中藥顆粒劑中不可接受微生物的溯源分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

沈振，徐曉潔，任麗宏，馮丹陽(yáng)，孟曉麗，丁勃,2

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101；2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012)

中藥顆粒劑屬于非無(wú)菌藥品，根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則“1107非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)”(通則1107)[1]，產(chǎn)品中微生物負(fù)載需控制在標(biāo)準(zhǔn)限值內(nèi)，并不得檢出大腸埃希菌。中藥顆粒劑因其種類繁多的原輔料，獨(dú)特的生產(chǎn)工藝，易受到來(lái)自土壤和水環(huán)境的微生物污染，因此，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載的控制菌種類，對(duì)于控制產(chǎn)品質(zhì)量并不全面，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品微生物負(fù)載量、污染微生物特性、藥品特性、給藥途徑、用藥人群等方面進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，將具有潛在危害性的微生物訂入產(chǎn)品的微生物限度內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)或放行標(biāo)準(zhǔn)。

具有潛在危害的微生物即多種國(guó)外藥典已收載并定義為“不可接受微生物”，通常是指那些已知有明顯致病性的，存在足夠的數(shù)量，通過(guò)產(chǎn)品的給藥途徑可能導(dǎo)致患者不可接受風(fēng)險(xiǎn)的微生物[2]。常見(jiàn)的不可接受微生物包括：腸桿菌科的細(xì)菌，如陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質(zhì)沙雷菌、變形桿菌；非發(fā)酵革蘭陰性菌，如伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌、假單胞菌、不動(dòng)桿菌、鞘氨醇單胞菌等；芽孢桿菌屬的細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等[2]。對(duì)于非無(wú)菌產(chǎn)品，這些不可接受微生物在美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)發(fā)布的藥品和醫(yī)療產(chǎn)品召回案例中，所占的比例高達(dá)70%，其中最常見(jiàn)是伯克霍爾德菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌科細(xì)菌[3]。非無(wú)菌藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)對(duì)分離到的微生物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，確定其是否不可接受，建立微生物測(cè)試方法，并制定不低于藥典標(biāo)準(zhǔn)的微生物限度放行標(biāo)準(zhǔn)。

本研究源于中藥顆粒劑微生物限度檢查過(guò)程中需氧菌總數(shù)偏離正常檢驗(yàn)水平的事件，進(jìn)而分離、純化和鑒定，確定了主要污染菌。通過(guò)生產(chǎn)環(huán)節(jié)采樣，環(huán)境微生物的分離、鑒定和核糖體分型分析，溯源污染微生物，并根據(jù)污染菌特征，從方法、管理、設(shè)備和人員等方面作風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并提出應(yīng)對(duì)措施，為生產(chǎn)企業(yè)污染微生物的溯源和控制提供依據(jù)和方法。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基和試劑 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào)：20201212)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：20200507)購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(1091711)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1090021)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1082281)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào)：1087341)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1081931)購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑(批號(hào)：6106099)購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；聚山梨酯80(批號(hào)：20210107)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 VITEK2 Compact型全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)；RiboPrinter 全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)(美國(guó)海凈納)；DM1000顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)；GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；IPP250低溫培養(yǎng)箱(德國(guó)美墨爾特公司)；ML4002T/02電子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.3 樣品 該樣品為顆粒劑，13味中藥，經(jīng)煎煮濃縮，浸膏噴霧干燥制粒，與輔料混合干法制粒而得，不含藥材原粉。本次檢查樣品為A、B、C共3個(gè)批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 微生物限度檢查 本品為非無(wú)菌不含藥材原粉的中藥顆粒劑，照《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1107(四部通則1107)非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)檢查需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、大腸埃希菌。

2.2 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 稱取該樣品，以pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液，制成1∶10和1∶100供試液，采用平皿法(傾注法)，照《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1105“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查法：微生物計(jì)數(shù)法”(四部通則1105)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，各試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2.0，符合藥典要求(見(jiàn)表1)。本品采用計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查(見(jiàn)表2)。

表1 方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

表2 微生物限度檢查結(jié)果

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn) 取1∶10供試液10 mL，接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，照《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1106“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查法：控制菌檢查法1106”(四部通則1106)，開(kāi)展控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)，在規(guī)定的溫度和最短時(shí)間下培養(yǎng)，可檢出大腸埃希菌的反應(yīng)特征，符合藥典要求。本品采用控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行大腸埃希菌檢查(見(jiàn)表2)。

2.4 樣品中污染微生物的分離和鑒定

2.4.1 微生物分離 平皿法(傾注法)瓊脂平板上的菌落難以挑取，A批次中需氧菌負(fù)載大，取1∶10供試液檢查會(huì)使菌落計(jì)數(shù)受到背景雜質(zhì)和顏色的影響。因此，照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，取1∶100供試液，采用薄膜過(guò)濾法，以pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為沖洗液，沖洗3次，每次100 mL/膜，濾膜貼在胰酪大豆胨瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h。方法適用性試驗(yàn)照《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1105進(jìn)行，各試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2.0，符合藥典要求(見(jiàn)表1)。

2.4.2 菌株純化 貼有濾膜的胰酪大豆胨瓊脂平板上，共計(jì)數(shù)單菌落28 cfu，根據(jù)菌落特征差異，篩選出3個(gè)菌落，編號(hào)X1、X2和X3。其中，與X1相同菌落特征共26 cfu，X2和X3各1 cfu。用無(wú)菌接種環(huán)挑取以上3個(gè)菌落，劃線接種于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)18 h。因X1在樣品中的生物負(fù)載高，超過(guò)了需氧菌總數(shù)的限度要求，本文將其作為重點(diǎn)研究對(duì)象，開(kāi)展溯源分析。

2.4.3 菌種鑒定 挑取以上3株菌純培養(yǎng)物，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)劃線接種于麥康凱瓊脂和紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)48 h。X1、X2和X3均為革蘭陰性桿菌，無(wú)芽孢，可在麥康凱瓊脂平板和紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上生長(zhǎng)(見(jiàn)表3)。

表3 樣品中污染微生物的形態(tài)觀察

采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)3株菌進(jìn)行生理生化鑒定。X1為陰溝腸桿菌復(fù)合菌(Enterobactercloacaecomplex)，X2為嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，X3為魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetbacterlwoffii)。

2.5 污染微生物調(diào)查和溯源

2.5.1 生產(chǎn)環(huán)節(jié)采樣 經(jīng)生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)勘查，發(fā)現(xiàn)總混間地面PVC地板有裂縫，且存有積水。根據(jù)污染微生物的生物學(xué)特性，在了解該品種的生產(chǎn)工藝流程的前提下，圍繞總混間，確定了7處采樣點(diǎn)：總混間純化水、總混間地面PVC地板裂縫、總混機(jī)內(nèi)壁、總混間回風(fēng)口、總混機(jī)附近地面、清洗間地面積水處、清洗工具。以含1%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為增菌培養(yǎng)基，分別用無(wú)菌棉球，每個(gè)采樣點(diǎn)采樣2份，置33 ℃培養(yǎng)7 d，每天觀察。

2.5.2 生產(chǎn)環(huán)節(jié)污染微生物的分離、純化和鑒定 取生長(zhǎng)渾濁的培養(yǎng)液，劃線接種在麥康凱瓊脂平板和紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)24～48 h，分離菌落特征存在差異的單菌落，編號(hào)Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6。分別挑取以上6個(gè)單菌落劃線在胰酪大豆胨瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)18 h。采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)分離得到的純培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定(見(jiàn)表4)。

表4 生產(chǎn)環(huán)節(jié)污染微生物鑒定

2.5.3 同源性分析 挑取VITEK 2 Compact結(jié)果一致的X1和Y3兩株菌，用RiboPrinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)進(jìn)行核糖體分型分析(見(jiàn)圖1)。

圖1 RiboPrinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定結(jié)果

結(jié)果表明，X1和Y3兩株菌與RiboPrinter系統(tǒng)庫(kù)中DUP-14233親緣關(guān)系接近，鑒定為陰溝腸桿菌。而將X1的基因指紋圖譜定義為1，Y3的相似度達(dá)0.96，結(jié)合VITEK 2 Compact，可確認(rèn)X1和Y3同源。由此說(shuō)明A批次污染的陰溝腸桿菌主要來(lái)源于總混間總混機(jī)附近地面。

2.5.4 留樣的再檢驗(yàn) 抽取與該批次樣品同一生產(chǎn)線，生產(chǎn)時(shí)間前后共6批次樣品，進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果均符合規(guī)定，且未檢出陰溝腸桿菌和其他生產(chǎn)環(huán)節(jié)分離的微生物。說(shuō)明本次微生物污染的事件未覆蓋整條生產(chǎn)線，也未波及其他批次藥品。

2.5.5 污染微生物風(fēng)險(xiǎn)分析 陰溝腸桿菌分類學(xué)上歸腸桿菌目腸桿菌科腸桿菌屬，是腸道菌群中的一種細(xì)菌，同時(shí)廣泛存在于人和動(dòng)物的糞便水、泥土、植物中。陰溝腸桿菌是條件致病菌，現(xiàn)已成為醫(yī)院感染越來(lái)越重要的病原菌，其引起的細(xì)菌感染性疾病，常累及多個(gè)器官，包括皮膚軟組織感染、泌尿道感染、呼吸道感染以及敗血癥等[4-5]。隨著臨床上青霉素類、頭孢菌素、碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，誘導(dǎo)陰溝腸桿菌能產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和Amp C酶，耐藥情況十分嚴(yán)重，特別對(duì)免疫力低下的人群有極大的危害，給臨床治療帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)[6-8]，同時(shí)也給藥品生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制加大難度。

雖然調(diào)查結(jié)果顯示本次微生物污染事件未覆蓋整條生產(chǎn)線，也未波及其他批次藥品，但是，根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)、生產(chǎn)工藝判斷，本品容易受到腸桿菌屬污染，總混間回風(fēng)口檢出的傷口埃希菌，表明該菌屬甚至可以在潔凈廠房空氣中長(zhǎng)期存活，進(jìn)一步印證了控制陰溝腸桿菌的必要性。因此，建議企業(yè)將陰溝腸桿菌作為本品的不可接受微生物進(jìn)行控制，訂入產(chǎn)品的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)或放行標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

3.1 產(chǎn)品中分離出的其他污染菌分析 除陰溝腸桿菌外，本次實(shí)驗(yàn)從樣品中分離到的其他2株菌，嗜麥芽窄食單胞菌和魯氏不動(dòng)桿菌都是醫(yī)院感染微生物的重要致病菌來(lái)源[9-11]。它們主要分布于土壤和水環(huán)境中，易在潮濕環(huán)境中生存，均屬于條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)引發(fā)感染。因嗜麥芽窄食單胞菌和魯氏不動(dòng)桿菌，在產(chǎn)品中的負(fù)載量低，且未能在生產(chǎn)環(huán)節(jié)分離到，故暫未將其列為不可接受微生物進(jìn)行控制。但企業(yè)應(yīng)持續(xù)關(guān)注，積累檢測(cè)數(shù)據(jù)，做好趨勢(shì)分析，一旦發(fā)現(xiàn)檢出頻次或數(shù)量的異常波動(dòng)，應(yīng)立刻啟動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)分析機(jī)制，重新評(píng)估控制該兩種微生物的必要性。

3.2 生產(chǎn)企業(yè)的環(huán)境控制 藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)嚴(yán)格按照《藥品生產(chǎn)管理規(guī)范》2010年版[12]的相關(guān)要求進(jìn)行環(huán)境監(jiān)控，開(kāi)展浮游菌、沉降菌和塵埃粒子的監(jiān)測(cè)，關(guān)注生產(chǎn)環(huán)境的異常變化，如地面的腐蝕和損毀、高效過(guò)濾器的完整性、車間的溫濕度、潔凈區(qū)的氣流變化等。生產(chǎn)環(huán)節(jié)分離到的微生物從分類學(xué)上屬于腸桿菌科，說(shuō)明現(xiàn)有生產(chǎn)環(huán)境已被腸桿菌科細(xì)菌污染，且適宜于腸桿菌科細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。造成這一微生物污染風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)的可能原因包括：①人員、原料、設(shè)備進(jìn)場(chǎng)未能嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)SOP，造成腸桿菌科細(xì)菌由非潔凈區(qū)向潔凈區(qū)的轉(zhuǎn)移；②生產(chǎn)后清場(chǎng)不徹底，存在積水，為腸桿菌科細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖提供適宜條件；③清場(chǎng)時(shí)使用的消毒劑不能徹底地消殺腸桿菌科細(xì)菌，甚至引起了該類細(xì)菌的抗性。由此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)人員和現(xiàn)場(chǎng)QA的培訓(xùn)，包括生物安全、微生物基礎(chǔ)理論、生產(chǎn)工藝、設(shè)備操作、進(jìn)出消毒等內(nèi)容；縮短環(huán)境監(jiān)控周期，增加對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域表面微生物的采集頻次；更換或添加不同類型的消毒劑用于人員進(jìn)出消毒、設(shè)備清場(chǎng)清潔和環(huán)境的消殺。

3.3 不可接受微生物的風(fēng)險(xiǎn)管理 《美國(guó)藥典》(USP42)<1115>指出，針對(duì)每一種產(chǎn)品都列出不可接受微生物的清單是不現(xiàn)實(shí)的。哪些微生物是“不可接受的”取決于藥品屬性、給藥途徑、用藥人群等。生產(chǎn)企業(yè)有責(zé)任判斷藥品中的微生物是否為不可接受。根據(jù)ICH Q9[13]和PDA TR67[2]的風(fēng)險(xiǎn)管理流程，不可接受微生物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估包括風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和風(fēng)險(xiǎn)分析與評(píng)價(jià)兩個(gè)環(huán)節(jié)。風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別，即微生物的鑒定和溯源。風(fēng)險(xiǎn)分析與評(píng)價(jià)，即從給藥途徑與使用方法、用藥人群和藥品特性三個(gè)方面探討污染微生物的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)確定產(chǎn)生危害的原因是污染微生物的致病性，還是生物負(fù)載量[14]。本次分離到的陰溝腸桿菌，為條件致病菌，生物負(fù)載量較高，且藥物的使用人群包括老人、兒童和免疫力較低者，屬于中等風(fēng)險(xiǎn)水平，故將其列為為本品中等風(fēng)險(xiǎn)的不可接受微生物。而嗜麥芽窄食單胞菌和魯氏不動(dòng)桿菌雖是條件致病菌，但生物負(fù)載量低，環(huán)境中也未檢出，可評(píng)估為低風(fēng)險(xiǎn)不可接受微生物，暫不進(jìn)行控制。通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，生產(chǎn)企業(yè)建立不可接受微生物的風(fēng)險(xiǎn)控制方法，設(shè)定內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)日常檢驗(yàn)結(jié)果異常時(shí)，應(yīng)立即啟動(dòng)OOS調(diào)查，快速溯源并消除污染源。

3.4 總結(jié) 微生物污染風(fēng)險(xiǎn)控制是藥品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量評(píng)估的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是飛行檢查的重要關(guān)注點(diǎn)。根據(jù)2014～2018年原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的藥品飛行檢查數(shù)據(jù)，在所有缺陷項(xiàng)中，微生物相關(guān)缺陷的占比高達(dá)36%，且多為高風(fēng)險(xiǎn)缺陷，而涉及中藥生產(chǎn)企業(yè)的微生物缺陷占到63%[15]。微生物缺陷分布主要集中在方法、管理、設(shè)備、原輔料和人員等方面，這些高風(fēng)險(xiǎn)行為則是引發(fā)上市產(chǎn)品微生物污染的主要原因。因此，藥品微生物污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)與控制應(yīng)該得到企業(yè)的足夠重視，特別是對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)要求之外的潛在污染微生物，要進(jìn)行充分的研判，必要時(shí)增加控制項(xiàng)目，收緊限度要求，盡可能消除其對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響。微生物的控制不能僅僅依賴于終產(chǎn)品檢驗(yàn)，必須從生產(chǎn)過(guò)程控制著手[16-17]，持續(xù)的微生物質(zhì)量控制應(yīng)該貫穿于產(chǎn)品的整個(gè)生命周期。企業(yè)應(yīng)培養(yǎng)具有較高微生物鑒定和溯源能力的專業(yè)技術(shù)人員隊(duì)伍，建立多元化的微生物鑒定溯源平臺(tái)，構(gòu)建環(huán)境和產(chǎn)品污染菌庫(kù)[18],提升微生物污染控制的綜合能力。