UPLC-FLR測定長效人紅細(xì)胞生長刺激素中唾液酸含量

呂素娟，劉作龍，王玉營，王惠琰，王云飛

（山東豐金生物醫(yī)藥有限公司，山東 煙臺 264000）

Darbepoetin alfa（商品名 Aranesp）是Amgen公司于2001年上市的多糖基化位點修飾的長效人紅細(xì)胞生長刺激素，用于治療慢性腎功能衰竭、癌癥放療化療及骨髓衰竭患者的貧血[1-3]，該產(chǎn)品于2021年于國內(nèi)上市。本研究使用的蘇州康聚生物科技有限公司研制的與Aranesp具有相同氨基酸序列的重組人新型紅細(xì)胞生長刺激素（處于臨床試驗階段），將促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）一級結(jié)構(gòu)中的5個氨基酸進(jìn)行定點突變，在57位和115位改變得到的2個天冬酰胺成為新的N-連接糖基化位點，N糖基化位點由3個增加到5個，從而使其體內(nèi)半衰期比EPO延長了3倍[4]。因為其糖基化的高豐度和不均一性會影響體內(nèi)活性[5-7]，不均一性主要由糖鏈末端唾液酸引起，常見的唾液酸主要有兩種：N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc）。人類缺乏胞苷酸N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶基，因此不能合成Neu5Gc，但大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞能進(jìn)行Neu5Gc修飾，而外源性Neu5Gc及其復(fù)合物被機(jī)體吸收并沉積在細(xì)胞表面，誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生抗Neu5Gc抗體，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生慢性炎癥最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8-9]。因此，唾液酸化（主要為Neu5Ac）程度的高低直接影響藥物體內(nèi)半衰期和藥物安全性，是重要的質(zhì)控指標(biāo)[4,10-11]。

《中國藥典》2020年版三部中人促紅素唾液酸含量測定為通則3102，使用酸水解后的唾液酸與間苯二酚反應(yīng)生成有色化合物，使用有機(jī)酸萃取后，測定含量。該方法操作過程使用較多有機(jī)溶劑，對環(huán)境及人員健康影響較大，且步驟繁瑣，結(jié)果重現(xiàn)性、耐用性較差，只能測定總唾液酸值，不能區(qū)分唾液酸種類[12]。本研究中長效人紅細(xì)胞生長刺激素與柱前熒光衍生試劑4,5-亞甲二氧基-1,2-苯二胺鹽酸鹽（DMB）[13-15]，在酸性條件下生成DMB衍生物，該衍生物經(jīng)373 nm激發(fā)光激發(fā)后，在448 nm能產(chǎn)生可辨識可定量的較強(qiáng)熒光信號，從而對樣品中Neu5AC和Neu5Gc進(jìn)行定性和定量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀-FLR熒光檢測器（Waters）；XPR105十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多）；UV2700紫外可見分光光度計（島津）；ThermoMixer C恒溫混勻儀（Eppendorf）；色譜柱Acclaim RSLC 120 C18（2.2 μm，2.1 mm ×100 mm）（Thermo）。

1.2 試藥

N-乙酰神經(jīng)氨酸（色譜純，TCI）；N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（色譜純，TCI）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Chemical）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chemical）；冰乙酸（Sigma）；2-巰基乙醇（Sigma）；連二亞硫酸鈉（Sigma）；4,5-亞甲二氧基-1,2-苯二胺鹽酸鹽（DMB，Sigma）；實驗用水為Milli Q超純水；長效人紅細(xì)胞生長刺激素原液（山東豐金生物醫(yī)藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 DMB標(biāo)記衍生試劑 取15 ml離心管，加入1.5 ml超純水、172 μl冰乙酸、112 μl 2-巰基乙醇，渦旋混勻；然后加入4.9 mg連二亞硫酸鈉（配制前稱于稱量紙中），渦旋溶解（此時溶液可能變渾濁）；最后加入3.5 mg DMB試劑（配制前稱于稱量紙中）和200 μl超純水，渦旋混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.1.2 Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)液（STD）（10 mmol/L） 準(zhǔn)確稱取Neu5Ac干粉15.5 mg置入5 ml量瓶，超純水溶解并定容，配制成10 mmol/L Neu5Ac STD。

2.1.3 Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液（STD）（10 mmol/L） 準(zhǔn)確稱取Neu5Gc干粉16.3 mg置入5 ml量瓶，超純水溶解并定容，配制成10 mmol/L Neu5Gc STD。取20 μl Neu5Gc STD（10 mmol/L）逐級稀釋至0.1 mmol/L Neu5Gc STD，終體積500 μl 以上。

2.1.4 唾液酸混合標(biāo)準(zhǔn)液：各取100 μl Neu5Ac STD（10 mmol/L）和100 μl Neu5Gc STD（0.1 mmol/L），加800 μl超純水，渦旋混勻后，再將混合溶液稀釋5倍，取200 μl，加800 μl超純水，渦旋混勻，為標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 pmol/μl Neu5Ac STD和2 pmol/μl Neu5Gc STD），現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線按照表1稀釋。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋表

2.2 樣品前處理

2.2.1 樣品水解 將長效人紅細(xì)胞生長刺激素原液稀釋至0.1 mg/ml，取50 μl稀釋至0.1 mg/ml的待測樣品置入1.5 ml離心管，加入50 μl 4 mol/L乙酸溶液，混合均勻后置于恒溫混勻儀中，80 ℃保溫2.5 h。

2.2.2 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記衍生 在100 μl水解后的樣品和100 μl標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入100 μl DMB標(biāo)記試劑，混勻后置于恒溫混勻儀中，50 ℃保溫3 h。

2.2.3 中止 在通風(fēng)櫥中移取50 μl標(biāo)記完成的樣品及標(biāo)準(zhǔn)品分別加至裝有950 μl超純水的2 ml離心管中，混勻后，用于色譜分析。

2.3 色譜條件

流速0.45 ml/min；壓力上限10000 psi；柱溫45 ℃；樣品室溫度6 ℃；熒光檢測器激發(fā)波長373 nm、發(fā)射波長448 nm；進(jìn)樣體積10 μl；運行時間13 min；流動相（甲醇:乙腈:超純水=7:9:84）。用流動相平衡超高效液相色譜儀，以流動相為空白，重復(fù)進(jìn)樣3次至基線平穩(wěn)，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品進(jìn)樣10 μl，運行時間13 min，記錄色譜圖。

以水解體系中唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品（0.05 mg/ml）水解體系中的唾液酸濃度（pmol/μl）。

2.4 方法驗證

2.4.1 專屬性 分別使用2.1.2和2.1.3項唾液酸標(biāo)準(zhǔn)液配制60 pmol/μl Neu5Ac STD、0.6 pmol/μl Neu5Gc STD，各取50 μl，同時使用超純水、STD3（混合標(biāo)準(zhǔn)液）各50 μl，經(jīng)2.2項處理后進(jìn)樣，色譜圖見圖1，可見超純水及空白在Neu5Ac和Neu5Gc峰處無干擾峰，單Neu5Ac STD及單Neu5Gc STD各主峰出峰與STD3混合標(biāo)準(zhǔn)工作液出峰時間相同，證明該方法具有專屬性。

圖1 唾液酸專屬性色譜圖

2.4.2 線性與范圍 以唾液酸峰面積為縱坐標(biāo)，唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，得到Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=2.53×106x+2.96×106，r2=0.9989，表明標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍20～100 pmol/μl內(nèi)，線性關(guān)系良好；Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=2.52×106x+1.32×104，r2=0.9991，表明標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍0.2～1.0 pmol/μl內(nèi)，線性關(guān)系良好。Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2。

圖2 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)曲線色譜圖

2.4.3 準(zhǔn)確度 取長效人紅細(xì)胞生長刺激素原液分別與STD5（2:8，高）混合，與STD3（5:5，中）混合，與STD1（2:8，低）混合，按步驟處理，各制備3份，每份檢測3次，考察回收率，Neu5Ac回收率為89.6 %～95.1 %，RSD為2.5 %，見表2。Neu5Gc回收率為90.9 %～97.4 %，RSD為2.9 %，見表3，表明本法準(zhǔn)確度較好。

表2 Neu5Ac回收率試驗結(jié)果

表3 Neu5Gc回收率試驗結(jié)果

2.4.4 重復(fù)性 使用1批長效人紅細(xì)胞生長刺激素原液制備6份樣品，重復(fù)測定6次，Neu5Ac含量RSD為0.3 %，Neu5Gc含量RSD為0.1 %，證明該方法的重復(fù)性較好，見表4。

表4 唾液酸重復(fù)性試驗結(jié)果

2.4.5 溶液穩(wěn)定性 將進(jìn)行重復(fù)性檢測的長效人紅細(xì)胞生長刺激素原液存放12 h后，再次進(jìn)行檢測，計算測定結(jié)果相對首次檢測結(jié)果的回收率，Neu5Ac含量回收率范圍為99.0 %～100 %，回收率RSD為0.1 %，Neu5Gc含量回收率范圍為97.0 %～100 %，回收率RSD為0.8 %，證明該方法樣品溶液穩(wěn)定性較好，見表5。

表5 唾液酸穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.5 長效人紅細(xì)胞生長刺激素原液唾液酸含量的測定

取5批長效人紅細(xì)胞生長刺激素原液，按要求進(jìn)行樣品處理，使用DMB衍生進(jìn)行唾液酸含量檢測，結(jié)果見表6，各批次滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)每1 mol蛋白唾液酸含量應(yīng)不低于18.0 mol，并在理論最大唾液酸修飾含量22.0 mol范圍內(nèi)。

表6 長效人紅細(xì)胞生長刺激素原液唾液酸含量測定結(jié)果

3 討論

本研究將長效人紅細(xì)胞生長刺激素原液酸水解后，使用DMB試劑衍生，然后使用超高效液相色譜-熒光檢測器進(jìn)行唾液酸Neu5Ac和Neu5Gc含量檢測，該方法使用外標(biāo)法定量，經(jīng)過專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、線性與范圍、溶液穩(wěn)定性驗證，證明該方法具有較強(qiáng)的實用性，相比于中國藥典間苯二酚法，規(guī)避了繁瑣的樣品前處理以及有機(jī)溶劑的危害，并能夠區(qū)分唾液酸Neu5Ac和Neu5Gc兩種類型修飾，可用于長效人紅細(xì)胞生長刺激素原液唾液酸含量的分析。