牡丹江2株香蘑屬菌株的鑒定及馴化研究*

盛春鴿，王延鋒，史 磊，潘春磊，王金賀，劉姿彤，張 鵬，于海洋，趙 靜

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157000）

香蘑屬（Lepista）又稱晶蘑屬，在分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycomycotina）層菌綱（Agaricomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）。中國境內(nèi)香蘑屬菌株野生資源分布分散、數(shù)量稀少，常見的香蘑屬菌類有花臉香蘑（Lepista sordida）、紫丁香蘑（Lepista nuda）、淡色香蘑（Lepista irina）、黃白香蘑（Lepista flaccida）、白香蘑（Lepista caespitosa）、粉紫香蘑（Lepista personata）6種。主要分布于東北、西北、內(nèi)蒙古、華中等地區(qū)[1-2]。

香蘑屬食用菌子實(shí)體的主要特征是：擔(dān)子果口蘑狀至杯傘狀，叢生；常具有紫羅蘭色或丁香紫色色素，失水后顏色漸淡至黃褐色；邊緣內(nèi)卷，具不明顯的條紋，成熟時(shí)邊緣常呈波狀或瓣?duì)?，菌蓋吸水或不吸水；菌褶直生，有時(shí)稍彎生或稍延生，中等密，淡紫色；菌柄長度為4.0 cm～6.5 cm，中生，基部多彎曲，纖維質(zhì)，肉質(zhì)；菌幕缺，初夏至夏季群生或近叢生于草地、農(nóng)田附近、村莊路旁[3-4]。香蘑屬菌類營養(yǎng)豐富，味道鮮美，深受廣大食用菌愛好者和研究人員的青睞。子實(shí)體富含硒、鍺、鐵、鋅、鈣等微量元素和蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[5-6]。

以牡丹江周邊為采集地點(diǎn)，在蘑菇爆發(fā)季節(jié)尋訪黑龍江省境內(nèi)牡丹峰、鏡泊湖、三道關(guān)等自然保護(hù)區(qū)，對(duì)樣地內(nèi)的香蘑屬菌株進(jìn)行采集。在野外初步描述子實(shí)體菌蓋顏色、菌柄及菌褶形態(tài)，用相機(jī)記錄其生境。采集后帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行組織分離，獲得純培養(yǎng)物后低溫保存待用。結(jié)合ITS測序方法確證菌株的分類學(xué)地位，并對(duì)其進(jìn)行馴化研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

菌株ZD1，2018年采自牡丹江畔環(huán)龍灣小區(qū)附近；菌株ZD8，2019年采自牡丹江市溫春鎮(zhèn)周邊。具體生境條件及子實(shí)體形態(tài)見圖1。

圖1 野生香蘑屬菌株子實(shí)體Fig.1 Fruit bodies of wild Lepista spp.strains

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯綜合培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：去皮馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.1.3 其他主要試劑

DP305-03植物基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

發(fā)現(xiàn)野生香蘑屬菌株時(shí)，首先對(duì)其子實(shí)體進(jìn)行拍照，以便最大程度的記錄其生境特征。之后肉眼觀察子實(shí)體顏色、菌蓋大小、菌褶顏色、著生方式、菌肉薄厚程度及菌柄形態(tài)等一系列宏觀特性。

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取菌絲DNA。采用真菌通用引物對(duì)ITS1/ITS4進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增。

擴(kuò)增反應(yīng)體系：dNTPs（2.5 mmol·L-1）2μL、引物（0.2 mmol·L-1）各1μL、10×ExTaqPCR buffer 2μL、ExTaq（5 U·μL-1）0.1μL（TaKaRa）、DNA模板2μL，ddH2O補(bǔ)至20μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性50 s，57℃～58℃復(fù)性50 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)齊7 min；4℃保存。

將擴(kuò)增好的DNA片段送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將已測得的ITS序列在NCBI中通過BLAST檢索比較，利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 馴化

1）母種培養(yǎng)基

參照1.1.2配制PDA培養(yǎng)基。

2）不同溫度對(duì)菌絲的影響

將活化后的花臉香蘑和紫丁香蘑菌絲體分別用5 mm打孔器接種至裝有20 mL PDA培養(yǎng)基的平板（直徑9 cm）中間，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。接種完后分別放在16℃、20℃、24℃、28℃、32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)菌絲長到平板的2/3處時(shí)，測量菌落直徑，比較不同溫度下不同菌株菌絲的生長速度。

3）原種培養(yǎng)基

麥粒培養(yǎng)基：各成分質(zhì)量比例為麥粒99%、石膏1%，含水量65%，pH自然。具體制作方法為：選用顆粒飽滿、無蟲蛀、無霉變的新麥粒，清水浸泡24 h后，煮至無白芯且不開花，撈出瀝干水分；拌入1%石膏，裝袋，126℃滅菌90 min。按常規(guī)方法接種、培養(yǎng)。待接種塊周圍菌絲長滿料面時(shí)，將料面處麥粒揉散，輕輕搖勻，促進(jìn)菌絲的迅速生長。一般約25天長滿菌袋。

4）發(fā)酵料配方及制備

發(fā)酵料配方：各成分質(zhì)量比例為玉米秸稈73%、牛糞25%、石膏1%、石灰1%。發(fā)酵料制備時(shí)應(yīng)選擇新鮮、干燥、無霉變、無蟲蛀的玉米秸稈，使用前置于陽光充足的開闊地暴曬2 d～3 d，后用粉碎機(jī)粉碎成3 cm～5 cm的顆粒，按照配方比例備料，建堆前1天預(yù)濕，農(nóng)作物秸稈等隨浸隨堆，風(fēng)干的禽畜糞便用清水浸濕，以能捏成團(tuán)、散得開為宜。培養(yǎng)料的含水量以65%～70%為宜。用機(jī)械或人工將培養(yǎng)料建成高為1.2 m～1.5 m，寬為2.5 m～3.0 m，長度不限的梯形料堆，在料堆上垂直打出行距為80 cm、孔距為50 cm的兩行通氣孔。記錄料溫變化，當(dāng)溫度達(dá)到55℃以上后保持溫度24 h以上，至白色放線菌出現(xiàn)，開始翻堆，補(bǔ)充水分。發(fā)酵期間一般需翻堆4次，第一次翻堆后分別間隔6 d、5 d、4 d，再翻堆一次，每次翻堆應(yīng)注意翻均勻，上下、里外翻透。堆制全過程大約需20 d～25 d。發(fā)酵成熟的標(biāo)準(zhǔn)為：手抓料質(zhì)松軟，富有彈性，料中充滿白色的發(fā)熱菌體，無結(jié)塊，無氨味和糞臭味，具體參照參考文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方法鑒定菌株。

菌株ZD1子實(shí)體呈淡紫色；菌蓋直徑為7 cm，平展，邊緣呈現(xiàn)波浪狀或花瓣?duì)?，中間顏色稍淺；菌柄中生，細(xì)，長度為4 cm，直徑為0.5 cm，實(shí)心；菌褶稍延生。菌株ZD8子實(shí)體呈紫羅蘭色；菌蓋邊緣圓整，直徑為6 cm，中間稍凸；菌褶直生；菌柄中生，實(shí)心，長度為6 cm，直徑為0.5 cm。

經(jīng)ITS測序以后，得到600 bp左右的2個(gè)片段。把這2個(gè)片段提交至GenBank，獲得菌株ZD1的登錄號(hào)為MZ298492，菌株ZD8的登錄號(hào)為MZ298498。同時(shí)在Genbank里進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示菌株ZD1與Lepista sordida（KF874612.1）的同源性達(dá)到100%，菌株ZD8與Lepista nuda（MT644922.1）的同源性達(dá)99%。以松口蘑(Tricholoma matsutake）為外群，用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on ITS sequences

由圖2可知，菌株ZD1和花臉香蘑（登錄號(hào)為KF874612.1和KP293583.1）聚為一個(gè)進(jìn)化枝。菌株ZD8和紫丁香蘑（登錄號(hào)為MT644922.1）聚為一個(gè)進(jìn)化枝。

結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹和比對(duì)結(jié)果，以及子實(shí)體表型特征，可以判斷菌株ZD1是花臉香蘑，菌株ZD8是紫丁香蘑。

2.2 菌株馴化

2.2.1 不同溫度對(duì)香蘑屬菌株菌絲生長的影響

測定在不同溫度下不同菌株的菌落生長速度，結(jié)果見圖3。

如圖3所示，2個(gè)菌株生長情況不同，花臉香蘑菌株ZD1菌絲生長速度較快，紫丁香蘑菌株ZD8生長速度較慢?；樝隳⒃?4℃時(shí)菌絲生長速度最快，平均為1.12 cm·d-1。紫丁香蘑菌株生長曲線與花臉香蘑略有不同，在20℃時(shí)菌絲生長速度最快，平均為0.55 cm·d-1。

圖3 溫度對(duì)香蘑屬菌株菌絲生長的影響Fig.3 Effect of temperature on mycelial growth of Lepista spp.

2.2.2 花臉香蘑馴化試驗(yàn)

于6月初，氣溫為22℃～25℃，空氣濕度為80%左右時(shí)，采用發(fā)酵料散播的方式進(jìn)行播種。播種量以0.8 kg·m-2～1.0 kg·m-2為宜，鋪料厚度約為20 cm，折合干料約為10 kg·m-2～15 kg·m-2。播種后3周左右，菌絲大部分長滿料面，可對(duì)菌床進(jìn)行覆土，土質(zhì)以松軟、透氣為宜，覆土厚度為1 cm～2 cm。覆土后，控制濕度約為80%，溫度為22℃～26℃，菇棚內(nèi)保持適當(dāng)散射光。覆土后約15 d，花臉香蘑菌絲長滿土層，此時(shí)噴水至土層濕潤，調(diào)節(jié)空氣濕度至80%～90%，增加晝夜溫差促進(jìn)子實(shí)體形成。一般經(jīng)過4 d～5 d，表面菌絲開始扭結(jié)，形成紫色的原基，現(xiàn)蕾以后，噴水方式調(diào)整為少量多次，始終保持土層濕潤，且保持充足的氧氣供應(yīng)。原基生長5 d～7 d，子實(shí)體達(dá)到成熟，即可采收，見圖4。

圖4 玉米秸稈基質(zhì)上的花臉香蘑子實(shí)體Fig.4 Fruit body of Lepista sordida grown on corn stalk fermentation substrate

如圖4所示，花臉香蘑子實(shí)體最初呈半球形，隨著成熟期的來臨，菌蓋慢慢平展，當(dāng)子實(shí)體過度成熟時(shí)菌蓋邊緣會(huì)呈現(xiàn)波狀，一般在菌蓋平展、出現(xiàn)波浪狀之前采收最為適宜。

3 結(jié)論與討論

花臉香蘑是小眾珍稀食用菌之一，近幾年來，相關(guān)的研究報(bào)道越來越多。盡管如此，花臉香蘑還未被大眾所熟知和接受，其研究仍然處于起步階段，目前使用的菌種仍然以野生資源為主，尚未有商業(yè)化栽培的相關(guān)報(bào)道，市場占有率極小。

通過傳統(tǒng)表型鑒定和ITS測序相結(jié)合的方法鑒定香蘑屬菌株，結(jié)果較為可靠。劉悅萍等[8]利用ITS序列鑒定了從北京市懷柔區(qū)原始次生林區(qū)分離到的野生香蘑，確定其為花臉香蘑。張京良等[9]利用ITS序列對(duì)采集自青島嶗山的一株真菌LS7進(jìn)行鑒定，證明此真菌為花臉香蘑。姜雪等[10]采用表型和分子結(jié)合的方法，準(zhǔn)確的鑒定出了2株香蘑屬菌株。劉紅霞等[11]對(duì)17種野生蕈菌進(jìn)行ITS鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確可信；并對(duì)其中8個(gè)菌株進(jìn)行了馴化栽培。鄒莉[12]、賈定洪[13]、岳萬松[14]、王紅艷[15]等分別對(duì)野生花臉香蘑菌株進(jìn)行ITS序列鑒定，取得可靠的結(jié)果。

花臉香蘑馴化的相關(guān)研究國內(nèi)外均有報(bào)道，國內(nèi)的研究比較早而且深入；國外的研究以花臉香蘑發(fā)酵液有效成分的提取以及藥理特性為主，對(duì)栽培方面的研究不多[16-18]。因此，通過結(jié)合傳統(tǒng)分類學(xué)方法和ITS數(shù)據(jù)分析，取得可靠鑒定結(jié)果。所鑒定的2個(gè)菌株中，1株是較難馴化成功的紫丁香蘑，另外1株是比較容易馴化的花臉香蘑。目前花臉香蘑已成功馴化，紫丁香蘑的馴化及出菇條件還有待于進(jìn)一步研究。

花臉香蘑屬于草腐菌，可以利用農(nóng)作物秸稈進(jìn)行栽培。但目前其栽培管理方式較為粗放，缺乏一套成熟、系統(tǒng)的栽培模式和管控措施。菌種資源也較為有限，多為研究者采集后通過組織分離獲得，品種選育和改良能力較弱。花臉香蘑產(chǎn)業(yè)鏈還有待建立、健全，種質(zhì)資源、栽培、育種、病蟲害防控以及精深加工等方面研究仍需進(jìn)一步加強(qiáng)。