降溫刺激下雙孢蘑菇胞外酶活性、多糖含量及單糖組成的變化規(guī)律*

應(yīng)學(xué)兵，陸 娜，林佳瑤

（1.杭州市臨安區(qū)農(nóng)林技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 311300；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）在分類上屬于真菌門（Fungi）擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）蘑菇屬（Agaricus）[1]，是世界上栽培最廣泛、消費(fèi)量最高的食用菌之一[2]。雙孢蘑菇屬于穩(wěn)溫結(jié)實(shí)性的菌類，在工廠化栽培的過程中，其菌絲從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長需要進(jìn)行降溫刺激[3]，即在覆土、搔菌結(jié)束后的催蕾期，將環(huán)境溫度從21.5℃勻速降至17.5℃[4]。在自然界中，于較冷的秋季形成子實(shí)體的野生蘑菇，采取降溫處理的目的，即以工廠化生產(chǎn)環(huán)境控制關(guān)鍵裝備模擬自夏季到秋季的氣候轉(zhuǎn)變過程[5]。其次，雙孢蘑菇是對(duì)溫度非常敏感的真菌，0.5℃的溫度差異就會(huì)對(duì)其生長速度、品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)生巨大的影響[4]。因此在催蕾出菇的關(guān)鍵階段，精確降溫期的時(shí)長是提高其生產(chǎn)效率的重要因素。

雙孢蘑菇的生長主要依靠木質(zhì)素、纖維素、半纖維素及淀粉等大分子營養(yǎng)物質(zhì)，需要將大分子碳水化合物、蛋白質(zhì)等物質(zhì)分解為小分子營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行吸收和轉(zhuǎn)化，此過程與菌絲分泌的胞外酶活性緊密相關(guān)[6]，直接決定了子實(shí)體的產(chǎn)量和品質(zhì)[7]。糖類是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸以外的另一類重要生物大分子[8]。雙孢蘑菇多糖具有調(diào)節(jié)免疫[9]、抗氧化[10-11]、防止食品腐敗[12]、促動(dòng)物運(yùn)動(dòng)損傷修復(fù)[13-14]等活性。研究發(fā)現(xiàn)，降溫刺激條件的改變可影響營養(yǎng)菌絲和子實(shí)體細(xì)胞壁的可溶性多糖含量，而多糖中單糖的比例不同，細(xì)胞壁的糖苷鍵和多糖構(gòu)象也不同[15]。因此胞外酶種類和活性的差異、可溶性多糖含量及多糖中單糖比例情況可以作為衡量和決定降溫刺激強(qiáng)度的指標(biāo)[16]。

通過以漆酶、半纖維素酶、羧甲基纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶的活性，可溶性多糖含量，以及單糖結(jié)構(gòu)為測定指標(biāo)，在雙孢蘑菇催蕾期分別在4 d、6 d、8 d三個(gè)不同時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行21.5℃到17.5℃的勻速降溫處理。對(duì)其營養(yǎng)生理?xiàng)l件進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析研究，掌握環(huán)境因素對(duì)其菌絲體及子實(shí)體生長的影響，從而探索雙孢蘑菇菌絲從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)化到子實(shí)體發(fā)生發(fā)育的過程中，內(nèi)在的生長發(fā)育機(jī)制。同時(shí)，結(jié)合蘑菇產(chǎn)量指標(biāo)確定最佳降溫刺激強(qiáng)度，進(jìn)一步完善雙孢蘑菇催蕾技術(shù)，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 雙孢蘑菇催蕾期不同降溫時(shí)長的處理

雙孢蘑菇栽培品種為W192。

培養(yǎng)料配方為麥草53%、雞糞40%、石膏4.4%、花生粕2.5%、尿素0.1%，浙江省嘉善寧遠(yuǎn)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。

覆土材料為純草炭土。

培養(yǎng)料處理方法一致，選取堆料、發(fā)酵、上架及播種時(shí)間一致的出菇房開展試驗(yàn)。在催蕾過程中，選取3間出菇房分別在4 d、6 d、8 d三個(gè)不同時(shí)間段內(nèi)將培養(yǎng)溫度從21.5℃勻速降至17.5℃，二氧化碳及濕度管理保持一致。

1.2 樣品采集

分2個(gè)時(shí)期采收樣品。接種后進(jìn)行降溫催蕾的時(shí)期記為第Ⅰ期；第一潮菇采收后進(jìn)行養(yǎng)菌，再次降溫催蕾的時(shí)期記為第Ⅱ期。隨機(jī)選取不同高度的菇架，每層取3個(gè)點(diǎn)的樣品，共取約200 g，將所有樣品均勻混合后從中取50 g，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 試劑材料

氯仿，南京化學(xué)試劑有限公司；疊氮化鈉，杭州藍(lán)博實(shí)業(yè)有限公司；甲醇、乙腈、三氟乙酸、磷酸二氫鉀、氯化鈉、無水乙醇、正丁醇、氫氧化鈉，成都市科龍化工試劑廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、硼氫化、鈉鹽酸、無水磷酸氫二鈉、D-葡萄糖，成都市科龍化工試劑廠；D-甘露糖、D-半乳糖、L-巖藻糖、D-核糖苯酚、果膠酶，阿拉丁科研試劑公司；0.4 nm分子篩，浙江富陽市杭富生物制品廠；濃硫酸，浙江省蘭溪市靈洞鄉(xiāng)；二甲基亞砜（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；木瓜蛋白酶、牛肉血清蛋白，西格瑪化工試劑有限公司。

1.3.2 試驗(yàn)儀器

HH-2K4恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司；-50℃真空冷凍干燥機(jī)，拉博科科技有限公司；ZHWY-211B恒溫振蕩培養(yǎng)器，上海智城分析儀器制造有限公司；CL31R多功能高速離心機(jī)、APS-2 HYPERSIL色譜柱（5μm，4.0 mm×250 mm）、LCQ DECA XP MAX質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上?？茖W(xué)儀器有限公司；Sartorius BSA224S電子分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；CL-100雙層圓盤電爐，浙江嘉興市楓橋電熱器廠；JK-2200DB數(shù)控超聲波清洗器，合肥金尼克機(jī)械制造有限公司；DEAE-Sepharose Fast Flow纖維素填料，英國沃特曼試劑公司；離子交換層析柱（1.6 cm×10 cm）、Sephacryl S-100凝膠柱（16/60）、AKTA Purifier100層析純化儀，美國通用電氣公司；U-1900可見分光光度計(jì)，日立中國有限公司；SEC色譜柱、Shodex OHpak SB-G保護(hù)柱（SB 803），昭和電工科學(xué)儀器（上海）有限公司；5980型GC-MC氣相色譜，安捷倫科技公司；2300多功能酶標(biāo)儀，珀金埃爾默儀器有限公司；SC-360Y立式透明冷藏箱，青島澳柯瑪股份有限公司。

1.4 胞外酶活性測定方法

1.4.1 樣品制備

不同時(shí)期的菌絲體樣品分別制備發(fā)酵液，經(jīng)2層紗布抽濾后收集發(fā)酵液。于4℃、12 000 r·min-1冷凍離心20 min，上清液即為粗酶液，用于胞外酶活性測定，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 羧甲基纖維素酶活力的測定

取0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液1.5 mL，加入粗酶液0.5 mL，混勻，50℃恒溫水浴30 min；取出后立即加入DNS試劑1.5 mL，煮沸5 min；取出，冷卻后加蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。分光光度計(jì)波長540 nm處測吸光度值，以經(jīng)煮沸滅活的粗酶液為對(duì)照，以蒸餾水為空白對(duì)照，每組測定3次，取平均值。酶活力單位定義：1 mL培養(yǎng)液中的酶與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為一個(gè)活力單位。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密移取1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL于試管中，分別補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL?；靹蚝蠹尤隓NS試劑1.5 mL，沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫后加入蒸餾水定容至20 mL。以蒸餾水為空白對(duì)照，于540 nm處測定吸光度值，每組測定3次，取平均值。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.4.3 半纖維素酶活力的測定

0.5%木聚糖溶液1.5 mL，加入粗酶液0.5 mL，混勻，50℃水浴1 h，之后操作與1.4.2羧甲基纖維素酶活性測定相同。酶活力單位定義：1 mL培養(yǎng)液中的酶與底物作用30 min釋放出1 mg木糖為一個(gè)活力單位。

木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用1 mg·mL-1的木糖標(biāo)準(zhǔn)液，其余過程與1.4.2葡萄糖測定過程相同。以木糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，給制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.4.4 漆酶活力的測定

往試管中加入5 mmol·L-1鄰聯(lián)甲苯胺溶液（用pH 4.6、0.1 mol·L-1的醋酸鹽緩沖液配制）1.9 mL，加入粗酶液0.1 mL，混勻，28℃恒溫水浴30 min；取出后于分光光度計(jì)波長600 nm處檢測吸光度值。對(duì)照為經(jīng)煮沸滅活的粗酶液0.1 mL。酶活力單位定義：1 mL培養(yǎng)液中的酶與底物作用30 min，每分鐘吸光度值改變0.01為一個(gè)活力單位。

1.4.5 蛋白酶活力的測定

10 mL離心管中加入1 mL稀釋粗酶液（使其測定的吸光度值在0.2~0.4為宜），40℃水浴3 min~5 min；加入2%酪蛋白溶液1 mL，40℃保溫準(zhǔn)確計(jì)時(shí)10 min，立即加入0.4 mol·L-1的三氯乙酸2 mL；于40℃水浴15 min后8 000 r·min-1離心1 min；取1 mL上清液，加入0.4 mol·L-1的碳酸鈉溶液5 mL，加入福林-酚試劑1 mL，搖勻，40℃水浴顯色20 min?？瞻自嚬苤邢燃尤?.4 mol·L-1的三氯乙酸2 mL，再加入2%酪蛋白溶液1 mL，40℃水浴15 min后離心，后續(xù)操作與試驗(yàn)管相同。酶活力單位定義：1 mL培養(yǎng)液中的酶催化酷蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為1個(gè)活力單位。

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密移取100μg·mL-1的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL于試管中，分別補(bǔ)蒸餾水至10 mL?；靹蚝笕? mL，加入0.4 mol·L-1碳酸鈉溶液5 mL，福林-酚試劑1 mL，搖勻，40℃水浴顯色20 min，波長為680 nm處檢測吸光度值。以酪氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。1.4.6 淀粉酶活力的測定

往試管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液（用pH 5.8、0.1 mol·L-1的醋酸鹽緩沖液配制）1.5 mL，加粗酶液0.5 mL，混勻，38℃恒溫水浴30 min，之后操作與1.4.2羧甲基纖維素酶活性測定相同。酶活力單位定義：1 mL培養(yǎng)液中的酶與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為一個(gè)活力單位。使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制方法同1.4.2。

1.5 多糖含量測定方法

1.5.1 雙孢蘑菇菌絲前處理

將菌絲去除泥土等雜質(zhì)，水洗后置于50℃真空恒溫干燥箱中烘干，直至2次稱重質(zhì)量基本不變。取出后放入粉碎機(jī)粉碎，備用。

1.5.2 雙孢蘑菇菌絲多糖的制備

稱取一定量的菌絲粉末，設(shè)置3個(gè)平行樣，按料液比為1∶40加入蒸餾水，95℃水浴提取3 h，保持低速攪拌。提取完成后進(jìn)行抽濾，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀55℃、40 r·min-1減壓濃縮，濃縮至1/3體積后，加入4倍體積的95%乙醇，醇沉2 h。4 000 r·min-1離心后棄去上清液，沉淀用95%乙醇洗滌2次后用水復(fù)溶，凍干保存。將樣品溶解于蒸餾水中配制成2%的溶液，用木瓜蛋白酶在pH 6.0、50℃、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%（與樣品的質(zhì)量相比）的條件下進(jìn)行酶解蛋白反應(yīng)2 h，每隔半小時(shí)進(jìn)行攪拌。然后升溫至55℃反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后90℃水浴滅活10 min；6 000 r·min-1離心10 min，取上清液；然后加入1/3體積的Sevag試劑（氯仿與正丁醇的體積比為3∶1）進(jìn)行脫蛋白。在不濺出容器的前提下以最大速度充分振蕩1 h。6 000 r·min-1離心10 min，取上清液繼續(xù)進(jìn)行脫蛋白操作，重復(fù)脫蛋白操作直至無明顯的白色沉淀產(chǎn)生。將上述溶液在55℃條件下減壓濃縮除去殘留有機(jī)溶劑，濃縮至200 mL以下，裝入透析袋（3 500 Da），蒸餾水透析3天后凍干，得到白色絮狀物，即粗多糖[17]。

1.5.3 多糖含量的測定

雙孢蘑菇多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，即多糖在濃硫酸作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成一種橙黃色化合物。在10 mg~100 mg，其顏色深淺與多糖含量成正比，且在490 nm波長下有最大吸收峰，通過測定和計(jì)算得到樣品多糖含量。具體方法如下。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL，分別加水至2.0 mL，漩渦混勻器混勻；加入6%苯酚0.1 mL，用漩渦混勻器混勻；再加5 mL濃硫酸，迅速混勻；室溫放置5 min，然后在沸水浴中保溫15 min；用自來水冷卻5 min，再用漩渦混勻器混勻，于490 nm測吸光度值。以2.0 mL水按同樣顯色操作作為空白對(duì)照。以吸光度值為橫坐標(biāo)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）樣品測定

吸取樣品1.0 mL（V3），加水補(bǔ)充至2 mL，漩渦混勻器混勻后加入6%苯酚0.1 mL，再混勻；加入濃硫酸5 mL，迅速混勻。室溫放置5 min，然后在沸水浴中保溫15 min，用自來水冷卻5 min，再用漩渦混勻器混勻，于波長490 nm處測定吸光度值。根據(jù)吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（V4）。

3）多糖的含量

多糖含量（w，g·100-1g-1）的計(jì)算公式為：

式中：C為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（μg·mL-1）；V1為樣品提取時(shí)定容的體積（mL）；V2為樣品醇沉物溶解時(shí)定容的體積（mL）；V3為取樣的被測樣品的體積（mL），即1 mL；V4為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；m為稱取的樣品質(zhì)量（g）；0.9為葡萄糖和多糖的轉(zhuǎn)換單位系數(shù)。

1.6 單糖組成測定方法

采用氣相色譜（GC）法進(jìn)行多糖中單糖組分的分析和鑒定，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品有D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-巖藻糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖。

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品制備

分別精密稱取0.002 mol·L-1的鼠李糖（Rham）、巖藻糖（Fuc）、木糖（xyl）、阿拉伯糖（Ara）、核糖（Rib）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal），溶于30 mL蒸餾水；取3 mL溶液，加入硼氫化鈉30 mg，密塞，室溫下還原3 h；然后用冰醋酸中和過量的硼氫化鈉，加入少量甲醇，減壓濃縮蒸干；重復(fù)4次~5次，真空條件下以五氧化二磷干燥過夜。再加入醋酸酐4.0 mL，100℃反應(yīng)1 h，然后加入甲苯3.0 mL，減壓蒸干。將乙?；蟮漠a(chǎn)物用氯仿溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗；加入等體積的蒸餾水充分混勻，靜置分層；除去上層水溶液，重復(fù)3次~4次。氯仿層以適量無水硫酸鈉干燥、過濾，定容至10 mL，待GC-MS分析。

1.6.2 多糖樣品衍生化

稱取多糖樣品2.0 mg于薄壁長試管中，再加入2.0 mol·L-1三氟乙酸4.0 mL，封管，110℃水解2 h。水解后，低于40℃溫度下減壓蒸干，再加入甲醇蒸干，重復(fù)操作4次~5次，以完全除去三氟乙酸。

將完全酸水解的樣品溶于約3 mL的蒸餾水中，加入30 mg硼氫化鈉，密塞，于室溫下還原3 h；用冰醋酸中和過量的硼氫化鈉，加入少量甲醇，減壓濃縮蒸干；重復(fù)4次~5次，真空條件下用五氧化二磷干燥過夜。加入醋酐4 mL，100℃反應(yīng)1 h；加入3 mL甲苯，減壓濃縮蒸干。將乙?；a(chǎn)物用3 mL氯仿溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入等量的蒸餾水充分混勻，靜置后除去上層水溶液，重復(fù)3次~4次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥，用玻璃注射器吸取后經(jīng)有機(jī)膜過濾，氯仿定容至10 mL，即得多糖水解物的乙?；a(chǎn)物，待GC-MS分析。

1.6.3 GC-MS條件

HP-5毛細(xì)管柱（規(guī)格為30.00 m×0.32 mm×0.25μm），氫火焰離子化檢測器（FID），高純度氮?dú)鉃檩d氣。初始柱溫為120℃，以10℃·min-1升溫至240℃，恒溫6.5 min。進(jìn)樣量為2.0μL，進(jìn)樣口溫度為250℃，分流比為1∶50，檢測器溫度為250℃；氫氣流速35 mL·min-1，空氣流速350 mL·min-1，尾吹氣流速30 mL·min-1，柱內(nèi)流速1.0 mL·min-1。

1.7 生長趨勢(shì)及產(chǎn)量記錄

隨機(jī)選取不同高度菇架的作為試驗(yàn)區(qū)，每個(gè)試驗(yàn)區(qū)面積為10 m2。觀察菌絲長勢(shì)，記錄產(chǎn)量，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值表示，采用Pearson相關(guān)性分析法分析酶活力與菌絲多糖之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶活性

漆酶是一種含有銅離子的多酚氧化酶，具有很強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力，其活性大小可以衡量菌株對(duì)木質(zhì)素的降解能力[18-19]。因此，漆酶活性的變化與雙孢蘑菇菌絲利用木質(zhì)素類物質(zhì)的能力密切相關(guān)。探究降溫條件對(duì)漆酶活性的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同降溫時(shí)長處理下雙孢蘑菇的漆酶活性Fig.1 Laccase activity of Agaricus bisporus treated with different cooling duration

如圖1所示，在第Ⅰ期，6 d降溫至17.5℃的處理下漆酶活性最高，為1.006 U；依次為6 d＞4 d＞8 d。在第Ⅱ期，降溫6 d處理下漆酶活性也是最高，為0.986 U；依次為6 d＞8 d＞4 d。綜合分析，6 d處理下的雙孢蘑菇菌絲體對(duì)木質(zhì)素類物質(zhì)的分解能力更強(qiáng)。

2.2 羧甲基纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶活性

羧甲基纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶均屬于降解酶類，與菌絲體對(duì)不同碳源的利用情況有關(guān)[20]。不同降溫時(shí)長對(duì)這3種酶的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同降溫時(shí)長處理下雙孢蘑菇的羧甲基纖維素酶(A)、半纖維素酶(B)、淀粉酶(C)活性Fig.2 Activities of carboxymethyl cellulase(A),hemicellulase(B)and amylase(C)of Agaricus bisporus treated with different cooling duration

如圖2所示，試驗(yàn)結(jié)果表明雙孢蘑菇在第Ⅰ期及第Ⅱ期的降溫處理過程中，羧甲基纖維素酶、半纖維素酶及淀粉酶活力情況均不一致。羧甲基纖維素酶在8 d降溫處理下第Ⅰ期（3.630 U）和第Ⅱ期（3.721 U）的酶活力均達(dá)到最高值；依次為8 d＞6 d＞4 d。半纖維素酶的酶活力在第Ⅰ期降溫處理中，依次為6 d＞4 d＞8 d；第Ⅱ期降溫處理中，依次為4 d＞6 d＞8 d。淀粉酶的酶活力在第Ⅰ期降溫處理中，依次為4 d＞8 d＞6 d；第Ⅱ期降溫處理中，依次為8 d＞6 d＞4 d。綜合分析，3種處理下的羧甲基纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶活性各具有優(yōu)勢(shì)，能針對(duì)不同碳源進(jìn)行吸收和利用。

2.3 蛋白酶活性

蛋白酶的作用主要是對(duì)肽鏈進(jìn)行分解，使蛋白質(zhì)降解成小的蛋白胨、小肽或氨基酸，為菌絲生長和子實(shí)體轉(zhuǎn)化提供有效氮源[21-22]。探究降溫條件對(duì)蛋白酶活性的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同降溫時(shí)長處理下雙孢蘑菇的蛋白酶活性Fig.3 Protease activity of Agaricus bisporus treated with different cooling duration

如圖3所示，不同降溫時(shí)長處理對(duì)第Ⅱ期的蛋白酶酶活性影響更大。在第Ⅰ期，8 d降溫處理酶活力達(dá)到最高值，為3.415 U，依次為8 d＞4 d＞6 d；在第Ⅱ期，4 d降溫處理后酶活力達(dá)到最高值，為3.800 U，依次為4 d＞8 d＞6 d。綜合分析，8 d和4 d降溫處理下蛋白酶活力較高，說明其降解蛋白質(zhì)的能力較強(qiáng)，能獲得更多的氮源。

2.4 雙孢蘑菇不同降溫處理下多糖含量分析

探究不同降溫時(shí)長對(duì)雙孢蘑菇中多糖含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同降溫時(shí)長處理下雙孢蘑菇中多糖的含量Fig.4 Polysaccharide content in Agaricus bisporus treated with different cooling duration

由圖4可知，在第Ⅰ期，4 d降溫處理下多糖含量最低，為1.68 g·100-1g-1，8 d降溫處理多糖含量最高，為2.20 g·100-1g-1。但進(jìn)入第Ⅱ期，4 d處理下多糖含量最高，為3.30 g·100-1g-1，其次是6 d，為2.90 g·100-1g-1，8 d最低，僅有2.70 g·100-1g-1。綜合分析，在第1潮菇菌絲體生長階段，8 d處理下菌絲體多糖含量較高；在第2潮菇菌絲體生長階段，4 d處理下子實(shí)體多糖含量較高。

2.5 不同降溫處理對(duì)雙孢蘑菇菌絲長勢(shì)和產(chǎn)量的影響

對(duì)不同降溫處理下的雙孢蘑菇菌絲長勢(shì)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，4 d處理下的菌絲長速最快，從降溫開始至第7天即出現(xiàn)原基，第12天進(jìn)入采收期；6 d處理下，從降溫開始至第9天出現(xiàn)原基，第13天進(jìn)入采收期；8 d處理下，菌絲生長速度明顯下降，從降溫開始至第10天陸續(xù)出現(xiàn)原基，第15天進(jìn)入采收期。

記錄不同降溫處理下雙孢蘑菇的產(chǎn)量，結(jié)果見表1。

如表1所示，比較不同的菇潮產(chǎn)量可知，3個(gè)處理下產(chǎn)量最高的均為第1潮菇，約占三潮菇總產(chǎn)量的50%；第2潮和第3潮菇的產(chǎn)量呈減少的趨勢(shì)。比較不同處理下的平均產(chǎn)量，4 d和6 d處理下方法的產(chǎn)量分別為26.39 kg·m-2和26.23 kg·m-2，4 d處理下產(chǎn)量略高，但二者無顯著性差異；8 d處理下產(chǎn)量顯著降低，為25.12 kg·m-2。

表1 不同降溫時(shí)長處理下雙孢蘑菇的產(chǎn)量Tab.1 Yield of Agaricus bisporus treated with different cooling duration

2.6 酶活力與多糖含量、產(chǎn)量的相關(guān)性

使用Pearson相關(guān)性分析法分析酶活力與菌絲多糖含量、產(chǎn)量之間的相關(guān)性，結(jié)果見表2。

如表2所示，雙孢蘑菇多糖含量與淀粉酶具有顯著負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.893；和蛋白酶表現(xiàn)為強(qiáng)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.642；和其他胞外酶均為正相關(guān)。產(chǎn)量和羧甲基纖維素酶具有顯著負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.907；和半纖維素酶、漆酶均為正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.688、0.538。

表2 胞外酶活性與多糖含量、產(chǎn)量的相關(guān)性Tab.2 Correlation of extracellular enzyme activity with polysaccharide and yield

2.7 雙孢蘑菇不同降溫處理下多糖中的單糖組成分析

通過比較8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品和樣品衍生物在色譜圖中的保留時(shí)間，定性分析雙孢蘑菇菌絲多糖的單糖組成，結(jié)果見表3。第Ⅰ期不同降溫時(shí)長處理下的色譜圖見圖5~圖7，第Ⅱ期不同降溫時(shí)長處理下的色譜圖見圖8~圖10。

表3 雙孢蘑菇不同降溫處理下多糖中的單糖組成Tab.3 Monosaccharide composition of Agaricus bisporus polysaccharide under different cooling treatments

圖7 第Ⅰ期處理8天樣品的單糖組成色譜圖Fig.7 Chromatogram of monosaccharide composition in samples treated for eight days at the stageⅠ

圖8 第Ⅱ期處理4天樣品的單糖組成色譜圖Fig.8 Chromatogram of monosaccharide composition in samples treated for four days at the stageⅡ

如表3以及圖5~圖10所示，檢測樣品中均含有標(biāo)準(zhǔn)品中的8種單糖組分；單糖標(biāo)準(zhǔn)品按照保留時(shí)間的先后順序依次為鼠李糖（20.462 min）、巖藻糖（20.798 min）、核糖（21.583 min）、阿拉伯糖（21.855 min）、木糖（22.396 min）、甘露糖（32.103 min）、葡萄糖（32.923 min）、半乳糖（34.024 min）。分析雙孢蘑菇菌絲多糖中這8種單糖組分的含量，其摩爾比在各處理中各不相同。由此可知，雙孢蘑菇菌絲各階段的多糖組成不同，其中主要以葡萄糖、半乳糖和甘露糖為主。當(dāng)雙孢蘑菇生長從降溫期到采收期，其多糖組成中的葡萄糖、半乳糖含量逐漸增加。

圖5 第Ⅰ期處理4天樣品的單糖組成色譜圖Fig.5 Chromatogram of monosaccharide composition in samples treated for four days at the stageⅠ

圖10 第Ⅱ期處理8天樣品的單糖組成色譜圖Fig.10 Chromatogram of monosaccharide composition in samples treated for eight days at the stageⅡ

圖6 第Ⅰ期處理6天樣品的單糖組成色譜圖Fig.6 Chromatogram of monosaccharide composition in samples treated for six days at the stageⅠ

3 討論

雙孢蘑菇生長過程中最重要的營養(yǎng)來源是碳源。除了少數(shù)的碳水化合物不能被利用以外，從單糖到纖維素、半纖維素、淀粉、木質(zhì)素等各種復(fù)雜的碳水化合物都能作為碳源被利用。這些碳源主要參與細(xì)胞物質(zhì)的構(gòu)成，以及為其生長發(fā)育提供能量。但在生長過程中菌絲不能直接吸收利用這些長效碳，而必須先將大分子有機(jī)物分解成單糖、雙糖。因此雙孢蘑菇在生長過程中，菌絲能夠分泌的分解酶的種類和數(shù)量決定了可利用的糖的種類及利用率。所以，通過調(diào)控環(huán)境因子，誘導(dǎo)纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶等胞外酶的產(chǎn)生，可為特效碳的充分利用打好基礎(chǔ)。

通過研究發(fā)現(xiàn)，不同降溫時(shí)長處理下雙孢蘑菇在第Ⅰ期及第Ⅱ期都具有完整的胞外酶體系，但酶活指標(biāo)并不相同。第Ⅱ期的羧甲基纖維素酶、半纖維素酶及蛋白酶活性高于第Ⅰ期，而漆酶、淀粉酶活性則低于第Ⅰ期。這與陳慶榆[23]的研究結(jié)果一致，在其研究中發(fā)現(xiàn)，羧甲基纖維素酶和半纖維素酶活性峰值出現(xiàn)在子實(shí)體成熟期；淀粉酶和漆酶活性在菌絲生長期較高，并隨栽培時(shí)間的延長而下降。從不同降溫時(shí)長的處理來看，4 d處理下的半纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶活性更強(qiáng)；6 d處理下漆酶酶活性更強(qiáng)，其分解木質(zhì)素的能力更強(qiáng)；8 d處理下的羧甲基纖維素酶和蛋白酶活性整體更高，分解纖維素、降解蛋白質(zhì)的能力更強(qiáng)。

多糖是雙孢蘑菇等食用菌中重要的成分，食用菌子實(shí)體發(fā)生時(shí)，營養(yǎng)菌絲和子實(shí)體的細(xì)胞壁多糖結(jié)構(gòu)和組分顯著不同。食用菌的營養(yǎng)菌絲和子實(shí)體細(xì)胞壁的可溶性多糖含量和多糖中單糖比例不同，2種細(xì)胞壁的糖苷鍵和多糖構(gòu)象也不同[24]。因此可通過分析雙孢蘑菇從菌絲萌發(fā)到子實(shí)體形成過程中，各階段的可溶性多糖含量和多糖中單糖比例；研究多糖類成分的變化與子實(shí)體的發(fā)生發(fā)育間的關(guān)系；以及雙孢蘑菇生成過程中環(huán)境因素對(duì)其子實(shí)體及其活性成分的影響，從而探索雙孢蘑菇菌絲從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)化到子實(shí)體發(fā)生發(fā)育過程中的內(nèi)在生長發(fā)育機(jī)制。不同降溫時(shí)長處理下2個(gè)生長期的多糖含量變化趨勢(shì)不同，總體上采收期多糖含量均高于降溫期，這與唐川[25]認(rèn)為子實(shí)體采收期多糖含量高于現(xiàn)蕾期（即第Ⅰ期）的結(jié)論較為符合。第Ⅰ期階段，降溫處理的時(shí)長越長多糖含量越高；而第Ⅱ期階段，處理的時(shí)長越長多糖含量越低，4 d處理下菌絲體能產(chǎn)生更多多糖成分。雙孢蘑菇產(chǎn)量與采收期多糖含量變化趨勢(shì)相同，產(chǎn)量隨著降溫時(shí)長的增加而降低，4 d處理下產(chǎn)量最高。

基質(zhì)中胞外酶的變化能反應(yīng)出菌絲生理生化的活躍程度和基質(zhì)中化學(xué)組分的降解特性，與菌絲的生長發(fā)育及生物量息息相關(guān)[5]。利用Pearson相關(guān)性法分析胞外酶活力與多糖含量、產(chǎn)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)淀粉酶活力對(duì)多糖的積累呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)；蛋白酶活力表現(xiàn)強(qiáng)正相關(guān)。因此淀粉酶和蛋白酶活力可以作為分析雙孢蘑菇分泌多糖能力的一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。羧甲基纖維素酶活力對(duì)產(chǎn)量的影響呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)；半纖維素酶活力表現(xiàn)強(qiáng)正相關(guān)。因此羧甲基纖維素酶和半纖維素酶活力可以作為影響雙孢蘑菇子實(shí)體產(chǎn)量的一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探討和驗(yàn)證。

多糖是以葡萄糖、半乳糖等單糖作為結(jié)構(gòu)單元，通過糖苷鍵以線性或分支形式連接而形成的生物大分子，目前關(guān)于多糖的結(jié)構(gòu)分析主要集中在其一級(jí)結(jié)構(gòu)解析等方面[26]。通過比較8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品和樣品衍生物在色譜圖中的保留時(shí)間，定性分析雙孢蘑菇菌絲多糖的單糖組成。雙孢蘑菇多糖由鼠李糖、巖藻糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，這與趙肖通[9]研究結(jié)果一致；不同降溫處理下其單糖的摩爾比不同。雙孢蘑菇從降溫期到采收期，其多糖主要組分中葡萄糖、半乳糖含量逐漸增加。這可能是由于此過程中羧甲基纖維素酶和半纖維素酶逐漸增加；因?yàn)槔w維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，是植物細(xì)胞壁的主要成分；而半纖維素是由幾種不同類型的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，包括半乳糖、甘露糖等。受時(shí)間和試驗(yàn)條件的限制，此次僅對(duì)雙孢蘑菇多糖的單糖組分進(jìn)行了初步的研究，在空間構(gòu)象分析及抗氧化活性等方面有待更深入的研究。

4 結(jié)論

以漆酶活性、半纖維素酶活性、羧甲基纖維素酶活性、蛋白酶活性、淀粉酶活性、多糖含量及其單糖組分、子實(shí)體產(chǎn)量為測定指標(biāo)，對(duì)不同降溫時(shí)長處理措施進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，研究不同降溫時(shí)長處理下的胞外酶活力，可為雙孢蘑菇工廠化培養(yǎng)料配方選擇提供理論依據(jù)。于4天內(nèi)完成21.5℃到17.5℃的勻速降溫處理，能使雙孢蘑菇具有高產(chǎn)和富含多糖的優(yōu)勢(shì)。此研究結(jié)果可為工廠化栽培雙孢蘑菇催蕾期環(huán)境調(diào)控提供科學(xué)理論，解決生產(chǎn)中的實(shí)際問題，促進(jìn)雙孢蘑菇產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。