復(fù)合閾值處理法在病理診斷中的應(yīng)用

王卉歡（通訊作者），陳 濱

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院計(jì)算機(jī)教研室，黑龍江 150081）

國(guó)家癌癥中心2021年中國(guó)最新癌癥報(bào)告顯示，惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康的一大類疾病。肺癌、肝癌等依然是我國(guó)主要的惡性腫瘤。肝臟病理診斷是肝病患者診療過程的重要組成部分，對(duì)腫瘤性及非腫瘤性肝病診斷、預(yù)后以及治療起著非常關(guān)鍵的作用。肝病理診斷可以了解肝臟病變的程度和活動(dòng)性并做出較客觀、精確診斷。疾病早期，利用血液生化分析和B超檢查方法難以檢測(cè)出肝臟炎癥和纖維化的程度，而肝臟活檢的病理檢查可以準(zhǔn)確診斷肝臟的炎癥和纖維化程度，以及肝硬化的分型及病因，如酒精性肝硬化或肝炎后肝硬化等。此外，肝活檢病理診斷有助于肝臟疾病治療的藥物選擇及療效判斷，通過評(píng)判治療前后肝組織病理變化，為藥物治療提供可靠指標(biāo)，為臨床藥物治療提供客觀的評(píng)價(jià)依據(jù)?，F(xiàn)今，常用的抗肝炎病毒的藥物療程長(zhǎng)、價(jià)格貴，這勢(shì)必會(huì)加重“看病難、看病貴”等諸多社會(huì)問題。如果在治療前進(jìn)行病理診斷，根據(jù)肝臟組織炎癥活動(dòng)程度有選擇性和針對(duì)性地應(yīng)用抗病毒藥物，不僅能提高療效，還能適當(dāng)降低治療費(fèi)用。肝活檢病理診斷也可以為不同類型病毒性肝炎的病原學(xué)診斷提供依據(jù)，大部分肝炎病毒是嗜肝病毒，多在肝組織中寄生，只有在血清肝病病毒達(dá)到一定量時(shí)，臨床化驗(yàn)才能夠檢測(cè)出來。肝活檢病理診斷利用超敏感性的免疫組織化學(xué)和原位分子雜交技術(shù)，能夠及時(shí)有效地檢測(cè)出寄生在肝組織中的肝炎病毒。肝活檢病理診斷有利于多種肝病的鑒別診斷，許多臨床診斷比較困難的慢性肝病，都需要通過肝活檢病理診斷來及時(shí)了解病人的肝臟病變，為醫(yī)療診斷提供至關(guān)重要的醫(yī)學(xué)依據(jù)［1］。

肝臟的病理檢查被公認(rèn)為是肝臟疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是一種能夠直接了解肝組織的病理變化、給出較精準(zhǔn)診斷的檢驗(yàn)方法，診斷價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血液生化、影像學(xué)檢查，是其他檢查無法替代的。病理診斷是對(duì)活檢或手術(shù)切下的病變標(biāo)本進(jìn)行固定、染色后，在顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞病變特征后，給出相應(yīng)診斷。目前為止，病理診斷仍被視為帶有宣判性質(zhì)的、權(quán)威性的診斷［2］。癌癥的診斷在病理學(xué)診斷中最為復(fù)雜，很大程度上依賴于診斷醫(yī)生自身的經(jīng)驗(yàn)。

隨著科技的不斷發(fā)展，醫(yī)學(xué)影像的處理在診斷中的作用不斷加強(qiáng)，對(duì)醫(yī)學(xué)圖像進(jìn)行處理和分析非常重要。傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)影像處理主要針對(duì)的目標(biāo)有血管攝影（Angiography）、電腦斷層掃描（CT，Computerized tomography）、正子發(fā)射斷層掃描（PET Positron emission tomography）、核磁共振成像（NMRI，Nuclear magnetic resonance imaging）等，但是缺乏對(duì)于病理切片（Pathological section）處理的研究。

病理科是大型綜合醫(yī)院不可缺少的科室之一，主要承擔(dān)病理診斷任務(wù)。日常工作包括活體組織檢查、脫落和細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查、尸體解剖檢查等。通俗地說，就是將從患者體內(nèi)取下的組織進(jìn)行固定、取材、脫水、包埋、切片等步驟后，根據(jù)疾病情況通過HE染色、特殊染色、免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交等技術(shù)對(duì)疾病進(jìn)行確診，為臨床提供明確的病理診斷，確定疾病的性質(zhì)，查明死亡原因，并可為臨床后續(xù)治療提供指導(dǎo)性信息［2］。在我國(guó)，病理醫(yī)生十分稀缺，而病理切片卻又是癌癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，所以需要分析的病理切片較多，病理醫(yī)生的工作強(qiáng)度很大，而且病理分析還要依靠經(jīng)驗(yàn)和多種技術(shù)手段，有時(shí)醫(yī)生主觀情緒波動(dòng)會(huì)造成關(guān)鍵部位的遺漏或疏忽。以上情況導(dǎo)致病理誤診時(shí)有發(fā)生，從而耽誤患者錯(cuò)過最佳治療時(shí)期，或?qū)]有病變的部位切除。病理報(bào)告的誤診不僅對(duì)群眾的身體健康造成了很大威脅，同時(shí)也會(huì)增加醫(yī)患矛盾發(fā)生的機(jī)率。使用醫(yī)學(xué)影像的技術(shù)手段來協(xié)助醫(yī)生進(jìn)行病理分析和診斷是近年來一個(gè)重要的研究方向。

為了解決以上問題，國(guó)內(nèi)外一直在研究將病理切片“數(shù)字化”。如今國(guó)外在數(shù)字化病理系統(tǒng)的應(yīng)用上已達(dá)到較高的水平。例如，澳大利亞新南威爾士大學(xué)早在2004年就首次成功地將數(shù)字化病理應(yīng)用于病理學(xué)教學(xué)與考試的累積性評(píng)估。國(guó)外的數(shù)字化病理系統(tǒng)在遠(yuǎn)程會(huì)診和遠(yuǎn)程切片分析方面也得到了廣泛應(yīng)用，如德國(guó)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)利用數(shù)字病理系統(tǒng)進(jìn)行乳腺癌遠(yuǎn)程診斷。

有了數(shù)字化的病理切片，除了可以實(shí)現(xiàn)教學(xué)和遠(yuǎn)程會(huì)診等用途，還可以實(shí)現(xiàn)利用計(jì)算機(jī)處理醫(yī)學(xué)影像。傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)影像處理經(jīng)常使用的計(jì)算機(jī)技術(shù)有空域變換、直方圖增強(qiáng)、銳化濾波器等［3-4］，國(guó)內(nèi)外對(duì)此有過很多研究，主要有以下幾種：①圖像低層特征的提取和描述；②基于區(qū)域的圖像檢索（Region-Based Image Retrieval）；③圖像語義特征的提??；④高維索引技術(shù)；⑤相關(guān)反饋（Relevance Feedback）與機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合。

雖然研究的角度很多，但是在處理病理切片時(shí)，如果病變部位較為復(fù)雜，或是病變組織雜亂無章、噪音雜質(zhì)較多，經(jīng)常無法取得較好的效果。為了解決病理切片診斷的時(shí)間過長(zhǎng)、誤診、漏診等問題，提高病理診斷的效率和精準(zhǔn)度，避免錯(cuò)過最佳治療時(shí)間、錯(cuò)誤切除健康組織等醫(yī)療事故，我們重點(diǎn)研究了以下幾點(diǎn)：

①肝組織的病理切片的數(shù)字化。

②使用計(jì)算機(jī)圖像算法排除噪音雜質(zhì)以及干擾信息。

③研發(fā)復(fù)合式分割圖像算法，分析病理切片中的有效信息，包括疑似病變細(xì)胞、活檢組織的全貌、活檢部位、可疑癌腫的形狀、邊緣是否清楚以及活檢組織的大小，如直徑或長(zhǎng)度等，并根據(jù)這些數(shù)據(jù)給出病變（主要指癌變）的概率以及良性和惡性腫瘤的概率。

④將多組切片按機(jī)器分析的概率進(jìn)行排序，標(biāo)注疑似癌變圖像，計(jì)算癌變概率，從而協(xié)助醫(yī)生給出客觀診斷。

計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)可以將完全依靠個(gè)人經(jīng)驗(yàn)的病理診斷方法轉(zhuǎn)變?yōu)榱炕笜?biāo)，為病理醫(yī)生診斷提供參考。以往對(duì)病理切片圖像處理的研究主要集中在通過對(duì)圖像興趣區(qū)域的大量學(xué)習(xí)，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)識(shí)別病變組織的目的［5］。本研究提出的復(fù)合閾值病理切片圖像處理方法，能夠凸顯正常肝組織與病變肝組織在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別，從而幫助醫(yī)生做出正確診斷，使診斷更具客觀性和科學(xué)性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院20例肝臟癌變和20例正常肝臟病理切片。使用日本Nikon ECLIPSE Ci顯微鏡，在10倍、20倍、40倍下攝影，生成JPEG格式圖片。

1.2 方法

①病理切片進(jìn)行數(shù)字化，采集10倍、20倍、40倍等多重影像。

②將圖片進(jìn)行閾值灰度（Grayscalethreshold）處理，提取有效像素點(diǎn)。

③多次修改閾值，將圖片有效降噪，記錄最佳閾值。

④采用逐點(diǎn)分割圖片的方法，將圖片切成若干小范圍圖片，即區(qū)域。與傳統(tǒng)方式不同的是，區(qū)域并不是從圖上完整劃分，這些區(qū)城的大小、范圍并不固定，而且這些區(qū)域的某一部分和其他區(qū)域有較大的重合，重合度越高，劃分越精細(xì)，越容易找出癌變組織，但是計(jì)算速度越慢。所以要找出最佳的切割點(diǎn)，其中必有癌變組織最明顯的圖片。將這些圖片運(yùn)用直方圖（histogram）對(duì)比方法進(jìn)行圖像比對(duì)，按照?qǐng)D像癌變相似度進(jìn)行圖像排序。本項(xiàng)目主要采用計(jì)算機(jī)圖形學(xué)的相關(guān)技術(shù)，包括圖像分割技術(shù)（Image Segmentation Technology）、圖 像 的 空 域 變 換（Spatial Transform）、直接灰度調(diào)整（Direct grayscale adjustment）、直方圖增強(qiáng)算法（Histogram enhancement algorithm）等技術(shù)，最終實(shí)現(xiàn)一種基于區(qū)域的圖像檢索（Region-Based Image Retrieval）［6］。

軟件開發(fā)使用c#語言，在visual studio 2017中采用.netframework4.5集成環(huán)境編寫程序，用來實(shí)現(xiàn)算法。

1.2.1 編寫病理切片圖像處理系統(tǒng)

本研究編寫的病理切片圖像處理系統(tǒng)界面包括圖像讀取、中位數(shù)設(shè)置、復(fù)合閾值處理法、保存右側(cè)處理完成圖像等功能。見圖1。

圖1 病理切片圖像處理系統(tǒng)主界面

1.2.2 理論依據(jù)

肝癌是指發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，根據(jù)組織學(xué)類型可將肝癌分為肝細(xì)胞肝癌、膽管細(xì)胞癌以及混合型肝癌。肝細(xì)胞肝癌最為常見，約占肝癌的90%，癌細(xì)胞來自肝細(xì)胞，異形性明顯，胞質(zhì)豐富呈多邊形，排列成巢狀或索狀，血竇豐富，如果有包膜則生長(zhǎng)比較緩慢。膽管細(xì)胞癌比較少見，癌細(xì)胞是由膽管上皮細(xì)胞發(fā)展而來，呈立方或柱狀，排列成腺樣，纖維組織較多，血竇較少。混合型肝癌最少見，其具有肝細(xì)胞肝癌和膽管細(xì)胞癌兩種成分。肝癌的影像學(xué)檢查可能并不會(huì)觀察到甲胎蛋白的異常，而肝細(xì)胞癌的影像學(xué)檢查甲胎蛋白大多會(huì)顯著升高。

本研究的理論依據(jù)是正常肝臟肝板由單層肝細(xì)胞組成，故肝板間的肝竇形態(tài)相對(duì)規(guī)則且分布均勻；而肝細(xì)胞癌變時(shí)，肝板由多層細(xì)胞組成且腫瘤細(xì)胞形成團(tuán)塊，故與正常肝組織相比肝竇數(shù)量減少、形態(tài)不規(guī)則、分布紊亂［1-2，7-8］。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

選取肝癌切片20張、正常肝組織切片20張，分別在顯微鏡攝影倍數(shù)為4倍、10倍、20倍、40倍時(shí)進(jìn)行攝影，生成病理切片圖像。由于病理切片圖像普遍超過4M，直接處理的話，時(shí)間長(zhǎng)、效率低。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，將圖片按10%縮小處理。在病理切片圖像處理系統(tǒng)中讀入切片圖像，分別將閾值設(shè)為-2、0、5、7、9進(jìn)行比較。為了避免染色劑使用量對(duì)圖片造成深淺不一的影響，對(duì)圖片進(jìn)行了二值化處理。

本研究提出復(fù)合閾值處理法，步驟如下：

①首先設(shè)置閾值m，默認(rèn)為123，可根據(jù)明暗效果自行設(shè)置。

②分別計(jì)算中間色的rgb值：

③計(jì)算中間色值mc：

④如果mc＞255-m則mc不變；否則mc=mc+m。

⑤設(shè)原圖中的每個(gè)像素點(diǎn)色值為p，如果（r+g+b）/3＞mc則p=255，否則p=0。

⑥黑白取值后，可將黑白反相處理（顛倒）。

為了加強(qiáng)圖片顯示效果，可根據(jù)明暗效果設(shè)定閾值或進(jìn)行反相處理。

2 結(jié)果

2.1 正相處理結(jié)果比較

為了找到最佳診斷效果的圖片以及與放大倍數(shù)、自定義閾值的關(guān)系，本文在放大倍數(shù)為4、10、20、40下，將閾值分別設(shè)為-2、-1、0、1、5、7、9、10，對(duì)兩例肝癌切片圖像和兩例正常肝組織切片圖像依次進(jìn)行處理。20倍與40倍的處理結(jié)果優(yōu)于4倍和10倍。閾值≤2或閾值＞9時(shí)，圖像不清晰，省略。首先正相處理結(jié)果比較，放大倍數(shù)為20，見圖2。放大倍數(shù)為40，見圖3。

圖2 20倍 正相處理結(jié)果比較

圖3 40倍 正相處理結(jié)果比較（效果好的圖片略大）

2.2 反相處理結(jié)果比較

見圖4、圖5。用于病理診斷效果最好的參數(shù)值如圖6。

圖4 20倍 反相處理結(jié)果比較

圖5 40倍 反相處理結(jié)果比較（效果好的圖片略大）

3 結(jié)語

本課題不僅采用了傳統(tǒng)計(jì)算機(jī)圖像算法，如直方圖相似度對(duì)比、灰度閾值、二值化、圖像的空域變換等方法來實(shí)現(xiàn)基于區(qū)域的圖像檢索（Region-Based Image Retrieval），并且創(chuàng)新地提出了一種新的復(fù)合式分割法，將圖片重復(fù)分割，分割區(qū)域和大小不確定，每個(gè)小圖都進(jìn)行計(jì)算和分析，以求找到最佳圖片（即最明顯的癌變圖像）。同時(shí)將所有圖像按癌變概率進(jìn)行排序，極大地幫助了醫(yī)生實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地診斷。

通過使用復(fù)合閾值圖像處理方法，可以看出正常組織切片條紋分明，肝竇成規(guī)則條紋狀，且分布均勻；而癌組織切片條紋雜亂，肝竇成不規(guī)則條紋狀，且分布不均勻，相較于正常組織，黑色素成團(tuán)狀大量出現(xiàn)（見圖6）。研究結(jié)果表明，當(dāng)顯微鏡放大倍率為40，閾值為7，在利用本研究提出的復(fù)合閾值算法處理后的圖像以及進(jìn)行反相處理后，閾值在7-9之間的圖像中，可以很清晰地看到肝竇是否分布均勻，從而給出是否發(fā)生病變的診斷結(jié)論。該算法以軟件的形式提供，并將在實(shí)踐中不斷升級(jí)和改進(jìn)，有助于精確診斷，減少誤診、醫(yī)療事故等，同時(shí)有助于臨床醫(yī)生的培養(yǎng)。

圖6 可用于診斷的參考圖像