高效液相色譜法測(cè)定保健食品中5種雌性激素

陳 潔

（寧德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福建 寧德 352100）

雌性激素（estrogen）又稱女性激素，分為雌激素和孕激素兩大類，是女性重要的荷爾蒙。適當(dāng)補(bǔ)充低劑量的雌性激素可達(dá)到改善皮膚狀態(tài)、延緩老化、刺激并維持女性第二性征（如促使乳房發(fā)育、增大）、增強(qiáng)骨骼硬度、降低落齒率等效果[1-4]，也可減輕女性更年期潮紅出汗、心慌氣急、煩躁易怒等癥狀[5-7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，通過(guò)食物也可補(bǔ)充雌性激素，個(gè)別雌性激素嚴(yán)重偏低者可在醫(yī)生指導(dǎo)下服用雌性激素藥品；但不可擅自補(bǔ)充，服用不當(dāng)者可能導(dǎo)致身體內(nèi)分泌失調(diào)，損傷生殖器官，增加罹患乳腺腫瘤和子宮內(nèi)膜病變幾率的風(fēng)險(xiǎn)[8-13]。

由于女性生活節(jié)奏、工作節(jié)奏加快，更年期提前、睡眠不好、壓力大、焦躁不安等問(wèn)題也隨之出現(xiàn)[14-17]。市面上宣稱有改善睡眠、美容養(yǎng)顏、延緩衰老的保健食品也受到這部分消費(fèi)者的歡迎。一些不法商家追求低成本、見(jiàn)效快、功能強(qiáng)的目的，很可能在此類保健產(chǎn)品中添加雌性激素類化學(xué)藥物，危害消費(fèi)者身體健康。

目前，國(guó)內(nèi)尚未出臺(tái)保健食品中雌性激素檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18-21]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[22-24]，高效液相色譜法[25-27]、酶聯(lián)免疫法[28-29]、熒光法[30-31]等。液相色譜儀因其價(jià)格相對(duì)便宜，準(zhǔn)確度、精密度高，操作簡(jiǎn)便、快速，因而受到更廣泛應(yīng)用，是近年研究的主要方向。本文建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定保健食品中5種雌性激素，對(duì)完善保健食品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)體系、為市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀[配有DAD檢測(cè)器，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司]；XPE 105電子天平（Mettler Toledo）；SQP電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；WP-UP-YJ-20S超純水機(jī)（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）。

1.2 材料

對(duì)照品信息：見(jiàn)表1。乙腈、甲醇：色譜純；實(shí)驗(yàn)用水：一級(jí)水。樣品為市售女士口服液。

表1 對(duì)照品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取對(duì)照品適量，精密稱定，置入50 ml量瓶，甲醇定容至刻度線，混勻，得1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)使用液：臨用前，準(zhǔn)確移取上述1 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 ml置入10 ml量瓶，甲醇定容至刻度線，混勻，得 100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

2.1.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取樣品1 g（精確到0.001 g）置入10 ml具塞離心管，加入5 ml甲醇，超聲10 min，取出，用甲醇定容至刻度線，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（60:20:20）；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：40 ℃。

2.3 色譜條件優(yōu)化

分別對(duì)比樣品甲醇溶液、5種雌性激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為10 μg/ml）和加入雌性激素標(biāo)樣的樣品甲醇溶液（濃度為10 μg/ml），用不同的流動(dòng)相（甲醇-水，乙腈-水以及甲醇-乙腈-水）進(jìn)樣測(cè)試，觀察各組分分離效果。結(jié)果表明，以甲醇-乙腈-水=60:20:20作為流動(dòng)相，流速0.8 ml/min時(shí)，可達(dá)到理想的分離效果，色譜圖見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 5種雌性激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

圖2 樣品甲醇溶液的色譜圖

圖3 加入雌性激素標(biāo)樣的樣品甲醇溶液的色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 檢出限、定量限及線性關(guān)系的考察 準(zhǔn)確移取適量100 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)使用液，用甲醇稀釋成濃度為5，10，20，30和50 μg/ml系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按2.2項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，以目標(biāo)物濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以3倍信噪比確定方法檢出限，10倍信噪比確定方法定量限。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5種雌性激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

由表 2 可見(jiàn)，在 5～50 μg/ml濃度范圍內(nèi)，5種雌性激素的線性方程相關(guān)系數(shù) r2≥0.999 91，線性關(guān)系良好；方法檢出限為 0.24～0.84 mg/kg，定量限為0.80～2.82 mg/ kg，表明本法靈敏度好，準(zhǔn)確度高。

2.4.2 精密度和穩(wěn)定性 在6個(gè)空白樣品中添加適量標(biāo)準(zhǔn)使用液，使每個(gè)空白樣品中最終加標(biāo)濃度為10 μg/ml，按照2.1.2項(xiàng)制備樣品，按2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄出峰時(shí)間及峰面積；并在0，2，5，8，10，24 h 各進(jìn)樣1次，記錄不同時(shí)間段各目標(biāo)物的峰面積變化，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 5種雌性激素的精密度和穩(wěn)定性

由表 3 可見(jiàn)，加標(biāo)濃度為10 μg/ml的6個(gè)平行樣中5種雌性激素的峰面積RSD為0.17 %～0.25 %，保留時(shí)間RSD為0.10 %～0.14 %，無(wú)明顯變化；24 h內(nèi)5種雌性激素的峰面積RSD為0.12 %～0.22 %，峰面積變化相對(duì)穩(wěn)定。綜上，表明本試驗(yàn)方法精密度佳，穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好，可適用于保健品中5種雌性激素的檢測(cè)。

2.4.3 方法回收率 在空白樣品中添加3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按2.1.2制備樣品，按2.2色譜條件進(jìn)行6水平測(cè)定，計(jì)算各目標(biāo)物回收率。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 5種雌性激素的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表（n=6）

由表4可見(jiàn)，各目標(biāo)物回收率為90.0 %～103.1 %，RSD為0.98 %～1.27 %，滿足GB/T 27404-2008的質(zhì)控要求。進(jìn)一步說(shuō)明本法準(zhǔn)確度高，精密度好，滿足保健品中5種雌性激素同時(shí)測(cè)定的要求。

2.5 樣品測(cè)定

采用本研究建立的方法，對(duì)市售10批次宣稱具有祛斑、美容養(yǎng)顏功效的女士口服液進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果表明，5種雌性激素含量均低于檢出限。

3 討論

本研究建立了一種同時(shí)測(cè)定女士口服液中雌三醇、己烯雌酚、雌二醇、雌酮和黃體酮等5種雌性激素含量的高效液相色譜方法。該法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，靈敏度強(qiáng)，能有效提高保健食品中雌性激素的檢測(cè)效率，為市場(chǎng)監(jiān)管部門提供技術(shù)依據(jù)。本次檢測(cè)的市售10批次宣稱具有祛斑、美容養(yǎng)顏功效的女士口服液，5 種雌性激素含量均低于檢出限，表明在法律和相關(guān)部門的監(jiān)管下，抽檢樣品中未發(fā)現(xiàn)假劣藥物和保健品非法添加情況。仍提醒消費(fèi)者應(yīng)通過(guò)正規(guī)渠道購(gòu)買保健食品，如發(fā)現(xiàn)制假售假或購(gòu)買到有問(wèn)題商品應(yīng)及時(shí)向政府部門報(bào)告。