載鋅凹凸棒石對(duì)犬免疫、抗氧化和抗運(yùn)輸應(yīng)激能力的影響

羅有文 鄭 丹 曹 斌 袁華根 曹 云 李 雪

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州225300；2.南京師范大學(xué)泰州學(xué)院，泰州225300)

應(yīng)激是機(jī)體對(duì)外界或內(nèi)部的各種刺激所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答的總和[1]。運(yùn)輸應(yīng)激是動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激的重要因素，據(jù)報(bào)道，運(yùn)輸會(huì)降低動(dòng)物的抗氧化能力，抑制免疫系統(tǒng)，引起機(jī)體代謝產(chǎn)生變化[2-4]，甚至導(dǎo)致動(dòng)物組織器官受到嚴(yán)重?fù)p傷[5-6]，并影響應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因如B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、熱休克蛋白(HSP)的表達(dá)[7-8]，對(duì)犬血液生化指標(biāo)和皮質(zhì)醇含量均有明顯影響[9]。運(yùn)輸應(yīng)激受許多因素的影響，如溫度、噪聲、飼養(yǎng)密度、運(yùn)輸距離、身體接觸等[10]。目前，維生素、氨基酸、生物多糖、電解質(zhì)及礦物元素等可應(yīng)用于飼糧或飼料添加劑中，以降低動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)其抗應(yīng)激能力[11]。

鋅是犬的必需微量礦物元素之一，在犬的生理代謝中起著重要的作用，如參與細(xì)胞分裂、有機(jī)物代謝，刺激免疫器官發(fā)育，維持免疫功能發(fā)揮等[12]。鋅也是體內(nèi)許多酶的成分和激活劑，參與體內(nèi)小分子蛋白如生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子、受體、細(xì)胞因子等的生成，并維持動(dòng)物的正?？寡趸到y(tǒng)[13]。鋅對(duì)犬的生長(zhǎng)、免疫、抗氧化和腸道菌群有明顯的影響[9,14]。長(zhǎng)期以來，為提高生產(chǎn)性能，動(dòng)物飼糧中一般會(huì)添加較高劑量的鋅[15]，未被利用的鋅隨糞尿排出體外。犬飼糧中一般以硫酸鋅(ZnSO4)的形式滿足犬對(duì)鋅的需要，研究發(fā)現(xiàn)，鋅、銅的生物學(xué)利用率主要受添加物形式等因素的影響[16]，螯合鋅或有機(jī)鋅可以改善動(dòng)物健康狀況，提高鋅的利用率[17]，減少糞便中鋅的排泄[18-19]，降低運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)[20]。氨基酸鋅可以提高犬對(duì)飼糧中干物質(zhì)的表觀消化率，改善犬的生長(zhǎng)性能[21]、被毛品質(zhì)和免疫功能等[22]。

凹凸棒石黏土(Pal，簡(jiǎn)稱凹土)是一種由八面體層狀鎂鋁硅酸鹽組成的纖維狀非金屬黏土礦，具有納米通道結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中包含水和可交換離子[23]，由于特殊的納米顯微結(jié)構(gòu)而具有較大的比表面積，表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附性和離子交換性，常作為微量營(yíng)養(yǎng)素或藥物緩釋劑的載體[24-25]。載鋅凹凸棒石黏土(Zn-Pal，簡(jiǎn)稱載鋅凹土)可以通過離子交換法進(jìn)行制備。研究發(fā)現(xiàn)，用離子交換法制得的Zn-Pal可以提高肉雞肝臟、肌肉中抗氧化酶活性和血清免疫功能，并可作為飼糧中鋅的良好來源[24,26]。然后，飼糧Zn-Pal對(duì)犬的抗氧化、抗應(yīng)激作用以及犬對(duì)Zn-Pal的利用率是否優(yōu)于ZnSO4卻鮮見報(bào)道。目前對(duì)抗運(yùn)輸應(yīng)激的研究基本停留在豬、雞、魚等動(dòng)物上，對(duì)犬的研究較少。近年來，為滿足犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、伴侶動(dòng)物的需要，運(yùn)輸已成為不可或缺的一部分。本試驗(yàn)以比格犬(Beagle dogs)為試驗(yàn)對(duì)象，探討Zn-Pal對(duì)犬免疫、抗氧化和抗運(yùn)輸應(yīng)激能力的影響，以期為Zn-Pal作為犬飼糧鋅來源提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用凹凸棒石黏土由江蘇某生物科技股份有限公司提供。Zn-Pal參照Zhang等[27]方法進(jìn)行制備，制備后的Zn-Pal經(jīng)硝酸(HNO3)溶解處理后用等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，Xseries 2)測(cè)定鋅負(fù)載量。經(jīng)測(cè)定，Zn-Pal中所負(fù)載的鋅量為23.57 mg/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與基礎(chǔ)飼糧

選取10月齡健康比格犬20只，公母各占1/2，體重相近，隨機(jī)分成4組，每組5只。5組試驗(yàn)犬分別飼喂基礎(chǔ)飼糧+ZnSO4(鋅添加水平為80 mg/kg，對(duì)照組)、基礎(chǔ)飼糧+1.71 g/kg Zn-Pal(鋅添加水平為40 mg/kg，Zn-Pal-40組)、基礎(chǔ)飼糧+2.55 g/kg Zn-Pal(鋅添加水平為60 mg/kg，Zn-Pal-60組)、基礎(chǔ)飼糧+3.42 g/kg Zn-Pal(鋅添加水平為80 mg/kg，Zn-Pal-80組)。比格犬購(gòu)于揚(yáng)州四方實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2012—0029?；A(chǔ)飼糧參照美國(guó)AAFCO(2016)犬營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。飼養(yǎng)期包含預(yù)試期7 d、正試期30 d，于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

所有試驗(yàn)犬單籠飼養(yǎng)于試驗(yàn)房?jī)?nèi)，免疫齊全。預(yù)試期內(nèi)測(cè)試試驗(yàn)犬在5 min內(nèi)的自由采食量以確定正試期的飼喂量。每天09:00時(shí)和16:00時(shí)給料飼喂，每次每只給料200 g，30 min后收集剩料，稱重，日均采食量270 g/只；自由飲水，日均飲水量1 320 mL/只。

1.4 運(yùn)輸試驗(yàn)

在飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)犬單只圈于犬籠中，以約60 km/h的速度運(yùn)輸2 h。運(yùn)輸期間試驗(yàn)犬禁止喂食和飲水。

1.5 樣品采集

于飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)運(yùn)輸前對(duì)試驗(yàn)犬前肢靜脈留置針采血，采集血液約8 mL于離心管中，而后4 500 r/min離心10 min，用微量移液器轉(zhuǎn)移分離血清并至-20 ℃冰箱保存待測(cè)。運(yùn)輸結(jié)束后，對(duì)試驗(yàn)犬前肢靜脈留置針采血于潔凈離心管，4 500 r/min離心10 min分離血清，-20 ℃保存待測(cè)。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 血清免疫相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

血清溶菌酶活性參考Yin等[28]的方法進(jìn)行測(cè)定，血清免疫球蛋白G(IgG)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測(cè)定。

1.6.2 血清抗氧化相關(guān)指標(biāo)和急性期反應(yīng)物含量的測(cè)定

血清總抗氧化力(T-AOC)及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)、葡萄糖(GLU)含量使用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。血清皮質(zhì)醇、熱休克蛋白70(HSP70)含量使用ELISA試劑盒測(cè)定，試劑盒均購(gòu)自南京奧青生物技術(shù)有限公司，試驗(yàn)操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Excel 2021后采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)樣本平均值進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法對(duì)組間差異進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zn-Pal對(duì)犬血清免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

由表2可知，運(yùn)輸應(yīng)激前，Zn-Pal-80組血清溶菌酶活性與對(duì)照組相比有所提高(P>0.05)；Zn-Pal-80組血清IgG含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；Zn-Pal-60組和Zn-Pal-80組血清IL-6含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；各組血清TNF-α含量無顯著差異(P>0.05)。運(yùn)輸應(yīng)激后，Zn-Pal-80組血清溶菌酶活性、IL-6含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 Zn-Pal對(duì)犬血清免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

2.2 Zn-Pal對(duì)犬血清抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

表3所示，運(yùn)輸應(yīng)激前，Zn-Pal-80組血清T-AOC和T-SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；Zn-Pal-60組和Zn-Pal-80組血清MDA含量較對(duì)照組有所降低(P>0.05)；各組血清GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)。運(yùn)輸應(yīng)激后，與對(duì)照組相比，Zn-Pal-80組血清T-SOD活性顯著升高(P<0.05)，血清MDA含量顯著降低(P<0.05)；Zn-Pal-60組血清T-SOD活性和MDA含量分別升高和降低(P>0.05)；各組血清T-AOC、GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)。

表3 Zn-Pal對(duì)犬血清抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

2.3 Zn-Pal對(duì)犬血清急性期反應(yīng)物含量的影響

由表4可知，運(yùn)輸應(yīng)激前，Zn-Pal-60組和Zn-Pal-80組血清皮質(zhì)醇含量與對(duì)照組相比有所降低(P>0.05)。運(yùn)輸應(yīng)激后，Zn-Pal-60組和Zn-Pal-80組血清皮質(zhì)醇含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，Zn-Pal-80組血清HSP70含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 Zn-Pal對(duì)犬血清急性期反應(yīng)物含量的影響

3 討 論

3.1 Zn-Pal對(duì)犬免疫能力的影響

動(dòng)物通過機(jī)體免疫系統(tǒng)抵抗細(xì)菌、病原菌、運(yùn)輸應(yīng)激等不良因素，血清免疫是機(jī)體體液免疫的重要部分。溶菌酶是一種堿性蛋白，是吞噬細(xì)胞吞噬病原菌的物質(zhì)基礎(chǔ)[29]。IgG是血清和細(xì)胞外液中含量最高的免疫球蛋白，是血清主要的免疫指標(biāo)。IL-6在免疫應(yīng)答中能促進(jìn)肝細(xì)胞產(chǎn)生急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體對(duì)局部感染的防御能力[30]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸應(yīng)激前，飼糧添加40 mg/kg的Zn-Pal會(huì)降低犬血清IgG、IL-6含量，而添加80 mg/kg的Zn-Pal可以顯著提高犬血清IgG含量，添加60、80 mg/kg的Zn-Pal可以顯著提高犬血清IL-6含量，提示飼糧添加一定量的Zn-Pal能夠提高犬的免疫能力。這與在肉雞上所得結(jié)果相似，研究表明，似糧添加Zn-Pal能提高肉雞血清IL-6等免疫指標(biāo)的含量[31]。Zhang等[20]在團(tuán)頭魴上的試驗(yàn)也表明飼料添加90 mg/kg的Zn-Pal可以提高免疫功能。此外，也有報(bào)道顯示，氨基酸鋅可以提高貴賓犬的免疫功能[22]。本試驗(yàn)中，運(yùn)輸應(yīng)激后，與對(duì)照組相比，飼糧添加80 mg/kg的Zn-Pal可以顯著提高犬血清溶菌酶活性和IL-6含量，提示在鋅添加水平一致(80 mg/kg)的情況下Zn-Pal可以緩解運(yùn)輸對(duì)犬造成的應(yīng)激反應(yīng)，且效果優(yōu)于ZnSO4。這可能是由于凹凸棒石黏土的吸附和緩釋功能改善了鋅在犬腸道內(nèi)的釋放過程，促進(jìn)了犬對(duì)鋅離子的吸收和利用，提高了鋅的利用率，從而改善了犬的免疫能力。

3.2 Zn-Pal對(duì)犬抗氧化能力的影響

正常情況下，健康動(dòng)物機(jī)體氧自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[32]。動(dòng)物生存生長(zhǎng)過程中的不良因素如運(yùn)輸、高溫、寒冷等可使動(dòng)物體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生大量的羥基自由基，破壞動(dòng)物體內(nèi)自由基的平衡狀態(tài)。超氧化物歧化酶(SOD)是動(dòng)物酶促抗氧化體系的重要氧化酶，能有效清除自由基，有助于減少和阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[33]。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，可含量的高低反映氧化損傷的程度。本試驗(yàn)中，運(yùn)輸應(yīng)激前，飼糧添加80 mg/kg的Zn-Pal時(shí)犬血清T-SOD活性顯著高于對(duì)照組。鋅是體內(nèi)許多酶和激素的組成成分和激活劑，也是體內(nèi)抗氧化酶如銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的重要組成成分，在Cu/Zn-SOD的合成和代謝過程中具有重要作用。Zn-Pal能提高犬血清T-SOD活性可能是通過提高Cu/Zn-SOD活性來實(shí)現(xiàn)的。已有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加富鋅益生菌后能顯著提高犬血清SOD活性和T-AOC[34]。運(yùn)輸應(yīng)激后，Zn-Pal-80組犬血清T-SOD活性顯著高于對(duì)照組，血清MDA含量顯著低于對(duì)照組。這可能是由于在運(yùn)輸應(yīng)激條件下，抗氧化酶系統(tǒng)被激活以清除血液中由運(yùn)輸應(yīng)激引起的自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，上述結(jié)果提示，Zn-Pal具有提高犬的抗氧化能力和清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的能力，可以緩解運(yùn)輸對(duì)犬造成的應(yīng)激，添加效果以鋅水平為80 mg/kg為佳。Yang等[35]報(bào)道，Zn-Pal可以提高21日齡肉雞血清抗氧化能力，降低血清MDA含量，與本試驗(yàn)結(jié)果類似。

3.3 Zn-Pal對(duì)犬抗運(yùn)輸應(yīng)激能力的影響

動(dòng)物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引起體內(nèi)糖皮質(zhì)激素含量的升高[36]。皮質(zhì)醇是重要的糖皮質(zhì)激素，是機(jī)體遭受外界環(huán)境刺激時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)。血液中的葡萄糖含量與皮質(zhì)醇的分泌密切相關(guān)，是應(yīng)激反應(yīng)的二級(jí)產(chǎn)物。犬受冰水環(huán)境刺激后，血液皮質(zhì)醇含量顯著升高[37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在運(yùn)輸條件下，犬血清皮質(zhì)醇含量明顯升高，提示犬發(fā)生了運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)。本試驗(yàn)中，運(yùn)輸應(yīng)激前，飼糧添加80 mg/kg的Zn-Pal具有降低血清皮質(zhì)醇和葡萄糖含量的趨勢(shì)，提示飼糧添加Zn-Pal能夠改善犬抗應(yīng)激能力。這可能是由Zn-Pal具有提高機(jī)體抗氧化能力和免疫能力的作用，從而提高了犬的抗應(yīng)激能力。運(yùn)輸應(yīng)激后，與對(duì)照組相比，飼糧添加80 mg/kg的Zn-Pal能顯著降低犬血清皮質(zhì)醇、HSP70含量，提示飼糧添加80 mg/kg的Zn-Pal能夠有效緩解犬的運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)，表明Zn-Pal作為一種鋅源添加劑應(yīng)用于犬飼糧中有良好的緩解運(yùn)輸應(yīng)激作用。這可能是因?yàn)榘纪拱羰ね恋奈胶途忈屝钥梢愿纳芞n-Pal中鋅的釋放過程，提高了鋅的利用率，從而使鋅能更有效地發(fā)揮其生理作用，包括鋅對(duì)激素、小分子蛋白代謝的有益作用等。據(jù)報(bào)道，Zn-Pal可以降低團(tuán)頭魴在運(yùn)輸條件下肝胰腺熱休克蛋白90(HSP90)基因表達(dá)水平，緩解運(yùn)輸產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)[20]。這與本試驗(yàn)中飼糧添加Zn-Pal可以提高犬的抗運(yùn)輸應(yīng)激能力結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

綜上所述，Zn-Pal可以提高犬的免疫和抗氧化能力，緩解犬的運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)犬的抗運(yùn)輸應(yīng)激能力，以鋅添加水平為80 mg/kg時(shí)效果較好；在相同鋅添加水平(80 mg/kg)的情況下，Zn-Pal在犬上的抗氧化和抗應(yīng)激效果優(yōu)于ZnSO4，Zn-Pal可以作為一種鋅源應(yīng)用于犬飼糧中。