HPLC同時(shí)測(cè)定槐榆止血合劑中4種黃酮苷類成分含量

楊軍輝，蔣 贏，俞 賓，陳國(guó)寶，袁 保，黃和軍，徐藝銓

（江陰市中醫(yī)院，江蘇 江陰 214400）

槐榆止血合劑是江蘇省江陰市名中醫(yī)繆建輝主任中醫(yī)師臨床經(jīng)驗(yàn)方，由槐花、地榆、陳皮、枳殼等7味藥組方，具有止血補(bǔ)血，行氣潤(rùn)腸之功效，臨床用于治療血熱腸燥所致痔瘡、肛裂出血，腸風(fēng)下血、腸燥便秘?；庇苤寡蟿┲饕钚猿煞譃辄S酮和鞣質(zhì)。槐花為方中君藥，其主要化學(xué)成分為黃酮苷類成分蘆丁，具有清熱止血與涼血止血功效，臨床常用于治療痔瘡出血[1-2]。枳殼-陳皮為經(jīng)典藥對(duì)，主要含有黃酮苷類化合物如橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等，具有行氣通便作用，可緩解痔瘡引起的便秘[3-4]。

中藥合劑作為多組分復(fù)雜體系，單一指標(biāo)成分難以全面評(píng)價(jià)合劑的制劑質(zhì)量[5-6]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定制劑中4種主要黃酮苷類成分含量，為槐榆止血合劑的院內(nèi)質(zhì)控提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配置VWD可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器（Agilent）；XP-6型百萬(wàn)分之一天平（Merrler Toledo）；KQ-5200DE型超聲清洗機(jī)（昆山超聲儀器公司）；TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100081-201811，純度：91.7 %）；柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110722-201815，純度：91.7 %）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-202019，純度：95.3 %）、新橙皮苷對(duì)照品（111857-201804，純度：99.4 %）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。槐榆止血合劑（批號(hào)：20210510，20210511，20210512）、槐花陰性樣品、枳殼和陳皮雙陰性樣品均由江陰市中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。甲醇、乙腈（色譜純，Tedia公司），水為娃哈哈純凈水；磷酸為分析純（南京化學(xué)試劑公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Sepax C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2 %磷酸（B），梯度洗脫（0～20 min，14 %～16 %A； 20～53 min，16 %～30 %A；53～58 min，30 %～14 %A；58～60 min，14%A）；流速：1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：35 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取適量的蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品，用甲醇溶解，制成濃度分別為206.3，131.1，117.2，134.2 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取1 ml合劑，置入50 ml量瓶，用甲醇定容，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）10 min，放冷后搖勻，離心（12000 r/min，10 min），取上清濾過(guò)，以續(xù)濾液作供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照槐榆止血合劑標(biāo)準(zhǔn)工藝生產(chǎn)，制備缺槐花、枳殼和陳皮雙陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)方法處理而得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別吸取混合對(duì)照品溶液、槐榆止血合劑供試品溶液、槐花陰性樣品溶液及枳殼和陳皮雙陰性樣品溶液各10 μl，按照2.1項(xiàng)方法檢測(cè)，各樣品色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，4種黃酮苷類成分與相鄰峰的分離度均＞1.5，陰性樣品無(wú)干擾，表明檢測(cè)方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

取混合對(duì)照品溶液，依次用甲醇逐級(jí)稀釋制成6個(gè)不同濃度的線性關(guān)系考察溶液，分別吸取10 μl，按2.1項(xiàng)方法檢測(cè)，記錄色譜圖。以各黃酮苷濃度為橫軸（X），相應(yīng)峰面積為縱軸（Y），繪制標(biāo)曲并生成線性方程，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，4種黃酮苷類成分各自的線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取線性關(guān)系考察中的同一個(gè)混合對(duì)照品溶液10 μl，按2.1項(xiàng)方法連續(xù)進(jìn)6針，記錄各黃酮苷類成分色譜峰峰面積，經(jīng)測(cè)算蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積RSD依次為1.42 %，2.30 %，1.46 %，1.70 %，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批槐榆止血合劑（批號(hào)：20210511），按2.2.2 項(xiàng)方法平行處理6份，按2.1項(xiàng)方法進(jìn)樣測(cè)定，經(jīng)測(cè)算蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量RSD依次為1.74 %，0.40 %，0.33 %，2.14 %，表明該法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批槐榆止血合劑（批號(hào)：20210511），按2.2.2項(xiàng)方法處理，置于室溫條件下，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.1 項(xiàng)方法進(jìn)樣測(cè)定，經(jīng)測(cè)算蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積RSD依次為1.93 %，0.49 %，0.47 %，1.53 %，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的槐榆止血合劑（批號(hào)20210511）0.5 ml，平行6份，加入同等含量的對(duì)照品溶液適量，按2.2.2項(xiàng)方法處理，再按2.1項(xiàng)方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算4種黃酮苷類成分的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 含量測(cè)定

取3批槐榆止血合劑（批號(hào)：20210510，20210511，20210512），按2.2.2項(xiàng)方法平行處理3份供試品溶液，按2.1項(xiàng)方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算4種黃酮苷類成分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n = 3）/mg·ml-1

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

參考2020年版中國(guó)藥典及文獻(xiàn)[7-8]，預(yù)試驗(yàn)階段分別考察了乙腈和甲醇作為有機(jī)相，以及甲醇-1 %冰醋酸溶液和乙腈-0.2 %磷酸溶液等多個(gè)流動(dòng)相對(duì)4種黃酮苷類成分分離效果的影響，系統(tǒng)適用性結(jié)果表明，乙腈-0.2 %磷酸溶液作為梯度洗脫的流動(dòng)相時(shí)，4種黃酮苷類成分分離度良好，峰形較好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

蘆丁有257 nm和360 nm兩個(gè)吸收波長(zhǎng)，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3種成分吸收波長(zhǎng)均在283 nm[9-11]。前期發(fā)現(xiàn)如將257 nm或360 nm定為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3種成分的色譜峰響較低，且槐榆止血合劑中這3種成分含量低于蘆丁，可能影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，故最終設(shè)定283 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，此條件下4種黃酮苷類成分均有較強(qiáng)的吸收。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定槐榆止血合劑中4種黃酮苷類成分蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的HPLC方法，該法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為槐榆止血合劑的質(zhì)控提供試驗(yàn)依據(jù)。