關(guān)于兩種伊紅染液在HE 染色中的選擇探討

何璋海

（中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院，廣東 廣州）

0 引言

蘇木精-伊紅染色法，簡稱HE 染色，業(yè)界最常用的一種組織學(xué)染色法，E 代表Eosin,伊紅，作用是顯示細胞漿、肌纖維、膠原纖維、嗜酸性顆粒、紅細胞等組織呈現(xiàn)不同程度的紅色或粉紅色，與胞核染料蘇木精在色澤上形成鮮明的紅藍對比，從而清晰的顯示出組織與細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)[1]。但實際工作中，使用醇溶性伊紅進行染色，胞漿、肌纖維等結(jié)締組織容易出現(xiàn)伊紅過染或者染色不均的現(xiàn)象，主要是由于其分化程度難以掌握，導(dǎo)致核漿對比模糊，而且它揮發(fā)性強，性價比不高，不太符合大批量HE 片的制作。針對存在的問題，我們用改良型水溶性伊紅液和醇溶性伊紅液進行對比染色，報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

德國Leica 公司的ST5020 全自動HE 染色機。

1.2 試劑

改良型Harris`蘇木素、0.5%改良型水溶性伊紅液、0.5%醇溶性伊紅液、1%鹽酸酒精、75%酒精、85%酒精、95%酒精、無水乙醇、苯酚二甲苯混合液[2]、二甲苯。

1.3 試劑配制

1.3.1 0.5%改良型水溶性伊紅液

水溶性伊紅粉末 2.5g，將其溶于500mL 蒸餾水，充分溶解，過濾。臨用前 每440mL 水溶性伊紅液滴加240 微升冰醋酸，充分混勻。

1.3.2 0.5%醇溶性伊紅液

醇溶性伊紅粉末2.5g，溶于500mL95%酒精，充分溶解，過濾，臨用前每440mL 醇溶性伊紅液滴加4 滴（約40 微升）冰醋酸。

1.3.3 改良型Harris`蘇木素

將蘇木精5g 溶于50mL 無水乙醇，硫酸鋁鉀100g 溶于1000mL 蒸餾水中，煮沸溶解，然后將兩液均勻混合至染液呈淡紅色，繼續(xù)加熱煮沸后取出，待30s 后緩慢加入氧化汞，待染液呈深紫色立即置入冰水中，待冷卻至室溫后過濾[3]。臨用前每440mL 蘇木素添加15mL 冰醋酸，充分混勻。

1.4 染色方法

應(yīng)用我科的常規(guī)活檢組織切片分成A、B 兩組，置于70°c烤箱烤片20min,然后分別在全自動染色機上作HE 染色，但是兩種伊紅染液將設(shè)置不同的程序進行染色，如下：

A 組：（1）二 甲 苯5min×2；（2）95% 酒 精5min×2；（3）85% 酒 精3min×1；（4）75% 酒 精1min×1；（5）自 來 水 洗30s×1；（6）改良型Harris` 蘇木素2min×1；（7）自來水洗5s×1；（8）1%鹽酸酒精3s×1；（9）自來水洗10min×1；（10）0.5%改良型水溶性伊紅50s×1；（11）自來水洗6s×1；（12）75% 酒 精3s×1;（13）85% 酒 精3s×1;（14）95% 酒 精5s×1；（15）苯酚二甲苯5min×2；（16）二甲苯2min×3。

B 組：（1）二 甲 苯5min×2；（2）95% 酒 精5min×2；（3）85% 酒 精3min×1；（4）75% 酒 精1min×1；（5）自 來 水 洗30s×1；（6）改 良 型Harris` 蘇 木 素2min×1；（7）自 來 水 洗5s×1；（8）1%鹽酸酒精3s×1；（9）自來水洗10min×1；（10）0.5%醇溶性伊紅50s×1；（11）75%酒精3s×1;（12）85%酒精3s×1;（13）95%酒精5s×1；（14）苯酚二甲苯5min×2；（15）二甲苯2min×3。

程序完成后，取出染片，用中性樹膠封片。

2 實驗結(jié)果

2.1 0.5%改良型水溶性伊紅液實驗組

HE 染色結(jié)果顯示胞漿、肌纖維、膠原纖維及嗜酸性顆粒、紅細胞等組織呈現(xiàn)不同程度的紅色或粉紅色，顏色鮮艷，與藍色的細胞核對比清晰,層次分明。

2.2 0.5%醇溶性伊紅液實驗組

HE 染色結(jié)果顯示顏色稍微暗啞，部分染片伊紅著色不均，核漿對比不太清晰。

圖1 0.5%醇溶性伊紅染色液 腸組織 10X0.25 倍鏡下圖

圖2 0.5%水溶性伊紅染色液 腸組織 40X0.65 倍鏡下圖

兩種伊紅染液的優(yōu)缺點對比情況

3 討論

通過實驗可以發(fā)現(xiàn)0.5%改良型水溶性伊紅液配制簡便，不易揮發(fā)，著色速度快，染色時間容易控制，組織染色均勻，顏色鮮艷。而0.5%醇溶性伊紅液配制繁瑣，易揮發(fā)，分化節(jié)點難控制，容易造成組織染色不均及顏色暗啞，這是歸因于染片前面經(jīng)過水洗藍化，水分或多或少帶到醇溶性伊紅這缸染液，隨著染片量的增多，濃度會不斷稀釋，加上后續(xù)的75%酒精、85% 酒精都會對其起到褪色作用，因此醇溶性伊紅液的分化程度會比水溶性伊紅難以掌握，還有它的揮發(fā)性強，每次染片前都需要補液，經(jīng)濟性上也比水溶性伊紅要差。對于制片工作量大的科室來說，尋找一種高效穩(wěn)定、性價比高的伊紅染液實屬必要，而我們對傳統(tǒng)型的水溶性伊紅作出改良配制，同樣可以制作出核漿對比清晰、紅藍色彩艷麗、層次分明的優(yōu)質(zhì)HE 片，縱觀伊紅液的染色原理得知其屬于酸性染料，在水中電離成帶負電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷結(jié)合而使胞質(zhì)染色，所以合理利用冰醋酸來調(diào)節(jié)伊紅液的PH 值更是胞漿染色是否艷麗的關(guān)鍵步驟，量不足，伊紅僅通過滲透或彌散作用，伊紅很難著色，而且與組織結(jié)合不牢固，分化后容易褪色；過量，則使染色體也發(fā)生電離導(dǎo)致其帶正電，造成核漿對比不清，另一方面也會抑制伊紅電離導(dǎo)致沉淀，染色失效[4]。

總之，控制好添加冰醋酸的量，改善染色程序，同樣可以使廉價、配制簡單的水溶性伊紅做到高效地解決染色不均、核漿對比不清晰等問題，另外，隨著浸染式染色平臺在各家醫(yī)院病理科的推廣使用，因其成本相對低以及試劑開放等特點[5]，在保證醫(yī)療質(zhì)量的同時還能提高效益性，特別適用于大批量機染的制作單位。