杏果實(shí)成熟前后果肉硬度及軟化相關(guān)酶活性的變化

夏樂晗，黃振宇，陳 龍，崔澤軒，陳玉玲

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，鄭州，450009)

杏是原產(chǎn)于中國的特色果樹[1]。我國杏栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富多樣[2]。杏果實(shí)成熟早，口感獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，且具有獨(dú)特的保健功效，深受消費(fèi)者喜愛，市場前景廣闊[3-4]。杏為呼吸躍變形果實(shí)，成熟軟化不僅影響杏的外觀品質(zhì)和食用口感，而且在生產(chǎn)上會給杏果實(shí)貯運(yùn)、商品果實(shí)銷售帶來較大困難[5]。果實(shí)的成熟軟化是一個(gè)復(fù)雜的變化過程，在此過程中會發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，主要涉及到呼吸作用的增強(qiáng)、多糖類的分解、細(xì)胞膜的氧化以及有害代謝物質(zhì)的積累等[6-7]。以往對杏果實(shí)成熟軟化的研究大部分都是在果實(shí)采后貯藏期間進(jìn)行的[8-9]，有關(guān)常溫條件下杏果實(shí)成熟前后軟化規(guī)律的報(bào)道較少。另外，已有文獻(xiàn)對果實(shí)成熟軟化過程中與活性氧代謝相關(guān)的生理指標(biāo)的變化進(jìn)行報(bào)道[10-11]，但是針對杏果實(shí)的報(bào)道較少。早金艷為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所選育的極早熟杏品種[12]。本試驗(yàn)對兩個(gè)品種(軟肉品種早金艷和硬肉品種金太陽)杏果實(shí)成熟前后的果肉硬度、乙烯釋放量、丙二醛含量及與活性氧代謝有關(guān)的酶活性進(jìn)行了測定和分析，以期探討不同杏品種果實(shí)成熟前后軟化的生理機(jī)制的差異，探討硬肉果實(shí)軟化慢的原因，為硬肉杏新品種的選育及提高杏果實(shí)的商品質(zhì)量和貨架壽命提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料供試材料為早金艷、金太陽，均采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所李杏課題組新鄉(xiāng)試驗(yàn)基地。試驗(yàn)地土壤為砂壤土，地勢平坦，立地條件一致。栽培株行距2 m×4 m，常規(guī)管理，樹勢健壯，均為5年生以上大樹，樹冠大小、樹勢基本一致，生長結(jié)果正常。在試驗(yàn)基地，金太陽果實(shí)發(fā)育期為66 d，早金艷果實(shí)發(fā)育期為55 d。分別于果實(shí)成熟前20 d開始采樣，每5 d采一次，直至果實(shí)落完。每個(gè)采樣期從試驗(yàn)樹外圍四個(gè)不同的方向采摘成熟度一致、大小一致、果形良好、無病蟲害的36個(gè)果實(shí)作為樣品。取果實(shí)的赤道部位，切碎，混勻后放入-80 ℃超低溫冰箱中速凍，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測定。每個(gè)采樣期生物學(xué)重復(fù)3次，所有測定結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值。果肉硬度和乙烯釋放量指標(biāo)測定在采樣當(dāng)天完成。

1.2 試驗(yàn)器材Specord 50紫外-可見分光光度計(jì)(德國Analytic Jena公司)，BS214D電子天平(德國賽多利斯公司)，H2050R臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，GC-2010型氣相色譜儀(日本島津公司)，安捷倫氣相手動進(jìn)樣針[月旭科技(上海)股份有限公司]，TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀(英國 Stable Micro Systems公司)，磨樣機(jī)，水浴鍋，研缽，1 mL石英比色皿及可調(diào)式移液槍。

1.3 測定方法果實(shí)硬度采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測定。每個(gè)采樣期每個(gè)品種選取5個(gè)果實(shí)，每個(gè)果實(shí)在縫合線對稱兩側(cè)中部分別去皮測定一次，共測定10次，取平均值。質(zhì)構(gòu)儀探頭直徑為2 mm，以1 mm/s的穿刺速率下壓，下壓深度為5 mm，讀取最大值。

參考文獻(xiàn)[13-15]，采用島津(日本)GC-2010型氣相色譜儀測定果實(shí)乙烯釋放量。取5～8個(gè)杏果實(shí)，置于密閉的750 mL容器中，室溫下2 h后，用進(jìn)樣針抽取密閉容器中的1 mL氣體注入氣相色譜儀進(jìn)行測定。氣相色譜工作條件：色譜柱為Rtx-1701(30 m×0.25 mm)，柱溫為50 ℃，載氣為氮?dú)?N2)，檢測器(FID)溫度200 ℃，進(jìn)樣口溫度120 ℃；氫氣流速60 mL/min，空氣流量400 mL/min，壓力43.5 kpa，尾吹氣流30 mL/min；柱流量 0.49 mL/min。乙烯釋放量[μL/(kg·h)]=c×V×m-1×t-1。式中，c為氣相色譜測定后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算的樣品氣體中乙烯含量(μL/L)，V為干燥器密閉空間的容積(mL)，m為果實(shí)質(zhì)量(g)，t為測定時(shí)間(h)。

丙二醛(MDA)含量、脂氧合酶(LOX)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性的測定均使用北京Solarbio生物科技有限公司的試劑盒檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬度變化從果實(shí)成熟前20 d開始，兩個(gè)品種的果肉硬度均呈現(xiàn)出下降的趨勢。果實(shí)成熟前，早金艷的果肉硬度高于金太陽；成熟前5 d到成熟時(shí)，早金艷的果肉硬度下降明顯(降幅為71.9%)，金太陽的果肉硬度下降不明顯(降幅僅為0.3%)。果實(shí)成熟時(shí)，早金艷的果肉硬度與金太陽無顯著差異，約為7.14 kg/cm2。果實(shí)成熟后，金太陽的果肉硬度高于早金艷；果實(shí)成熟后5 d內(nèi)，金太陽的果肉硬度下降23.2%(降至6.23 kg/cm2)，早金艷的果肉硬度下降79.2%(降至1.48 kg/cm2)；果實(shí)成熟后10 d，金太陽的果肉硬度仍達(dá)4.97 kg/cm2，而早金艷僅為1.09 kg/cm2?？梢姡麑?shí)成熟前5 d至成熟后5 d，早金艷果實(shí)的果肉硬度下降速度比金太陽快，即果肉軟化速度比金太陽快(見圖1)。

注：橫坐標(biāo)負(fù)數(shù)表示果實(shí)成熟前時(shí)間,正數(shù)表示成熟后時(shí)間。誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母表示同一品種不同時(shí)間之間差異顯著(p < 0.05)；*指同一時(shí)間金太陽與早金艷差異顯著(p < 0.05)。圖2至圖7同。

2.2 乙烯釋放量變化成熟前后，兩個(gè)杏品種果實(shí)乙烯釋放量的變化趨勢基本一致。成熟前，金太陽和早金艷的乙烯釋放量一直處于較低水平，從成熟前10 d開始乙烯釋放量逐漸增加；成熟時(shí)，兩品種的乙烯釋放量分別為11.45和97.59 μL/(kg·h)；成熟后5 d，兩品種的乙烯釋放量均升至最高，早金艷的乙烯釋放量是金太陽的5.42倍，此后兩個(gè)品種的乙烯釋放量均明顯減少。果實(shí)成熟前5 d及以后，早金艷果實(shí)乙烯釋放量始終顯著(p<0.05)高于金太陽(見圖2)。在成熟前，兩個(gè)品種的果實(shí)硬度均下降，而乙烯釋放量均上升，金太陽果實(shí)的乙烯釋放量與果肉硬度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.773)，早金艷果實(shí)的乙烯釋放量與果肉硬度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.992)；果實(shí)成熟后，兩個(gè)品種的果實(shí)硬度繼續(xù)下降，而乙烯釋放量呈先上升后下降的趨勢，金太陽果實(shí)的乙烯釋放量與果肉硬度呈正相關(guān)(r=0.004)，而早金艷果實(shí)的乙烯釋放量與果肉硬度負(fù)相關(guān)(r=-0.663)。

圖2 兩個(gè)杏品種果實(shí)成熟前后乙烯釋放量的變化

2.3 MDA含量與LOX活性變化成熟前后，兩個(gè)品種果實(shí)MDA含量變化基本一致，均呈上升趨勢，早金艷MDA含量始終高于金太陽(見圖3)。成熟前后，兩個(gè)品種果實(shí)LOX活性變化基本一致，均呈上升趨勢，早金艷LOX活性始終高于金太陽(見圖4)。相關(guān)性分析表明，金太陽的果肉硬度與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.821)，果肉硬度與LOX活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.857)，MDA含量與LOX活性呈極顯著正相關(guān)(r=0.992)；早金艷的果肉硬度與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.756)，果肉硬度與LOX活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.922)，MDA含量與LOX活性呈極顯著正相關(guān)(r=0.944)。

圖3 兩個(gè)杏品種果實(shí)成熟前后MDA含量的變化

圖4 兩個(gè)杏品種果實(shí)成熟前后LOX活性的變化

2.4 CAT、SOD和POD活性變化成熟前后，兩個(gè)品種果實(shí)CAT活性變化趨勢一致，呈現(xiàn)為升(成熟前20 d到成熟前10 d)—降(成熟前10 d至成熟)—升(成熟至成熟后5 d)—降(成熟后5 d至成熟后15 d)。成熟前20 d到成熟前10 d，早金艷果實(shí)CAT活性顯著(p<0.05)高于金太陽；成熟前10 d到成熟時(shí)，早金艷果實(shí)CAT活性下降75.4%，金太陽下降54.5%。成熟前5 d至成熟后 15 d，早金艷果實(shí)CAT含量低于金太陽(見圖5)。

圖5 兩個(gè)杏品種果實(shí)成熟前后CAT活性的變化

成熟前后，兩個(gè)品種果實(shí)SOD活性變化趨勢一致，呈現(xiàn)為降(成熟前20 d至成熟)—升(成熟至成熟后10 d)—降(成熟后10 d至成熟后15 d)，成熟時(shí)均最低。成熟前20 d到成熟前5 d，早金艷果實(shí)SOD活性高于金太陽；成熟前5 d到成熟，早金艷果實(shí)SOD活性下降比金太陽明顯，早金艷下降40.5%，金太陽下降15.5%，成熟至成熟后15 d金太陽果實(shí)SOD活性高于早金艷(見圖6)。

圖6 兩個(gè)杏品種果實(shí)成熟前后SOD活性的變化

成熟前后，兩個(gè)杏品種果實(shí)POD活性變化趨勢一致，成熟前下降，成熟后上升，成熟時(shí)最低。成熟前20 d到成熟15 d，金太陽果實(shí)POD活性始終高于早金艷(見圖7)。

圖7 兩個(gè)杏品種果實(shí)成熟前后POD活性的變化

3 討論與結(jié)論

乙烯是植物體內(nèi)一種重要的內(nèi)源激素，其參與調(diào)節(jié)植物的生長、發(fā)育和衰老。乙烯在果實(shí)的呼吸躍變、糖分的積累和轉(zhuǎn)化、有機(jī)酸成分的變化、芳香物質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)化以及果實(shí)組織的軟化等過程中起著重要的作用[16]，這在獼猴桃[17]、番石榴[18]、櫻桃[19]等許多果實(shí)上已有研究。果實(shí)硬度是反映果實(shí)軟化的外在指標(biāo)，在果實(shí)成熟過程中，果肉硬度的變化是一個(gè)復(fù)雜的生理生化變化過程。

有研究表明，果實(shí)硬度的變化與乙烯釋放量有關(guān)，乙烯釋放量高促進(jìn)果實(shí)軟化，不利于果實(shí)硬度的保持[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)杏品種果實(shí)乙烯釋放量從成熟前10 d開始逐漸增加，早金艷果實(shí)乙烯釋放量高于金太陽，尤其是果實(shí)成熟前5 d至成熟后5d，早金艷果實(shí)乙烯釋放量增量和增幅明顯大于金太陽，加速了早金艷果實(shí)的軟化，這可能是果實(shí)成熟前后5 d早金艷迅速軟化而金太陽軟化緩慢的原因之一。

有研究表明，果實(shí)成熟軟化與活性氧代謝密切相關(guān)，膜脂過氧化作用是引起果實(shí)軟化的因素之一[11]。在果實(shí)成熟過程中，MDA和LOX都與膜脂過氧化作用有關(guān)。其中，MDA的積累來自不飽和脂肪酸的降解，通過強(qiáng)烈地與細(xì)胞內(nèi)各種成分發(fā)生反應(yīng)，嚴(yán)重地?fù)p傷生物膜，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)及生理完整性的破壞，進(jìn)而加速果實(shí)成熟軟化；LOX為膜脂過氧化啟動的關(guān)鍵酶，能催化不飽和脂肪酸氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜脂過氧化，直接影響果實(shí)衰老[21-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，杏果肉硬度與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與LOX活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，早金艷的MDA含量和LOX活性高于同期金太陽，較高的MDA含量和LOX活性促進(jìn)早金艷果實(shí)成熟后迅速變軟，較低的MDA含量和LOX活性則是金太陽果實(shí)成熟后變軟慢的重要原因之一。在生產(chǎn)中，可以通過一些試劑的使用，降低LOX的活性(或含量)，減少M(fèi)DA的含量，保護(hù)果肉內(nèi)各種酶和膜，讓果肉硬度繼續(xù)保持[25-26]。

在長期的系統(tǒng)進(jìn)化過程中，植物細(xì)胞形成了一套防御活性氧、自由基毒害的保護(hù)機(jī)制，其中，活性氧清除酶系統(tǒng)起著主要作用[27-28]。CAT、SOD和POD等是活性氧清除酶系統(tǒng)中的重要保護(hù)酶，可有效清除活性氧自由基，阻止高濃度氧的積累，保持體內(nèi)活性氧的平衡，防止膜脂過氧化作用，從而延緩植物的衰老，使植物維持正常的生長和發(fā)育[24,29-30]。在本研究中，金太陽果實(shí)POD活性一直高于早金艷果實(shí)，且CAT活性從成熟前5 d開始、SOD活性從成熟時(shí)開始也高于早金艷果實(shí)，有助于保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，延緩了果實(shí)軟化速度，果實(shí)成熟后果肉硬度始終大于早金艷。理論上，可在果實(shí)近成熟期開始使用外源CAT、SOD和POD，以保護(hù)果實(shí)內(nèi)各種酶與膜，進(jìn)而使果肉硬度得以保持。

綜上所述，杏果實(shí)在成熟過程中，果肉硬度逐漸下降，軟肉品種早金艷果實(shí)成熟前的果肉硬度大于硬肉品種金太陽，成熟后的果肉硬度小于金太陽，早金艷果實(shí)軟化速度大于金太陽，尤其是在成熟前后5 d早金艷果實(shí)軟化速度明顯大于金太陽。這與果實(shí)成熟過程中，早金艷果實(shí)乙烯釋放量高于金太陽(尤其是果實(shí)成熟前5 d至成熟后5d，早金艷果實(shí)乙烯釋放量增量和增幅明顯大于金太陽)，早金艷果實(shí)MDA含量和LOX活性始終高于金太陽，金太陽果實(shí)POD活性一直高于早金艷，且CAT活性從成熟前5 d開始、SOD活性從成熟時(shí)開始也高于早金艷有關(guān)。