木棉組培快繁體系的建立

彭洪杏，王瑋瑋

貴州林業(yè)勘察設(shè)計(jì)有限公司，貴州貴陽(yáng) 550003

木棉是一種可以生長(zhǎng)在干熱河谷的落葉大喬木，對(duì)干熱河谷的適應(yīng)性較強(qiáng)。木棉纖維是一種天然果實(shí)纖維，在光澤、吸濕性和保暖性方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，且具有良好的化學(xué)性能。該文通過(guò)比較不同處理方式對(duì)種子萌發(fā)的影響，以及木棉的增殖及生根配方的篩選，并對(duì)生根苗進(jìn)行煉苗移栽，以期建立木棉的組培快繁體系，為木棉不同單株的抗旱性評(píng)價(jià)、遺傳轉(zhuǎn)化、良種快繁等方面提供理論基礎(chǔ)。

1 木棉的概況

木棉(Bombax malabaricum DC.)是木棉科木棉屬的一種落葉大喬木，又名紅棉、英雄樹(shù)、斑芝樹(shù)、攀枝花等，主要分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)，集觀(guān)賞、經(jīng)濟(jì)、藥用價(jià)值于一身[1]。木棉具有很強(qiáng)的抗旱性，多生于干熱河谷或低山丘陵次生林中，多為海拔1700m 以下的區(qū)域。

木棉纖維有較好的吸濕放濕性能，穿著舒適性，抗菌驅(qū)螨功效，木棉纖維織物有較好的保暖性能等。木棉還具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其花清熱除濕，可入藥，是傳統(tǒng)涼茶五花茶的主要成分之一；其根皮祛風(fēng)濕，理跌打，樹(shù)皮為滋補(bǔ)藥；木棉果內(nèi)棉毛可作枕、褥和救生圈等填充材料；種子可作潤(rùn)滑油，制肥皂等，其木材輕軟可造紙、制箱板和小家具等[2]。

2 木棉育種與繁殖的研究現(xiàn)狀

1999 年，福建林秀香[3]從廣西引進(jìn)青皮木棉種子，在漳州進(jìn)行了繁殖和試種，表現(xiàn)出生長(zhǎng)快、適應(yīng)強(qiáng)、病蟲(chóng)害少等特點(diǎn)，拓展了木棉的栽培區(qū)域。2007年，汪書(shū)麗[4]研究認(rèn)為云南干熱河谷地區(qū)木棉居群的遺傳多樣性水平較高，且對(duì)環(huán)境依賴(lài)性小,居群間的遺傳分化較低。高潔等[5]對(duì)攀枝花干熱河谷14種植物耐旱性強(qiáng)弱進(jìn)行了排序，木棉相對(duì)其它幾種植物耐旱性要弱，所以培育出更耐旱的、適應(yīng)性強(qiáng)的新品種是育種的新目標(biāo)。中國(guó)育種工作者對(duì)開(kāi)遠(yuǎn)縣棉場(chǎng)的木棉種和文山縣棉場(chǎng)的木棉種進(jìn)行雜交[6]，使纖維長(zhǎng)度增加了6.66cm，紡紗質(zhì)量更高，為雜交育種的開(kāi)展提供了借鑒[7-9]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的探索與研究，在育種上也取得了一定的成果，其中由開(kāi)遠(yuǎn)和文山兩地雜交的木棉具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，產(chǎn)生的棉絮纖維長(zhǎng)度及質(zhì)量都得到很大提高。

3 材料與方法

3.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為木棉種子，采集于保山市潞江鎮(zhèn)，采集時(shí)間為2016 年4 月。

3.2 試驗(yàn)方法

3.2.1 種子萌發(fā)

挑選木棉飽滿(mǎn)無(wú)破損種子，放于燒杯中用清水沖洗5次～6 次，然后用濃硫酸浸種2min，自來(lái)水洗凈。然后用60℃水開(kāi)始浸泡，水溫降至室溫后換水一次，重復(fù)3 次后浸泡種子2d，至種皮變軟。將浸泡過(guò)的種子取出用蒸餾水清洗2 次～3 次，然后用75%酒精進(jìn)行消毒，置于超凈工作臺(tái)上，再用0.1%升汞溶液浸泡10min，期間不斷搖動(dòng)，再用無(wú)菌水沖洗4次～5 次，放在無(wú)菌濾紙上吸干種子表面水分，待接種。

在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，將消毒后的木棉種子一部分種子直接播種到底部放濾紙，加水5ml 左右的滅菌瓶中，另外一部分剝?nèi)シN皮接到MS 培養(yǎng)基上（如表1），然后置于溫度25℃、光照強(qiáng)度3000lx 條件下培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，7d 后觀(guān)察并記錄在不同方法培養(yǎng)下種子萌發(fā)情況，篩選最佳種子萌發(fā)方法。

表1 種子種皮處理方法試驗(yàn)Tab.1 Experiment on Seed Coat Treatment Method.

在獲得無(wú)菌苗后，選取相同培養(yǎng)基條件下生長(zhǎng)良好的小苗，將無(wú)菌苗取出去掉根部，將小苗頂芽接種到以MS+30g/L 蔗糖的培養(yǎng)基中。每種處理培養(yǎng)基接種20 瓶，培養(yǎng)20d 后觀(guān)察其生長(zhǎng)狀況。

3.2.2 增殖培養(yǎng)

以MS 為基本培養(yǎng)基，附加30g/L 蔗糖，4.6g/L瓊脂，pH5.4。將6-BA 和NAA 兩種激素的不同濃度添加到培養(yǎng)基中，采用正交法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。其中，6-BA 濃 度 分 別 為0.3mg/L、0.6mg/L、1.2mg/L；NAA濃度分別為0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L。切取分化培養(yǎng)中獲得的長(zhǎng)約1cm 健壯芽苗，進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)取9 組不同激素濃度配比與1 個(gè)對(duì)照共計(jì)10 個(gè)處理，每個(gè)處理10 瓶，每瓶放置材料5 株，然后定時(shí)觀(guān)察記錄生長(zhǎng)增殖情況。

3.2.3 生根培養(yǎng)

以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，附加30g/L 蔗糖，4.6g/L瓊脂，pH 5.4。將不同濃度的IBA 和NAA 兩種激素添加到培養(yǎng)基中。其中生長(zhǎng)素IBA 濃度分別為0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L，NAA 濃度分別為0.3mg/L、1.0mg/L。試驗(yàn)選取增殖培養(yǎng)中健壯的無(wú)菌苗為材料，切取長(zhǎng)約2cm 的頂芽接入培養(yǎng)基中。試驗(yàn)取5組不同激素濃度配比，共計(jì)5 個(gè)處理，每個(gè)處理5瓶，每瓶放置材料5 株。觀(guān)察并記錄苗的生根情況，篩選出最佳生根培養(yǎng)基。

3.2.4 移栽煉苗

以紅土、腐殖土為原料。將生根良好、生長(zhǎng)健壯的木棉組培瓶苗從組織培養(yǎng)室移至普通實(shí)驗(yàn)室或溫室大棚，瓶?jī)?nèi)煉苗7d；然后將瓶蓋揭開(kāi)1/3，放置2d；最后將瓶口完全揭開(kāi)放置1d 后(其間注意組培苗的保濕)，將苗從組培瓶中移栽至上述的基質(zhì)中。煉苗過(guò)程中，要保證基質(zhì)足夠的水分，并采取一定的遮光措施。

3.3 數(shù)據(jù)分析

增殖系數(shù)=瓶苗在一個(gè)周期內(nèi)形成的有效苗數(shù)/接種苗數(shù)

生根率=生根株數(shù)/ 接入生根的芽苗總數(shù)×100%

平均根數(shù)=根總數(shù)／生根株數(shù)×100%平均根長(zhǎng)=生根苗根總長(zhǎng)／生根苗總數(shù)×100%試驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS、Excel 等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

4 結(jié)果與分析

4.1 無(wú)菌苗的獲得

在無(wú)菌操作臺(tái)上，將木棉種子用75%酒精消毒后，再用0.1%升汞處理10min，最后用無(wú)菌水沖洗4次～5 次。通過(guò)對(duì)木棉種子進(jìn)行消毒處理后，在種子萌發(fā)過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)乳黃色污物，可見(jiàn)消毒不徹底，可能是操作或者工具滅菌不徹底所致。部分未去皮的種子會(huì)長(zhǎng)白毛，消毒不徹底的原因可能是與種子自身的特點(diǎn)有關(guān)系。

對(duì)消好毒的種子的種皮進(jìn)行不同的處理，觀(guān)察各組種子的發(fā)芽情況并記錄，試驗(yàn)處理如表2。

表2 種皮處理對(duì)發(fā)芽的影響Tab.2 Effect of Seed Coat Treatment on Germination

通過(guò)試驗(yàn)，結(jié)果顯示：先用60℃的溫水處理，一方面能起到催芽的作用，另一方面能夠軟化種皮，避免機(jī)械處理種皮時(shí)傷到胚。比較兩種種皮的不同處理方法發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率都不是達(dá)到很好的效果，但是相比之下全去皮處理后的種子發(fā)芽率較不去皮的要高，同時(shí)全去皮后的木棉種子萌發(fā)容易且發(fā)芽率高，長(zhǎng)勢(shì)較好，獲得的無(wú)菌苗葉莖較綠，生長(zhǎng)健康。而未去皮的木棉種子發(fā)芽率較低，種子容易長(zhǎng)白毛，獲得的無(wú)菌苗不利于后期的增殖及生根培養(yǎng)。所以該次實(shí)驗(yàn)種子全部使用全去皮處理。一般4d 就開(kāi)始發(fā)芽，發(fā)芽率達(dá)79%，7d 左右可取無(wú)菌苗頂芽進(jìn)行組織培養(yǎng)。

4.2 不同激素組合對(duì)木棉增殖的影響

選取生長(zhǎng)正常的不定芽，以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA 和NAA 進(jìn)行增殖培養(yǎng)配方的篩選，40d 后進(jìn)行觀(guān)察，并統(tǒng)計(jì)增殖率及芽的生長(zhǎng)情況，其結(jié)果如表3 所示，隨著6-BA 濃度的增加，不定芽的增殖倍數(shù)逐步降低，葉片伸展也較差，小苗長(zhǎng)勢(shì)一般，葉片失綠、發(fā)黃，新長(zhǎng)的嫩葉很少，部分葉片及嫩梢出現(xiàn)畸形。1、2、3、4、5、6 六個(gè)處理之間在增殖系數(shù)方面差異不顯著，增殖系數(shù)在4.6～3.4 之間，但是3、4、5、6 四個(gè)處理中小苗的長(zhǎng)勢(shì)明顯不如處理1 和2，兩個(gè)處理中處理2 的平均苗高和增殖系數(shù)均低于處理1，但處理2 中木棉小苗的顏色也較處理1 的濃綠、粗壯、葉片伸展良好，利于不定芽的增殖培養(yǎng)；處理1 中小苗生長(zhǎng)狀況不太均勻，部分苗梢葉片枯死。7、8、9 三個(gè)處理之間的增殖系數(shù)及平均苗高不存在顯著差異，而苗的生長(zhǎng)情況較差，苗的顏色相對(duì)偏黃、葉展較弱。因此結(jié)合方差分析和多重比較，以及增殖苗的生長(zhǎng)情況，綜合分析得出，處理2（MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L）為木棉不定芽增殖的較理想培養(yǎng)方案。

表3 不同處理下不定芽增殖效果比較Tab.3 Comparison of Adventitious Bud Proliferation Effects under Different Treatments

4.3 不同生長(zhǎng)素濃度對(duì)木棉生根的影響

將增殖后的小苗轉(zhuǎn)移到添加了不同濃度NAA 和IBA 的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，20d 后觀(guān)察統(tǒng)計(jì)各處理組培苗的生根率、主根條數(shù)、主根長(zhǎng)度和須根長(zhǎng)度(表4)。IBA 濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致生根率下降。當(dāng)NAA 的濃度為0.3mg/L、IBA 的濃度為1.0mg/L 時(shí)，所有組培苗均能生根，主根根短而粗壯，植株葉色濃綠、長(zhǎng)勢(shì)旺盛。不同培養(yǎng)基中木棉培養(yǎng)生根效果如表4。

表4 不同培養(yǎng)基中木棉培養(yǎng)生根效果Tab.4 Rooting Effect of Bombax Malabaricum Culture in Different Media

對(duì)不同處理中木棉苗的生根效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可知，處理C 中根長(zhǎng)勢(shì)良好但生根率較差且苗葉有枯黃現(xiàn)象。處理E、D、A 中的不定芽具有較高的生根率分別為98%、96%、76.6%，E、D、A 三個(gè)處理之間不存在顯著差異，而參考根的生長(zhǎng)情況，處理E 中的根較粗壯、根數(shù)多，因此認(rèn)為，處理E（1/2MS+IBA1.0 mg/L+NAA0.3mg/L）為木棉生根培養(yǎng)的較理想配方。

4.4 組培苗的煉苗移栽

煉苗移栽前需做好準(zhǔn)備，清除棚內(nèi)外所有雜物，對(duì)大棚進(jìn)行消毒處理。移栽前基質(zhì)配制及處理，選取疏松、透氣、透水、肥效好、少菌的紅土粉碎過(guò)篩后按紅土和腐殖土1:1 的比例混勻，然后裝入7cm×7cm或6.5cm×6.5cm 的營(yíng)養(yǎng)杯中，再用70%甲基托布津800～1000 倍液或50%多菌靈800～1000 倍液充分淋施營(yíng)養(yǎng)杯土。

木棉生根苗培養(yǎng)40d 左右后，將組培苗從瓶?jī)?nèi)取出，洗凈根部粘附的培養(yǎng)基，移栽時(shí)輕拿輕放，種植時(shí)根土密接，以根不外露，植株固定不倒為宜。移栽后盡快淋足定根水，最后在栽培苗床用透明薄膜搭制小拱棚，并用泥土壓實(shí)拱棚四周，同時(shí)大棚頂覆蓋遮陽(yáng)網(wǎng)。

基質(zhì)采用紅土和腐殖土是因?yàn)榧t土能增加基質(zhì)的粘性和保水性，腐殖土提供小苗營(yíng)養(yǎng)。剛從培養(yǎng)基中脫離的幼苗，適應(yīng)能力較弱，對(duì)水分、光照等的要求非?？量蹋瑹捗缰凶⒁饪刂坪脺貪穸?。

5 結(jié)論

木棉是一種集觀(guān)賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值于一身的優(yōu)良物種。應(yīng)該建立好一套組培快繁的體系，從而有助于優(yōu)良品種的快速繁殖，通過(guò)植物組織培養(yǎng)的手段可以為木棉不同單株的抗旱性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)材料，也為其遺傳轉(zhuǎn)化、良種快繁等方面奠定基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)木棉快繁體系建立的試驗(yàn)與分析，得到以下結(jié)論：

（1）在無(wú)菌苗獲得過(guò)程中，比較了去種皮與未去種皮兩種方法對(duì)無(wú)菌苗獲得的不同影響，全去種皮的木棉種子更容易獲得無(wú)菌苗，且污染率低，無(wú)菌苗生長(zhǎng)良好，有利于后期組培苗的增殖及生根培養(yǎng)。

（2）在增殖培養(yǎng)中，木棉的組培苗增殖以MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L 對(duì)于不定芽的增值效果最佳，其中培養(yǎng)周期為20d，增殖系數(shù)達(dá)到4.0。

（3）在生根試驗(yàn)中，以1/2MS+IBA1.0mg/L+NAA 0.3mg/L 激素配比對(duì)根的誘導(dǎo)效果最佳，平均生根率達(dá)到了98%，平均主根數(shù)達(dá)到了2.3 根。

（4）在煉苗過(guò)程中，主要是控制好溫濕度，則有助于木棉組培苗移栽成活。