硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的合成及體外抗氧化活性研究

＊李學(xué)麗 胡青青 馮德日

（沈陽醫(yī)學(xué)院 遼寧 110034）

谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）是體內(nèi)一種非常重要的抗氧化酶，其可以有效的清除活性氧自由基（ROS），防止組織細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化和衰老現(xiàn)象[1-2]。GPX酶活性中心的催化基團(tuán)主要是硒代半胱氨酸（Se-Cys）基團(tuán)，特別是金屬硒（-Se）基團(tuán)的催化作用對于GPX的抗氧化活性非常關(guān)鍵。目前，已有多項(xiàng)臨床研究表明，人體內(nèi)GPX活性的下降及缺失與心腦血管疾病、克山病及多種腫瘤疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3-5]。

4-叔丁基杯[4]芳烴是由苯酚單元通過亞甲基在酚羥基鄰位連接而成的環(huán)狀小分子聚合物。由于其具有分子量小、包含多個(gè)活性基團(tuán)而更易于進(jìn)行多種化學(xué)修飾等特點(diǎn)，4-叔丁基杯[4]芳烴目前已成為繼環(huán)糊精和冠醚之后廣受矚目的第三代有機(jī)合成超分子[6,7]。在4-叔丁基杯[4]芳烴的空間結(jié)構(gòu)中，其內(nèi)部具有一個(gè)由4個(gè)苯酚單元所圍成的疏水腔結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)類似于催化酶活性中心的底物結(jié)合部位結(jié)構(gòu)，非常有利于其作為模擬酶與多種酶的催化底物相結(jié)合的作用。同時(shí)其4個(gè)苯酚單元的結(jié)構(gòu)下緣都各有1個(gè)羥基（-OH）活性基團(tuán)，可以進(jìn)行多種化學(xué)修飾，引入各種模擬酶的催化基團(tuán)。

在我們的研究中，我們以4-叔丁基杯[4]芳烴疏水腔結(jié)構(gòu)下緣苯酚單元的-OH基團(tuán)為修飾靶點(diǎn)，在其結(jié)構(gòu)中引入了GPX酶的關(guān)鍵催化基團(tuán)-金屬硒（-Se），首次合成了一種新的GPX模擬物—硒代4-叔丁基杯[4]芳烴，合成路線見圖1。此外，我們還建立了由Fe2+/Vc誘導(dǎo)的牛心線粒體損傷體系，對硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的體外抗氧化GPX活性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究[8-10]。

圖1 硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的合成路線

1.實(shí)驗(yàn)部分

(1)試劑與儀器

①試劑。4-叔丁基杯[4]芳烴、對甲苯磺酰氯（p-TsCl）、硼氫化鈉（NaBH4）、硫代巴比妥酸、抗壞血酸購自為國藥集團(tuán)公司，硒（Se）、谷胱甘肽（GSH）、輔酶（NADPH）、谷胱甘肽還原酶（RD）購自Sigma公司產(chǎn)品，其它均為國產(chǎn)分析純試劑直接使用。

②儀器。Bruker-300型核磁共振儀，Agilent 7890A-5975C型ESI-MS質(zhì)譜儀（甲醇為溶劑），UV-3100型紫外-可見光分光光度計(jì)，KH22R型高速冷凍離心機(jī)。

(2)硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的制備與純化

①化合物2的合成

在三口燒瓶中，將2.0g 4-叔丁基杯[4]芳烴溶于40mL DCM溶液中，加入1.2mL三乙胺后，0℃滴加P-TsCl的乙腈溶液（2.5g/5mL）。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h后，蒸出大部分溶劑，向殘留物中加入30mL氯仿和1M的稀鹽酸，攪拌10min，加入碳酸氫鈉溶液水洗有機(jī)相至pH為中性，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸出大部分的氯仿，加入甲醇，有白色沉淀生成，過濾，沉淀用甲醇重結(jié)晶，得到2.42g白色粉末，產(chǎn)率為83%，mp176.0～177.4℃；1HNMR（CDCl3，400MHz）δ:7.56（bs，2H，OH），7.22（s，4H，ArH），6.88（b s，8 H，A r H），6.7 2（s，4 H，A r H），4.2 6（d，4H，ArCH2Ar），3.28（d，4H，ArCH2Ar），1.56（s，6H，ArCH3），1.30［s，18H，C（CH3）3］，0.99［s，18H，C（CH3）3］；ESI-MS，m/z:956.32[M+HI+]。

②化合物3的合成

用文獻(xiàn)[5]方法制備NaHSe后，將100mg化合物2溶解于20mL DMF/H2O（V:V=1:1）中，在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入2mL 1mol/L NaHSe，60℃攪拌反應(yīng)36h。反應(yīng)結(jié)束后用DCM萃取反應(yīng)液并保留有機(jī)相，有機(jī)相再依次用水和飽和食鹽水萃取，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸干，得淡黃色油狀物83mg，產(chǎn)品進(jìn)一步經(jīng)硅膠柱層析純化，洗脫液為石油醚/乙酸乙酯（V:V=5:1），最終得淡黃色固體57mg，產(chǎn)率72%，mp157.2～158.5℃；1HNMR（CDCl3，400MHz）δ:7.65（bs，2H，OH），7.25（s，4H，ArH），6.75～6.80（s，4H，ArH），4.28（d，4H，ArCH2Ar），3.29（d，4H，ArCH2Ar），1.32［s，18H，C（CH3）3］，0.95［s，18H，C（CH3）3］；ESI-MS，m/z:774.23[M+HI+］。

(3)硒代4-叔丁基杯[4]芳烴GPX活力的測定

我們采用文獻(xiàn)[2]GPX活性的標(biāo)準(zhǔn)測定方法對模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的GPX活性進(jìn)行測定，并將該模擬物的GPX活性分別與天然GPX酶及其他幾種GPX模擬物的GPX活性進(jìn)行比較。其中每分鐘每消耗1μmol/L NADPH所需要模擬物的量定義為一個(gè)GPX酶活力單位。

(4)硒代4-叔丁基杯[4]芳烴抗體外線粒體氧化損傷活性的測定

①建立由Fe2+/Vc誘導(dǎo)的體外牛心線粒體損傷評價(jià)體系。我們首先在體外制備多種不同的由Fe2+/Vc誘導(dǎo)的牛心線粒體損傷評價(jià)體系：在20ml pH7.4的磷酸鉀緩沖溶液中，分別加入氯化鉀（0.125mol/L）、氯化鎂（0.001mol/L）、谷氨酸鈉（0.005mol/L）、谷胱甘肽（1μmol/L）、牛心線粒體（0.5mg/ml）以及不同質(zhì)量濃度的模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴（質(zhì)量濃度分別為0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L），37℃保溫30min，然后分別向各反應(yīng)體系中加入Vc（0.0005mol/L）和FeSO4（12.5μmol/L）試劑誘導(dǎo)線粒體損傷反應(yīng)。其中，不加入Vc和FeSO4誘導(dǎo)的線粒體損傷體系為空白對照組，在加入Vc和FeSO4誘導(dǎo)的線粒體損傷體系中模擬物濃度為0μmol/L的體系為損傷組，模擬物濃度分別為1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L的體系為模擬物抗氧化保護(hù)組。

②損傷線粒體膜膨脹度的測定。分別測定各損傷體系中線粒體膨脹度的變化值，參考文獻(xiàn)[9]。

③丙二醛生成量的測定。分別測定各損傷體系中線粒體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物-丙二醛（MDA）生成量，參考文獻(xiàn)[9]。

④細(xì)胞色素C氧化酶活力值的測定。參考文獻(xiàn)[10]的方法，分別測定各損傷體系中的細(xì)胞色素C氧化酶（CCO）活性值的變化。

2.結(jié)果和討論

(1)硒代4-叔丁基杯[4]芳烴與其他幾種GPX模擬物的活性比較

經(jīng)測定，硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的GPX活力達(dá)到了137.22U/μmol，雖然其GPX活力與天然GPX酶的5780U/umol酶活力值仍有不小的差距，但在與其他已合成的GPX模擬物的活性比較中，硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的GPX活性明顯增強(qiáng)，結(jié)果見表1。

表1 不同GPX模擬物的酶活性比較

(2)硒代4-叔丁基杯[4]芳烴對線粒體氧化損傷的保護(hù)作用

①硒代4-叔丁基杯[4]芳烴可以抑制損傷線粒體外膜的膨脹。線粒體在遭受氧化損傷的過程中，最明顯的變化是其線粒體外膜會(huì)發(fā)生明顯的膨脹現(xiàn)象，從而導(dǎo)致整個(gè)線粒體損傷體系的渾濁度升高，光吸收能力下降。從圖2中我們可以發(fā)現(xiàn)，加入模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴后的線粒體損傷體系保護(hù)組與損傷組相比，其線粒體外膜的膨脹現(xiàn)象明顯減弱，且隨著模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴濃度的增加，其對于損傷線粒體外膜膨脹的抑制作用越來越顯著。在4μmol/L硒代4-叔丁基杯[4]芳烴的保護(hù)組中，20min后，其線粒體外膜膨脹度的增長率僅為損傷組的28%。

圖2 不同濃度硒代4-叔丁基杯[4]芳烴對損傷線粒體膨脹抑制作用的活性比較

②硒代4-叔丁基杯[4]芳烴可以抑制損傷線粒體中丙二醛的生成。在線粒體遭受氧化損傷的過程中，大量線粒體外膜中的脂類物質(zhì)會(huì)發(fā)生明顯的脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，丙二醛（MDA）是線粒體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物。從圖3中我們可以明顯的發(fā)現(xiàn)，加入模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴后的線粒體損傷體系保護(hù)組可以明顯的抑制線粒體中MDA的生成，且保護(hù)組中模擬物的濃度越高，則抑制線粒體中MDA生成的能力越明顯，這也就意味著硒代4-叔丁基杯[4]芳烴可以有效的抑制損傷線粒體中脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象的發(fā)生。

圖3 不同濃度硒代4-叔丁基杯[4]芳烴對損傷線粒體MDA生成抑制作用的活性比較

③硒代4-叔丁基杯[4]芳烴可以保護(hù)損傷線粒體中細(xì)胞色素C氧化酶的活性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，我們將沒有加入Vc和FeSO4誘導(dǎo)的線粒體反應(yīng)體系做為空白對照組，定義其CCO酶活力為100%。在此基礎(chǔ)上我們發(fā)現(xiàn)，損傷組中線粒體CCO酶活力值隨著損傷時(shí)間的延長，其CCO活力下降非常明顯，60min后其CCO活力僅為空白對照組的43%。而相應(yīng)的，在加入模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴后的線粒體損傷體系保護(hù)組中我們可以發(fā)現(xiàn)，不同濃度的模擬物都可以對損傷線粒體中CCO活力值的降低起到一定的抑制作用，且模擬物濃度越高，則其對線粒體CCO活力的保護(hù)作用越明顯。

圖4 不同濃度硒代4-叔丁基杯[4]芳烴對損傷線粒體CCO活力保護(hù)作用的活性比較

3.結(jié)論

我們基于4-叔丁基杯[4]芳烴的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在其具有GPX底物結(jié)合部位所需的疏水腔結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，以其結(jié)構(gòu)下緣苯酚單元中的-OH基團(tuán)為修飾靶點(diǎn)，將GPX酶關(guān)鍵催化基團(tuán)-金屬硒（-Se）基團(tuán)引入到其結(jié)構(gòu)中，首次合成了一種新的GPX模擬物-硒代4-叔丁基杯[4]芳烴，目前該模擬物結(jié)構(gòu)還未見其他文獻(xiàn)報(bào)道。按照標(biāo)準(zhǔn)的Wilson酶活力測定方法，我們測定該模擬物的GPX抗氧化活性達(dá)到了137.22U/μmol，與目前已合成的幾種GPX模擬物相比，其GPX活性得到了比較明顯的提高。同時(shí)，在該模擬物體外抗氧化活性的評價(jià)實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴對于由Vc/FeSO4誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷現(xiàn)象具有明顯的抑制作用。其能夠有效的減少損傷線粒體外膜的膨脹破裂現(xiàn)象，抑制損傷線粒體中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的累積，并維持損傷線粒體中CCO酶活力的穩(wěn)定。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都充分表明，模擬物硒代4-叔丁基杯[4]芳烴具有良好的GPX抗氧化生物學(xué)活性。