lncRNA NEAT1與消化系統(tǒng)惡性腫瘤預(yù)后及臨床病理特征關(guān)系的Meta分析

樂奇，呂坤，朱俊亞，姜雷，姚南，王軍

（1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 普通外科，甘肅 蘭州 730000）

近年來，在各類癌癥中，消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病人群逐漸年輕化，患病例數(shù)和病死例數(shù)連年攀升，這已然成為嚴(yán)重威脅著人類的健康生存的重要疾病[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，2020年全球消化系統(tǒng)惡性腫瘤新增病例超過500萬，新增死亡例數(shù)約占腫瘤相關(guān)死亡的36.5%，其中結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌的病死率位居前5位[3]。由于消化系統(tǒng)惡性腫瘤是一類分子和表型高度異質(zhì)的疾病，早期癥狀不明顯且缺少可靠的生物標(biāo)志物，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已進(jìn)展至晚期階段，甚至發(fā)生遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移[4]。然而，盡管包括手術(shù)、放化療、靶向治療及免疫治療在內(nèi)的惡性腫瘤治療模式研究取得了很大進(jìn)展，但治療晚期癌癥的方法仍有一定的局限性，最終導(dǎo)致患者預(yù)后差、病死率不斷上升[5]。因此，識別潛在有效的腫瘤標(biāo)志物以協(xié)助腫瘤的早期診斷、治療和評估預(yù)后至關(guān)重要。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）長度超過200 nt，具有類似mRNA的結(jié)構(gòu)，但無蛋白質(zhì)編碼功能[6]。lncRNA被認(rèn)為是生物學(xué)過程的重要調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄程序、表觀遺傳修飾、介導(dǎo)蛋白和RNA穩(wěn)定性、翻譯和翻譯后修飾等重要生理過程[7]。隨著RNA測序技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，大量研究[8-9]發(fā)現(xiàn)lncRNA也參與癌癥的異常調(diào)控。核富集轉(zhuǎn)錄本 1 （nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1）是由Hutchinson等[10]于2007年發(fā)現(xiàn)的一種新型lncRNA，由3 729個核苷酸組成，位于腫瘤綜合征多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤的11號染色體基因座上，其與PSP1、p54nrb和SFPQ等蛋白結(jié)合，共同維系核旁斑的形態(tài)和功能。lncRNA NEAT1主要在卵巢、前列腺、結(jié)腸、胰腺等組織中表達(dá)[11]，主要參與黃體和乳腺發(fā)育、表觀遺傳調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)及免疫應(yīng)答等生理過程[12-13]。近年來，大量研究[14-15]發(fā)現(xiàn)NEAT1在多種實體腫瘤中表達(dá)失調(diào)，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥，與腫瘤患者不良預(yù)后有關(guān)。顯然，NEAT1可能是癌癥重要的潛在生物標(biāo)志物及臨床治療靶點(diǎn)。然而，在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中NEAT1表達(dá)水平與預(yù)后及臨床病理特征的關(guān)系仍不明確，且部分研究結(jié)果相互矛盾。如Li等[16]發(fā)現(xiàn)NEAT1高表達(dá)是結(jié)直腸癌預(yù)后的不良因素，Yu等[17]和Zhang等[18]通過多變量分析結(jié)直腸癌中NEAT1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，但結(jié)果提示無統(tǒng)計學(xué)意義。同樣，對于臨床病理學(xué)特征如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度與NEAT1表達(dá)之間的相關(guān)性也存在爭議[16,19-20]。因此，本文將通過Meta分析研究兩者之間的相關(guān)性，旨在探討NEAT1能否作為消化道惡性腫瘤早期診斷、監(jiān)測病情進(jìn)展及預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 檢索策略

在PubMed、Web of Science、Cochrane Library、中國知網(wǎng)和萬方等數(shù)據(jù)庫全面檢索已發(fā)表的文獻(xiàn)，檢索時間為自建庫起至2021年10月18日。采用主題詞與自由詞相結(jié)合的方式，英文檢索詞包括：LncRNA、Cancer、Tumor、Neoplasm、Carcinoma、Esophageal、 Stomach、 Gastric、 Pancreatic、Hepatoma、 Liver、 Gallbladder、 Cholangiocellular、Colon、Rectal、Colorectal、Gastrointestinal、NEAT1、Nuclear Paraspeckle Assembly transcript 1；中文檢索詞包括：長鏈非編碼RNA、lncRNA、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)直腸癌、核富集轉(zhuǎn)錄本1、NEAT1。主動檢索所選文章的參考文獻(xiàn)。利用Endnote X9軟件對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分組管理。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 研究類型：隊列研究；⑵ 研究對象：經(jīng)病理學(xué)明確診斷為消化系統(tǒng)惡性腫瘤，納入文獻(xiàn)均不受語種限制；⑶ 探討lncRNA NEAT1與消化系統(tǒng)惡性腫瘤預(yù)后或臨床病理特征之間關(guān)系的研究；⑷ 文中給出風(fēng)險比（hazard ratio，HR）及其95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），或可通過充足的信息計算獲得；⑸ lncRNA NEAT1的表達(dá)水平區(qū)分高低表達(dá)。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 體外實驗或動物實驗研究；⑵ 非原始研究，如綜述、Meta分析及會議摘要；⑶ 重復(fù)發(fā)表的研究；⑷ 無數(shù)據(jù)或數(shù)據(jù)不足的研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取

由2名作者對納入文獻(xiàn)獨(dú)立提取數(shù)據(jù)，并進(jìn)行交叉核驗，第3名作者與前2名作者共同討論有爭議的研究。需提取信息主要包括：第一作者、出版年份、國家、腫瘤類型、標(biāo)本類型、檢測方法、樣本量、NEAT1高表達(dá)率、截取值、結(jié)局指標(biāo)、隨訪時間以及臨床病理特征（包括年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、臨床分期、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）。預(yù)后結(jié)局指標(biāo)效應(yīng)量（HR和95%CI）可從文中直接提取或間接運(yùn)用Engauge Digitizer 12.1軟件從生存曲線上計算獲得。臨床病理特征的效應(yīng)量比值比（odds ratio，OR）直接通過文獻(xiàn)所給高低表達(dá)例數(shù)計算提取。

1.4 文獻(xiàn)質(zhì)量評價

由2名作者根據(jù)紐卡斯?fàn)?渥太華量表（the Newcastle-Ottawa scale，NOS）對納入的文獻(xiàn)進(jìn)行獨(dú)立評價。評價內(nèi)容主要包括研究對象選擇、組間可比性和暴露因素測量。最高評分為9分，≥6分可視為高質(zhì)量研究。若有分歧時，再次進(jìn)行組內(nèi)討論確定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用HR及95%CI來評價NEAT1對消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者預(yù)后的影響，評估指標(biāo)為總體生存率（overall survival，OS）和無病生存率（diseasefree survival，DFS）合并OR和95%CI用于評估NEAT1表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。納入研究的異質(zhì)性通過CochranQ檢驗完成，統(tǒng)計量I2的大小評價異質(zhì)性的高低。當(dāng)I2＞50%時，提示各研究間存在高度異質(zhì)性，此時采用隨機(jī)效應(yīng)模型；反之，采用固定效應(yīng)模型。Begg檢驗用于檢測有無發(fā)表偏倚。所有統(tǒng)計學(xué)分析過程均通過Stata 12.0軟件完成，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

經(jīng)初步檢索共獲得文獻(xiàn)361篇。通過圖1中文獻(xiàn)檢索流程過程共排除341篇文獻(xiàn)，最終納入20篇文獻(xiàn)。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖Figure 1 Literature screening process

2.2 納入文獻(xiàn)的基本情況

最終共20篇文獻(xiàn)[16-35]有充足的數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析，共2 031例經(jīng)病理學(xué)明確診斷為消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者，涉及食管癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌5種腫瘤類型，納入文獻(xiàn)的發(fā)表時間為2015—2021年，各研究的樣本量從33例到239例不等，檢測方法均為qRT-PCR。共有16項研究[16-22,24-31,34]評估了NEAT1高低表達(dá)與OS之間的關(guān)系，有5項研究[16,18,22,25,31]探索了NEAT1高低表達(dá)與DFS之間的關(guān)系，有19項[16-33,35]提供了臨床病理參數(shù)信息。各研究NOS評分均≥6分，納入文獻(xiàn)具體基本特征見表1。

表1 納入文獻(xiàn)的基本特征Table 1 The general characteristics of included studies

表1 納入文獻(xiàn)的基本特征（續(xù)）Table 1 The general characteristics of included studies (continued)

2.3 Meta分析結(jié)果

2.3.1 消化系統(tǒng)惡性腫瘤中NEAT1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 16項研究[16-22,24-31,34]用于分析NEAT1表達(dá)與OS的關(guān)系。異質(zhì)性分析提示各研究間存在高度異質(zhì)性（I2=71.0%，P＜0.001），故選用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行定量分析。Meta分析結(jié)果提示（圖2A），在消化系統(tǒng)腫瘤中NEAT1高表達(dá)患者的OS低于NEAT1低或不表達(dá)患者（HR=1.66，95%CI=1.41～1.97），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。5項研究[16,18,22,25,31]探討了NEAT1高低表達(dá)與DFS的關(guān)系，異質(zhì)性分析提示各研究間異質(zhì)性較低（I2=0%，P=0.488），故選擇固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析。其結(jié)果表明（圖2B），NEAT1高表達(dá)與消化系統(tǒng)腫瘤患者的DFS降低（HR=2.0，95%CI=1.51～2.65，P＜0.001）。通過亞組分析來探究本研究的異質(zhì)性，存在的異質(zhì)性來源可能是隨訪時間、樣本量、截取值及生存分析方法等因素。亞組分析結(jié)果表明（表2），不同的生存分析方法（單因素或多因素分析）及NEAT1高低表達(dá)截取值（中位值或其他）、樣本量的多少（樣本量≥60例或樣本量＜60例）和隨訪時間的長短（隨訪時間≥60個月或隨訪時間＜60個月）進(jìn)行分類合并分析的結(jié)果均顯示，NEAT1高表達(dá)與OS降低有關(guān)（P＜0.05）。

表2 亞組分析結(jié)果Table 2 The results of subgroup analysis

圖2 NEAT1表達(dá)水平與消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者預(yù)后關(guān)系的森林圖 A：OS；B：DFSFigure 2 Forest plots of the association between NEAT1 expression and prognosis of patients with digestive system neoplasms A: OS; B: DFS

2.3.2 消化系統(tǒng)惡性腫瘤中NEAT1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 19篇文獻(xiàn)[16-33,35]提供了有效的臨床病理特征信息，并進(jìn)行定量分析。統(tǒng)計結(jié)果顯示：NEAT1表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤分化程度及脈管浸潤無關(guān)（均P＞0.05）；NEAT1高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑及臨床分期明顯有關(guān)（均P＜0.05）。通過合并OR可知，NEAT1高表達(dá)預(yù)示著更大的腫瘤直徑（OR=2.20, 95%CI=1.73～2.79，P＜0.001）、更差的臨床分期（OR=3.10，95%CI=1.95～4.92，P＜0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（OR=1.94，95%CI=1.30～2.90，P=0.001）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（OR=2.58，95%CI=1.88～3.54，P＜0.001）的可能性更大（表3）。

表3 消化系統(tǒng)惡性腫瘤NEAT1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Table 3 The relationship between the expression level of NEAT1 and clinicopathologic features in digestive system neoplasms

2.4 敏感度分析及發(fā)表偏倚評估

通過Stata軟件對結(jié)局指標(biāo)OS結(jié)果進(jìn)行敏感度分析，結(jié)果顯示，逐篇去除單項研究后合并的統(tǒng)計效應(yīng)量無明顯改變，提示本研究結(jié)果穩(wěn)定性良好（圖3A）。Begg漏斗圖用于評估納入文獻(xiàn)的發(fā)表偏倚，結(jié)果提示存在發(fā)表偏倚（圖3B）。我們通過剪補(bǔ)法對漏斗圖進(jìn)行修補(bǔ)（圖3C），修補(bǔ)后的結(jié)果仍具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），其HR=1.57，95%CI=1.34～1.85，這說明本研究結(jié)果可信。此外，還評估了DFS結(jié)果的發(fā)表偏倚，發(fā)現(xiàn)漏斗圖基本對稱，提示無明顯發(fā)表偏倚（圖3D）。

圖3 敏感度分析及發(fā)表偏倚評估 A：OS的敏感度分析；B：OS的Begg漏斗圖；C：OS的修補(bǔ)圖；D：DFS的漏斗圖Figure 3 Sensitivity analysis and assessment of publication bias A: Sensitivity analysis of OS; B: Begg funnel plot of OS;C: Filled funnel plot of OS; D: Funnel plot of DFS

3 討 論

越來越多的研究[36-37]表明lncRNA參與腫瘤相關(guān)的各種生物學(xué)過程，如抗腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤增殖、誘導(dǎo)血管生成、逃避腫瘤抑制等。顯然，lncRNA已經(jīng)成為細(xì)胞生理活動和疾病病理過程調(diào)控的重要角色。NEAT1是lncRNA中最常見的促癌基因之一，其表達(dá)異?？纱偈鼓[瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性，有利于腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等[37]。此前，已有研究[38]分析了NEAT1與消化道腫瘤患者預(yù)后關(guān)系，然而該研究存在較多局限性。具體表現(xiàn)在：第一，檢索范圍不全面，未檢索國內(nèi)數(shù)據(jù)庫發(fā)表的相關(guān)研究，郭輝等[26]、嚴(yán)華等[27]和張敬偉等[31]發(fā)表的文章并未納入；其次，未納入Zhang等[18]在2018年和Jiang等[32]及Ma等[33]在2020年發(fā)表的英文原始研究，并且檢索時間只到2020年，而近幾年關(guān)于NEAT1與消化系統(tǒng)腫瘤患者預(yù)后關(guān)系出現(xiàn)新的原始研究。本Meta分析進(jìn)一步改進(jìn)研究設(shè)計和檢索策略，全面納入高質(zhì)量的相關(guān)原始研究，以提高結(jié)論的真實性與可靠性。

本Meta分析共納入20篇隊列研究，包括2 031例患者，探究了NEAT1在消化系統(tǒng)惡性腫瘤預(yù)后中的作用。Meta分析結(jié)果表明：NEAT1高表達(dá)與消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者OS和DFS降低顯著相關(guān)。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)NEAT1參與多種癌癥相關(guān)通路，進(jìn)一步深入探討NEAT1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，其中與Akt、Wnt及p53信號通路作用最為密切[12,39]。在結(jié)直腸癌中，NEAT1通過與DDX5結(jié)合，激活Wnt/β-catenin信號通路，并以DDX5介導(dǎo)的方式實現(xiàn)其致癌功能[18]。此外，在胃癌中NEAT1還可以通過調(diào)節(jié)miR-1249和AKT1的表達(dá)，繼而激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[40]。通常，NEAT1在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)并作為一種競爭性內(nèi)源性RNA，下調(diào)其下游miRNA水平，導(dǎo)致miRNA對致癌靶基因的抑制作用降低，最終促進(jìn)了癌變[11]。如NEAT1在體內(nèi)通過調(diào)節(jié)miR-302a-3p/RELA信號軸促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展，NEAT1作為miR-302a-3p的競爭性內(nèi)源性RNA，負(fù)調(diào)節(jié)miR-302a-3p表達(dá)水平，導(dǎo)致靶基因RELA表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)胰腺癌增殖和遷移[24]。還有研究表明，NEAT1能夠抑制腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感度。如NEAT1通過負(fù)調(diào)節(jié)miR-335表達(dá)，降低對cMet-Akt通路的抑制作用，并激活該通路來引起肝癌細(xì)胞對索拉菲尼產(chǎn)生耐藥性[41]。吉西他濱和順鉑是膽管細(xì)胞癌的一線化療藥物，Parasramka等[42]發(fā)現(xiàn)BAP1可以上調(diào)膽管細(xì)胞癌中NEAT1的表達(dá)，而NEAT1也可反饋調(diào)節(jié)BAP1的表達(dá)，兩者共同介導(dǎo)降低膽管細(xì)胞癌對吉西他濱的敏感度。這些研究結(jié)果均表明，NEAT1可能是消化系統(tǒng)惡性腫瘤的不良預(yù)后的指標(biāo)，這與本研究的結(jié)果一致。

本Meta分析的部分結(jié)果存在統(tǒng)計異質(zhì)性，根據(jù)生存分析方法、NEAT1高低表達(dá)截取值、樣本量和隨訪時間進(jìn)行亞組分析，結(jié)果顯示NEAT1高表達(dá)均與降低的OS相關(guān)。然而，本研究未能探究所有的異質(zhì)性，在樣本量≥60例、隨訪時間≥60個月、多因素分析和NEAT1中位表達(dá)截取值分組中仍存在較高的異質(zhì)性。本研究通過Begg檢驗發(fā)現(xiàn)OS結(jié)果存在發(fā)表偏倚。我們進(jìn)一步采用剪補(bǔ)法對漏斗圖進(jìn)行修補(bǔ)，修補(bǔ)后的結(jié)果仍具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明OS的結(jié)果可信。究其原因，從修補(bǔ)圖中發(fā)現(xiàn)部分陰性結(jié)果未發(fā)表，可能導(dǎo)致了發(fā)表偏倚。

腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移節(jié)點(diǎn)數(shù)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是決定腫瘤分期及評估患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。隨后，本研究進(jìn)一步評估了NEAT1表達(dá)與消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果表明NEAT1高表達(dá)與腫瘤直徑、臨床分期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示NEAT1高表達(dá)與消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者不良預(yù)后密切相關(guān)。而年齡、性別、腫瘤分化程度及脈管浸潤與NEAT1表達(dá)無明顯相關(guān)性。其中，因各納入文獻(xiàn)中的年齡和腫瘤直徑的大小分界不統(tǒng)一，本研究設(shè)定年老/年輕、腫瘤直徑大/小作為分組標(biāo)準(zhǔn)，而無明確具體數(shù)值分界，這可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本Meta分析也存在一定的不足之處。第一，本研究部分結(jié)果存在一些統(tǒng)計異質(zhì)性；第二，納入文獻(xiàn)的研究地區(qū)均為中國，NEAT1對其他國家消化系統(tǒng)腫瘤患者的預(yù)后價值有待考證；第三，部分原始研究沒有直接給出預(yù)后指標(biāo)數(shù)據(jù)，而是從生存曲線提取獲得，這些數(shù)據(jù)可能造成統(tǒng)計學(xué)偏差；第四，NEAT1表達(dá)水平?jīng)]有明確的截取值；第五，納入文獻(xiàn)樣本質(zhì)量的局限性可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生一定影響。

綜上所述，NEAT1高表達(dá)與消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者的不良預(yù)后及部分臨床病理參數(shù)顯著相關(guān)，對消化道腫瘤病情監(jiān)測及預(yù)后判斷有重要的臨床價值。未來仍需納入更高質(zhì)量、更大樣本的研究予以進(jìn)一步驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。