酪蛋白-葡萄糖美拉德反應產(chǎn)物抗氧化活性研究

黃建蓉，李秋萌，姚逸澄，宋豐林，徐金瑞，王志江，侯方麗

(廣東藥科大學 食品科學學院，廣東 中山 528453)

美拉德反應在食品加工中廣泛存在，除賦予產(chǎn)品獨特的色、香、味外，還能產(chǎn)生有益的生物活性物質，增強食品的抗氧化活性[1-3]。面包、蛋糕、餅干等焙烤食品在高溫烘焙階段發(fā)生美拉德反應，對于產(chǎn)品的色澤和風味發(fā)揮著重要作用，其反應產(chǎn)物的抗氧化活性值得關注。焙烤食品生產(chǎn)常用牛乳或乳粉、果葡糖漿等為原料，其中所含的酪蛋白與果糖或葡萄糖在高溫條件下即可以發(fā)生美拉德反應，本文研究了在常用的烘焙工藝條件下，酪蛋白-葡萄糖體系發(fā)生美拉德反應得到的產(chǎn)物的抗氧化活性，并與茶多酚和蘆丁的抗氧化活性進行比較，可為進一步探討焙烤食品的抗氧化活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

酪蛋白(分析純)：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖(分析純)：天津市永大化學試劑有限公司；茶多酚(純度≥98%)、蘆丁(純度≥95%)、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ，純度≥98.5%)：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：東京化成工業(yè)株式會社；三氯化鐵、硫酸亞鐵、無水乙酸鈉、無水乙醇(均為分析純)：天津市大茂化學試劑廠；冰醋酸(分析純)：天津市富宇精細化工有限公司；鹽酸(分析純)：廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

SC-80C全自動色差計 北京康光光學儀器有限公司；AE124C電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DGX-9053B-2干燥箱 上海福瑪實驗設備有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 上海亞榮生化儀器廠；SB-25-12DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計、RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白-葡萄糖美拉德反應提取物制備

按照3∶1的比例稱取酪蛋白和葡萄糖，并按二者總質量的15%加入蒸餾水混合均勻，以模擬真實焙烤食品體系烘烤前的配料組成狀態(tài)，置于蒸發(fā)皿中，在130 ℃烘烤30 min。反應結束后取出冷卻至室溫，用SC-80C色差計的反射樣品測定模式檢測反應前后體系的色差值L*、a*、b*，并根據(jù)下式計算總色差△E。

△E=(△L*2+△a*2+△b*2)1/2。

式中：L*表示亮度數(shù)值；a*表示紅色到綠色兩種原色之間的變化區(qū)域；b*表示黃色到藍色兩種原色之間的變化區(qū)域；△L*表示明度差異；△a*表示紅/綠差異；△b*表示黃/藍差異。

酪蛋白-葡萄糖反應混合物加入適量蒸餾水或60%乙醇超聲提取10 min，然后全部轉移至容量瓶中，按混合物質量∶定容體積為1∶10的比例用相應溶劑定容，經(jīng)過濾分別得到酪蛋白-葡萄糖美拉德反應產(chǎn)物(MRPs)水提物溶液和醇提物溶液。取一定量的提取物溶液真空冷凍干燥至恒重，稱量計算得到溶液質量濃度(mg/mL)。

1.3.2 紫外可見吸收光譜分析

紫外可見吸收光譜的測定參考文獻[4]的方法并略作調整。酪蛋白-葡萄糖MRPs水提物溶液稀釋5倍，醇提物溶液稀釋10倍，分別以蒸餾水和60%乙醇為基線，在250～500 nm范圍掃描溶液紫外可見吸收光譜，此為反應后光譜。以未經(jīng)烘烤的酪蛋白-葡萄糖體系為對照，按1.3.1中制備MRPs提取物溶液的方法制備對照液，同法掃描紫外可見吸收光譜，即為反應前光譜。

1.3.3 熒光光譜分析

熒光光譜的測定參考文獻[5]的方法并略作調整。設置熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，熒光激發(fā)波長345 nm，掃描360～560 nm發(fā)射光譜。按1.3.2項方法制備光譜掃描用樣液，分別得到反應前后MRPs水提取和醇提物熒光光譜圖。

1.3.4 總抗氧化能力測定——FRAP法

參考文獻[6]的方法并略作調整。將0.2 mol/L pH 3.6的醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1(體積比)混合，攪拌均勻得FRAP工作液。

FeSO4標準曲線的繪制：將1 mmol/L 的FeSO4溶液稀釋5倍，分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL于9支試管中，用蒸餾水補至2 mL；加入3 mL FRAP工作液，混勻；于37 ℃反應10 min，在593 nm 處測定吸光度。以FeSO4溶液濃度(mmol/L)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制FeSO4標準曲線。

MRPs水提物總抗氧化能力測定：將水提物原液分別稀釋10，20，30，50，100倍，分別取2 mL于5支試管中，各加入3 mL FRAP工作液，混勻；于37 ℃反應10 min，在593 nm 處測定吸光度。將吸光度代入FeSO4標準曲線計算得到FeSO4濃度(mmol/L)，以FeSO4濃度數(shù)值表示FRAP值。FRAP值越大，總抗氧化能力越強。

茶多酚總抗氧化能力測定：配制濃度為26.7 mg/mL的茶多酚水溶液，分別稀釋20，25，30，35，40，45，50倍，同法測定茶多酚FRAP值。

MRPs醇提物總抗氧化能力測定：將醇提物分別稀釋10，20，30，50，100倍，同法測定醇提物FRAP值。

蘆丁總抗氧化能力測定：用60%乙醇配制濃度為25 mg/mL的蘆丁溶液，分別稀釋2，2.5，3，3.5，4，4.5，5倍，同法測定蘆丁FRAP值。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測定

參考文獻[7-8]的方法并略作調整。將MRPs水提物分別稀釋2.5，5，8，10，15，20倍，加上原液一共7個濃度梯度。各取1 mL至7支具塞試管中，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液，搖勻，避光反應30 min，于517 nm波長處測吸光度，記為Ai。另取7支試管，分別加入1 mL 7個濃度梯度的樣液和2 mL無水乙醇，搖勻，于517 nm波長處測吸光度，記為Aj。另取1支試管，加入1 mL蒸餾水和2 mL 0.1 mmol/L的DPPH·乙醇溶液，搖勻，于517 nm波長處測吸光度，記為A0。用下式計算DPPH·清除率。

清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100。

茶多酚DPPH·清除率的測定：將26.7 mg/mL茶多酚分別稀釋5，8，10，20，25，30，40，50，100倍，加上原液一共10個濃度梯度。同法測定和計算茶多酚對DPPH·的清除率。

MRPs醇提物DPPH·清除率的測定：將MRPs醇提物分別稀釋2.5，5，8，10，15，20倍，加上原液一共7個濃度梯度。同法測定和計算MRPs醇提物對DPPH·的清除率。

蘆丁DPPH·清除率的測定：將25 mg/mL的蘆丁60%乙醇溶液，分別稀釋1.67，2.5，5，25，50，250，500倍，加上原液一共8個濃度梯度。同法測定和計算蘆丁對DPPH·的清除率。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白-葡萄糖美拉德反應體系建立

2.1.1 酪蛋白-葡萄糖體系反應前后色澤變化

酪蛋白-葡萄糖(3∶1)反應前色差參數(shù)L*=86.15、a*=-0.83、b*=10.33，經(jīng)過130 ℃烘烤30 min后，色差參數(shù)L*=60.02、a*=14.99、b*=33.31，反應后明度值L*明顯減小，紅綠值a*、黃藍值b*明顯增大，反應后與反應前色差△E=31.34。烘烤對美拉德反應的發(fā)生有重要作用，食品色澤的改變是美拉德反應產(chǎn)物生成的宏觀體現(xiàn)，色差參數(shù)值的變化可以作為判斷美拉德反應進程的依據(jù)之一。在該焙烤條件下，酪蛋白與葡萄糖發(fā)生了明顯的美拉德反應，使得體系褐變，顏色發(fā)生了明顯變化。

2.1.2 美拉德反應產(chǎn)物提取液制備

按照1.3.1項方法，得到MRPs水提液濃度為25.55 mg/mL，MRPs醇提液濃度為25.90 mg/mL。

2.2 酪蛋白-葡萄糖美拉德反應產(chǎn)物光譜分析

2.2.1 紫外可見吸收光譜

研究表明[9-11]，大多數(shù)美拉德反應在紫外區(qū)294 nm附近都有特征光吸收，而且294 nm光吸收在顏色形成前出現(xiàn)，此處的吸收是美拉德反應中間階段通過 Strecker裂解產(chǎn)生的酮類、醛類等無色小分子中間物，這些物質作為美拉德反應的中間產(chǎn)物與熒光化合物相比穩(wěn)定很多，是褐色素形成的前體，其主要為吡喃、呋喃、吡啶、糠醛等及其衍生物，此處的吸光強度可間接反映無色小分子物質的產(chǎn)生情況，吸光度值越大，中間產(chǎn)物越多。由圖1可知，MRPs水提物和醇提物均在289 nm處出現(xiàn)吸收峰，在此波段下出現(xiàn)強吸收，說明該體系發(fā)生了糖類脫水分解并且發(fā)生裂解而產(chǎn)生一些酮類及醛類無色小分子。在360～490 nm區(qū)間的光吸收主要是由美拉德反應高級階段產(chǎn)生的類黑素引起，在420 nm處吸光度值的變化可用來表征類黑素生成程度。反應后體系在420 nm處吸光度增加，說明美拉德反應高級階段產(chǎn)物的生成，吸光度的變化體現(xiàn)出反應的褐變程度。

圖1 酪蛋白-葡萄糖美拉德反應前后紫外可見吸收光譜

2.2.2 熒光光譜

一些在美拉德反應過程中產(chǎn)生的小分子熒光物質，其典型光譜特征為激發(fā)波長340～370 nm，發(fā)射波長420～440 nm[12]。美拉德反應體系中熒光強度與紫外光吸收強度的發(fā)展表現(xiàn)為不同的動力學行為，所以熒光小分子物質被認為是不同于具有紫外光吸收物質的小分子產(chǎn)物，熒光中間小分子體比無色中間體反應活性更高，更易參與高級階段合成類黑素等物質。由圖2可知，在激發(fā)波長為345 nm時，MRPs水提物和醇提物最強熒光發(fā)射波長在426 nm處，符合美拉德反應生成熒光物質的特征。

圖2 酪蛋白-葡萄糖美拉德反應前后熒光光譜

與反應前的水提物相比，反應前醇提物出現(xiàn)了較強熒光，原因在于乙醇和水作為常用的有機溶劑，本身都不具有熒光特性，但當乙醇分子與水分子結合后會通過氫鍵形成閉合或者不閉合的鏈式結構，從而具有了熒光特性[13-14]，因此在413 nm處出現(xiàn)了60%乙醇水溶液的熒光峰。由于美拉德反應產(chǎn)物具有熒光特性，反應后提取物熒光強度明顯增大，反應后醇提物在413 nm處的熒光峰消失，熒光峰出現(xiàn)在美拉德產(chǎn)物特征峰426 nm的位置。

2.3 美拉德反應產(chǎn)物抗氧化活性

2.3.1 美拉德反應產(chǎn)物總抗氧化能力

總抗氧化能力測定FeSO4標準曲線見圖3。以y表示593 nm處的吸光度，x表示FeSO4濃度(mmol/L)，得到線性回歸方程y=6.415x+0.1249(R2=0.9952)，在0.02～0.18 mmol/L范圍內吸光度與FeSO4濃度呈良好的線性關系。

圖3 FeSO4標準曲線

由圖4可知，MRPs水提物、茶多酚、MRPs醇提物和蘆丁的FRAP值均隨著各自濃度的增加而增大，并呈良好的線性關系，以y表示FRAP值，x表示樣液濃度(mg/mL)，回歸方程分別為y=0.0506x+0.0116(R2=0.9969)，y=1.1305x+0.044(R2=0.9949)，y=0.0627x+0.015(R2=0.9958)，y=0.0862x+0.0089(R2=0.9668)。要達到FRAP值為0.11，MRPs水提物、茶多酚、MRPs醇提物和蘆丁所需濃度分別為1.945，0.0584，1.515，1.173 mg/mL。在1 mg/mL濃度下，MRPs水提物和MRPs醇提物的FRAP值分別為0.062和0.078。MRPs總抗氧化能力與茶多酚差距較大，與蘆丁較為接近，醇提物的總抗氧化能力略強于水提物。

圖4 美拉德反應產(chǎn)物總抗氧化能力

2.3.2 美拉德反應產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力

由圖5可知，MRPs水提物、MRPs醇提物和蘆丁對DPPH自由基的清除率均隨著各自濃度的增加而增大，在低濃度范圍內增幅較大，在高濃度范圍內增幅變緩，并呈良好的對數(shù)相關關系，用y表示DPPH自由基清除率(%)，x表示樣液濃度(mg/mL)，得到回歸方程分別為y=23.531ln(x)+18.522(R2=0.987)，y=21.091ln(x)+22.58(R2=0.9884)，y=13.212ln(x)+74.559(R2=0.9468)，由此計算IC50分別為3.810，3.670，0.156 mg/mL。茶多酚對DPPH自由基清除能力在0.0534～0.1335 mg/mL濃度范圍內呈線性增長，線性回歸方程為y=906.54x-40.234(R2=0.9861)，濃度在0.1335～2.67 mg/mL范圍內，清除率幾乎不變，約為80%。根據(jù)線性回歸方程計算得到茶多酚IC50為0.0995 mg/mL。MRPs對DPPH自由基的清除能力與茶多酚和蘆丁差距較大，醇提物對DPPH自由基的清除能力略強于水提物。

圖5 美拉德反應產(chǎn)物對DPPH自由基清除作用

3 結論

酪蛋白-葡萄糖在烘焙條件下發(fā)生美拉德反應，體系色澤發(fā)生明顯變化，美拉德反應產(chǎn)物水提物和60%乙醇提取物的紫外可見分光光譜圖在420 nm處吸光度比反應前增大，在289 nm處出現(xiàn)吸收峰，熒光發(fā)射光譜峰值出現(xiàn)在426 nm處，符合美拉德反應生成物的特征。美拉德反應產(chǎn)物總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力與濃度均有量效關系，分別呈線性相關關系和對數(shù)相關關系，醇提物的總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力均略強于水提物。