min時(shí)耐鹽生香酵母YC14離心存活率可達(dá)93.46%;以凍干存活率為指標(biāo),結(jié)合單因素及響應(yīng)面試驗(yàn),當(dāng)乳糖、脫脂乳粉、吐溫80的添加量分別為3.15%、6.72%、5.02%時(shí),YC14預(yù)測凍干存活率最大,為91.55%,經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證,實(shí)際存活率為90.82%,誤差較小,為0.73%,說明該模型能夠較準(zhǔn)確預(yù)測凍干保護(hù)劑的最優(yōu)配方,具有實(shí)際應(yīng)用意義。冷凍干燥過程對YC14酯類物質(zhì)的合成并沒有顯著的影響。將自制YC14凍干菌劑接種于芫根腌菜進(jìn)行發(fā)酵,對發(fā)酵30 d的腌菜進(jìn)行指標(biāo)測定,接種YC14的芫根腌菜總酸、總酯以及感官品質(zhì)都有一定程度的提高,在28 ℃的發(fā)酵環(huán)境下更利于芫根腌菜香氣的形成。

    猜你喜歡
    生香腌菜保護(hù)劑
    凍干益生菌微膠囊保護(hù)劑及抗性研究
    中國飼料(2021年17期)2021-11-02 08:15:14
    略述《歲月生香》的壺中內(nèi)涵
    劉延蘋:氤氳自然 伊墨生香
    收藏界(2019年2期)2019-10-12 08:26:18
    最想吃媽媽的爛腌菜
    微流控法低溫保護(hù)劑添加及去除線型優(yōu)化研究
    枝頭玉蘭舞霓裳 風(fēng)華初露已生香——淺述紫砂壺“玉蘭生香”的藝術(shù)風(fēng)格
    腌菜健康食用指南
    飲食保健(2019年8期)2019-04-23 03:57:44
    白酒巧去腌菜膜
    保健與生活(2016年5期)2016-04-11 19:49:03
    日子如蝶,裙角生香
    家鄉(xiāng)的味道
    亚洲精品国产av成人精品| 18在线观看网站| 亚洲国产精品999| 热99国产精品久久久久久7| 最黄视频免费看| 尾随美女入室| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲,一卡二卡三卡| 日本wwww免费看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品酒店卫生间| 晚上一个人看的免费电影| 夫妻午夜视频| 电影成人av| 亚洲第一青青草原| 熟妇人妻不卡中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美日韩成人在线一区二区| 深夜精品福利| 亚洲美女搞黄在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 精品少妇黑人巨大在线播放| 超碰97精品在线观看| 午夜福利视频精品| 一级毛片电影观看| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 在线观看人妻少妇| 我要看黄色一级片免费的| 国产亚洲最大av| 一区在线观看完整版| 亚洲七黄色美女视频| 国产在线免费精品| 1024香蕉在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 一本久久精品| 免费av中文字幕在线| 日本午夜av视频| 成人毛片60女人毛片免费| 精品免费久久久久久久清纯 | 操美女的视频在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 色94色欧美一区二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 成年av动漫网址| 国产精品99久久99久久久不卡 | 男人添女人高潮全过程视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 日韩大片免费观看网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 嫩草影院入口| 久久热在线av| 99热网站在线观看| 亚洲人成电影观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 日韩电影二区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜91福利影院| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲国产欧美在线一区| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲男人天堂网一区| 国产爽快片一区二区三区| 超碰成人久久| 色视频在线一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 久久99精品国语久久久| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲欧美清纯卡通| 最近手机中文字幕大全| 国产精品成人在线| 伦理电影大哥的女人| 亚洲成人国产一区在线观看 | 老司机影院成人| 国精品久久久久久国模美| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 免费不卡黄色视频| 黑人猛操日本美女一级片| 波野结衣二区三区在线| 日韩精品免费视频一区二区三区| 婷婷色av中文字幕| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久久久久久久免费视频了| 国产男人的电影天堂91| 国产精品一国产av| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久久欧美国产精品| 嫩草影视91久久| 日韩一区二区三区影片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 我的亚洲天堂| 一边亲一边摸免费视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一级片免费观看大全| 国产又色又爽无遮挡免| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美日韩亚洲高清精品| 女性被躁到高潮视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产熟女午夜一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 1024香蕉在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 丝瓜视频免费看黄片| 午夜影院在线不卡| 国产在线免费精品| 美女大奶头黄色视频| 精品久久久久久电影网| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产1区2区3区精品| 亚洲国产精品一区三区| 人人澡人人妻人| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲成国产人片在线观看| 观看av在线不卡| 婷婷色麻豆天堂久久| 精品福利永久在线观看| 国产av精品麻豆| 看免费成人av毛片| 久久久欧美国产精品| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美精品亚洲一区二区| 我要看黄色一级片免费的| 嫩草影视91久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成年av动漫网址| 男人舔女人的私密视频| 亚洲精品一区蜜桃| 午夜福利视频在线观看免费| 一个人免费看片子| 国产日韩欧美在线精品| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 丝袜喷水一区| 丝瓜视频免费看黄片| 91成人精品电影| 国产淫语在线视频| 日韩电影二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 午夜福利,免费看| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲欧洲国产日韩| 国产一区二区在线观看av| 操美女的视频在线观看| 在线观看三级黄色| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久久久久久久免费视频了| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久97久久精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 国产亚洲av高清不卡| 另类精品久久| 久久久久久久国产电影| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美av亚洲av综合av国产av | 女人精品久久久久毛片| 国产精品人妻久久久影院| 天堂8中文在线网| 午夜激情av网站| 狂野欧美激情性bbbbbb| 蜜桃国产av成人99| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲国产精品国产精品| 欧美精品高潮呻吟av久久| 午夜福利一区二区在线看| 热99久久久久精品小说推荐| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲成人av在线免费| 国产成人精品久久久久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 日本wwww免费看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 韩国av在线不卡| 中文字幕亚洲精品专区| tube8黄色片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲精品美女久久av网站| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲国产精品一区三区| 国精品久久久久久国模美| 一本大道久久a久久精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产免费又黄又爽又色| 男女床上黄色一级片免费看| 伦理电影大哥的女人| 高清黄色对白视频在线免费看| 超色免费av| 十分钟在线观看高清视频www| 男女高潮啪啪啪动态图| 毛片一级片免费看久久久久| a级毛片黄视频| 妹子高潮喷水视频| 99久久人妻综合| 日韩欧美一区视频在线观看| 免费看不卡的av| av有码第一页| 日韩一本色道免费dvd| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲欧美一区二区三区久久| 在现免费观看毛片| 国产精品国产三级国产专区5o| 97在线人人人人妻| 另类亚洲欧美激情| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美最新免费一区二区三区| 成人毛片60女人毛片免费| 观看av在线不卡| 亚洲国产欧美在线一区| 看免费av毛片| 五月天丁香电影| 久久人人97超碰香蕉20202| h视频一区二区三区| 国产在线视频一区二区| 久久99一区二区三区| 国产 一区精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久久久久人妻| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 午夜福利在线免费观看网站| 天天操日日干夜夜撸| 欧美精品一区二区免费开放| 狂野欧美激情性xxxx| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 18禁动态无遮挡网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一级,二级,三级黄色视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 一区二区三区精品91| 午夜老司机福利片| av一本久久久久| 亚洲国产欧美网| 午夜激情av网站| 丁香六月天网| 欧美日本中文国产一区发布| 一级,二级,三级黄色视频| 女人精品久久久久毛片| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲国产成人一精品久久久| 1024香蕉在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美日韩视频精品一区| 久久久国产一区二区| av国产久精品久网站免费入址| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美精品一区二区大全| 日日撸夜夜添| 亚洲 欧美一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 精品一区二区三卡| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美精品一区二区大全| 亚洲伊人久久精品综合| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品嫩草影院av在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲国产看品久久| 午夜福利免费观看在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品一区二区三区av网在线观看 | 电影成人av| 桃花免费在线播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 曰老女人黄片| 波多野结衣av一区二区av| 久久精品人人爽人人爽视色| 成人手机av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 咕卡用的链子| www.自偷自拍.com| 亚洲精品美女久久av网站| 中文欧美无线码| 欧美中文综合在线视频| 老司机亚洲免费影院| 亚洲成人免费av在线播放| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产亚洲最大av| 97人妻天天添夜夜摸| 日本欧美视频一区| 人体艺术视频欧美日本| 国产熟女午夜一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 少妇精品久久久久久久| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费日韩欧美在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产亚洲一区二区精品| 青青草视频在线视频观看| 十八禁人妻一区二区| av在线老鸭窝| 一区二区三区激情视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产一区二区激情短视频 | 韩国av在线不卡| 另类亚洲欧美激情| 久久99一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 欧美精品亚洲一区二区| 久久婷婷青草| 永久免费av网站大全| 国产亚洲欧美精品永久| 一本大道久久a久久精品| 日日啪夜夜爽| 欧美最新免费一区二区三区| 少妇人妻 视频| 日日爽夜夜爽网站| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美久久黑人一区二区| 国产乱来视频区| 尾随美女入室| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美 日韩 精品 国产| 在线天堂中文资源库| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品少妇久久久久久888优播| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲久久久国产精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲精品国产区一区二| videosex国产| 性少妇av在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 青春草视频在线免费观看| 电影成人av| 久久影院123| 免费黄色在线免费观看| 欧美黑人精品巨大| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久热在线av| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品成人在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 女人久久www免费人成看片| 免费人妻精品一区二区三区视频| 天美传媒精品一区二区| 悠悠久久av| 久久久国产精品麻豆| 一区二区av电影网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 黑人欧美特级aaaaaa片| av在线老鸭窝| 国产 一区精品| 日日摸夜夜添夜夜爱| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产免费现黄频在线看| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 一本一本久久a久久精品综合妖精| 日韩大码丰满熟妇| 最近中文字幕高清免费大全6| 18禁观看日本| 夫妻性生交免费视频一级片| 狂野欧美激情性xxxx| 水蜜桃什么品种好| 久久av网站| 国产国语露脸激情在线看| 久久精品国产综合久久久| 国产又爽黄色视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 99九九在线精品视频| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 观看美女的网站| 嫩草影视91久久| 国产成人精品久久二区二区91 | 日韩免费高清中文字幕av| 欧美97在线视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 毛片一级片免费看久久久久| 国产又爽黄色视频| 超色免费av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 美女午夜性视频免费| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲国产欧美在线一区| 欧美日韩精品网址| 亚洲,欧美,日韩| 桃花免费在线播放| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美人与善性xxx| 久久这里只有精品19| 99久国产av精品国产电影| 久久毛片免费看一区二区三区| 69精品国产乱码久久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 18在线观看网站| av卡一久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| 99热国产这里只有精品6| 欧美国产精品va在线观看不卡| 热99久久久久精品小说推荐| av福利片在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 午夜福利乱码中文字幕| 久久久久精品久久久久真实原创| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | a 毛片基地| 91精品三级在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 激情视频va一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 大码成人一级视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美在线一区亚洲| 一二三四中文在线观看免费高清| 美女中出高潮动态图| 欧美日韩福利视频一区二区| 在现免费观看毛片| 亚洲国产日韩一区二区| 久久久国产一区二区| 久久人人97超碰香蕉20202| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产一区二区 视频在线| 欧美av亚洲av综合av国产av | 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品国产露脸久久av麻豆| 天堂8中文在线网| 日韩视频在线欧美| 中文字幕人妻熟女乱码| a级毛片黄视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲精品,欧美精品| 美国免费a级毛片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 各种免费的搞黄视频| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲精品自拍成人| 超碰成人久久| 成人免费观看视频高清| 亚洲精品国产一区二区精华液| 免费黄网站久久成人精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 免费在线观看完整版高清| 国产男人的电影天堂91| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品成人在线| 午夜激情av网站| 男女之事视频高清在线观看 | 亚洲天堂av无毛| 在线免费观看不下载黄p国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 午夜日本视频在线| www日本在线高清视频| 国产男女超爽视频在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 男人添女人高潮全过程视频| 国产97色在线日韩免费| 欧美日韩亚洲高清精品| 超色免费av| 九色亚洲精品在线播放| 成年美女黄网站色视频大全免费| 日本av手机在线免费观看| 热99久久久久精品小说推荐| 狂野欧美激情性xxxx| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人91sexporn| 丝瓜视频免费看黄片| 日本色播在线视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久韩国三级中文字幕| 不卡视频在线观看欧美| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 两个人免费观看高清视频| 久久久久视频综合| 乱人伦中国视频| 日本午夜av视频| 久久久精品区二区三区| 午夜日本视频在线| a 毛片基地| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲综合精品二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久99热这里只频精品6学生| a级片在线免费高清观看视频| 免费av中文字幕在线| 日本欧美视频一区| av片东京热男人的天堂| 国产爽快片一区二区三区| 观看av在线不卡| 老汉色∧v一级毛片| 又大又爽又粗| 久久久久国产精品人妻一区二区| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲综合精品二区| 国产免费福利视频在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 性色av一级| 免费在线观看黄色视频的| 欧美日韩亚洲高清精品| 免费人妻精品一区二区三区视频| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品aⅴ在线观看| 老司机亚洲免费影院| 国产精品av久久久久免费| 在线观看免费高清a一片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 青春草亚洲视频在线观看| 免费看不卡的av| 伦理电影免费视频| 成年动漫av网址| 久久久精品94久久精品| 欧美黑人精品巨大| 成人三级做爰电影| 国产成人系列免费观看| 免费不卡黄色视频| 97在线人人人人妻| 日本一区二区免费在线视频| 悠悠久久av| 国产黄频视频在线观看| 久热爱精品视频在线9| 电影成人av| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 老司机亚洲免费影院| 满18在线观看网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| 男人爽女人下面视频在线观看| a级毛片在线看网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲国产成人一精品久久久| 日本色播在线视频| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 在线天堂中文资源库| 丁香六月欧美| 久久鲁丝午夜福利片| 毛片一级片免费看久久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 99久久综合免费| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 香蕉丝袜av| 老司机亚洲免费影院| 母亲3免费完整高清在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 国产精品嫩草影院av在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲精品自拍成人| 韩国高清视频一区二区三区| 在线观看免费午夜福利视频| www.自偷自拍.com|