藥用與食用黃精次生代謝產(chǎn)物差異分析及改善胰島素抵抗的活性成分與作用機制研究

陳 林，王 敏，胡 媛，劉友平，陳鴻平，王 福

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 611137

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)一般是指正常濃度下胰島素靶細(xì)胞對定量濃度的胰島素生物學(xué)應(yīng)答敏感性降低，即胰島素促進葡萄糖攝取和利用作用受損，導(dǎo)致胰島素分泌代償性增多，引起骨骼肌、肝臟、脂肪等組織對胰島素敏感性下降和對葡萄糖的利用障礙[1]。其中，IR是2型糖尿病重要的發(fā)病機制之一，貫穿于2型糖尿病全過程[2]。目前，治療IR的藥物主要為胰島素增敏劑，但存在骨折、水腫、肝損傷等副作用[3]。

黃精PolygonatumsibiricumRed.為百合科黃精屬植物，為《中國藥典》2020年版收載的3種黃精之一，以干燥塊莖入藥，為常見藥食兩用品，因其外形呈結(jié)節(jié)狀彎柱形類似雞頭，俗稱雞頭黃精，廣泛分布于四川、湖南、江西等地區(qū)，性味甘平、無毒，具有補氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎的功效，用于治療脾胃氣虛，體倦乏力，內(nèi)熱消渴等證[4]，主要含有多糖、皂苷、黃酮、生物堿及蒽醌等成分[5]。臨床上，黃精復(fù)方被廣泛用于2型糖尿病的治療，對氣陰兩虛型2型糖尿病可以緩解患者的中醫(yī)證候，降低血糖、血脂，改善胰島功能[6]。文獻報道黃精復(fù)方改善胰島功能的機制認(rèn)為，其活性成分通過作用于PI3K和STAT3等靶點，進一步影響蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸活動、PI3K-AKT等信號通路而發(fā)揮作用[7]；黃精單味藥改善胰島功能的機制研究認(rèn)為，黃酮類化合物通過作用于突觸后膜，改變細(xì)胞對藥物的敏感性、細(xì)胞神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等生物過程及調(diào)控鈣離子、激素抵抗等信號通路起到了改善IR的作用[8]。

目前，HPLC、LC-MS/MS、UPLC-Q-TOF-MS等技術(shù)常用于黃精化學(xué)成分的定性與定量研究，已報道黃精含有黃酮類成分以及生物堿等化學(xué)成分[9]，但普遍存在檢測成分?jǐn)?shù)量少，難以反映黃精中所含全部代謝產(chǎn)物。近年來，隨著代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于UPLC-ESI-MS/MS的廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)廣泛用于中藥代謝產(chǎn)物的研究，與傳統(tǒng)常見色譜技術(shù)相比具有高靈敏度、低成本、高通量的優(yōu)勢[10,11]。由于目前尚未見藥用與食用黃精整體次生代謝產(chǎn)物差異分析報道，本文以藥用黃精(PolygonatumsibiricumRed.)以及食用黃精(互葉卷黃精PolygonatumalternicirrhosumHand.-Mzt.，俗稱水果黃精)為研究對象，首次采用UHPLC-ESI-MS/MS廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)對其次生代謝產(chǎn)物進行全面檢測，并采用主成分分析(PCA)、HCA聚類分析以及正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)對代謝產(chǎn)物進行比較分析，篩選差異代謝物；其次對藥用黃精與食用黃精差異代謝物相對含量變化前十且上調(diào)的化合物進行改善胰島素抵抗的網(wǎng)絡(luò)藥理分析，并對活性成分和關(guān)鍵靶點進行分子對接，選用HepG2細(xì)胞進行細(xì)胞實驗驗證。一方面以期全面了解藥用與食用黃精差異代謝物，為黃精品質(zhì)評價奠定基礎(chǔ)，另一方面擬篩選治療IR的潛在活性成分，為闡述黃精治療IR的作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，Tandem mass spectrometry，MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP)；色譜柱(Waters T3 C181.8 μm，2.1 mm×100 mm)；FA2003電子分析天平(上海浦春)；MM400球磨儀(德國萊馳)；TGL-16臺式高速離心機、2500-A臺式低速離心機(湖南湘儀實驗儀器有限公司)；凍干機(Scientz-100F)；移液槍(德國Eppendorf公司)；HCB-1300V潔凈工作臺、HCP-168二氧化碳培養(yǎng)箱(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)；B25-12D超聲波清洗儀(寧波新藝超聲波設(shè)備有限公司)；UPT-12D優(yōu)普系列超純水機(成都超純科技有限公司)；GR85DA高壓滅菌鍋(美國ZEALWAY INSTRUMENT INC)；NIKON DS-U3成像系統(tǒng)(日本尼康)；Allegra X-12R冷凍離心機(Beckman Coulter)；CKX53顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；3001酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific Oy)；HB120-S金屬浴、D1008掌上離心機、MX-S可調(diào)式混勻儀(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)；EPS-300數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、VE-180B垂直電泳槽、VE586轉(zhuǎn)移電泳槽(上海天能科技有限公司)；TS-2脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

乙腈(美國Fisher chemical，色譜純)；娃哈哈純凈水；甲酸(美國，MREDA Technology Inc)；甲醇、乙醇(北京化工廠，分析純)；二甲亞砜(成都市科隆化學(xué)品有限公司，分析純)；二甲基亞砜(Sigma，細(xì)胞級，批號SHBK2703)；胰酶細(xì)胞消化液(Biosharp，批號70090500)；胎牛血清、PBS緩沖液(BI，批號分別為2106044、2138268)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國HyClone公司，批號J190033)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，批號8121557)；DMEM高糖培養(yǎng)基、脫脂奶粉(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20211124、107B055)；BCA蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、PAGE凝膠快速制備試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、TBST、快速轉(zhuǎn)膜緩沖液、電泳緩沖液、RIPA裂解液、BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)、三色預(yù)染Marker、PVDF膜(上海雅酶生物科技有限公司，批號分別為01543050、024B1100、024A1250、01461050、034B1200、01451040、034B1200、014B1070、01542050、02552410、280659340)；噻唑藍(lán)(安耐吉生物，批號EQ9RED6D)；葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號為20211208137)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠、兔抗AKT1、兔抗mTOR、兔抗VEGF(碧云天生物技術(shù)研究所，批號分別為A0208、A0216、AF1777、AF1648、AF0312)；β-actin、鼠抗AMPK、鼠抗PI3K(景杰生物，批號分別為RL080946、ML081163、L011304)；異鼠李素、野漆樹苷(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號分別為21041623、21080923)；異野漆樹苷(西力生物，批號為BBP01924)；精蛋白人胰島素混合注射液(通化東寶藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S20030004)；鹽酸二甲雙胍緩釋片(山東司邦得制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20060230)。

實驗所用細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，來自于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；實驗所用樣品采集于重慶市秀山土家苗族自治縣八家路村，收集時間為2020年7月9日，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授鑒定，樣品1為互葉卷黃精(PolygonatumalternicirrhosumHand.-Mzt.)新鮮全株；樣品2為藥用黃精(PolygonatumsibiricumRed.)新鮮全株。1號樣品為地方野生食用品種，該品種因多糖含量高，口感甜，俗稱水果黃精(SGHJ)；2號樣品為藥典收載藥用品種(HJ)。樣品1與2各收集3批次，編號標(biāo)記，返回實驗室后，將樣品塊莖放置于凍干機中真空冷凍干燥，采用研磨儀研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末狀，保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

取藥用與食用黃精干燥樣品(過四號篩)100 mg，量取1.0 mL甲醇水溶液(70%甲醇)溶解，超聲0.5 h，低溫靜置12 h，期間渦旋3次，離心并吸取上清，過濾，于進樣瓶中備用。

1.2.2 色譜與質(zhì)譜條件

質(zhì)譜與色譜條件參考文獻報道方法[12]。液相條件主要包括：(1)色譜柱：Agilent SB-C181.8 μm，2.1 mm×100 mm；(2)流動相：A相為超純水(加入0.1%的甲酸)，B相為乙腈(加入0.1%的甲酸)；(3)洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，9.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并在95%維持1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；(4)流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量4 μL。質(zhì)譜條件主要包括：LIT和三重四極桿(QQQ)掃描是在三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(Q TRAP)，AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)上獲得的，該系統(tǒng)配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制運行正負(fù)兩種離子模式。ESI源操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓(IS)5 500 V(正離子模式)/-4 500 V(負(fù)離子模式)；離子源氣體I(GSI)、氣體II(GSII)和簾氣(CUR)分別設(shè)置為50、60和25.0 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ和LIT模式下分別用10和100 μmol/L聚丙二醇溶液進行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體(氮氣)設(shè)置為中等。通過進一步的DP和CE優(yōu)化，完成了各個MRM離子對的DP和CE。根據(jù)每個時期內(nèi)洗脫的代謝物，在每個時期監(jiān)測一組特定的MRM離子對。

1.2.3 代謝物定性定量原理

代謝物結(jié)構(gòu)解析參考了MassBank(http://www.massbank.jp)、KNAPSAcK(http://kanaya.naist.jp/KNApSAcK)、HMDB(http://www.hmdb.ca)、MoToDB(http://www.ab.wur.nl/moto)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/index.php)、MWDB(metware database)等已有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。代謝物定量是利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)分析完成。MRM模式中，四級桿首先篩選目標(biāo)物質(zhì)的前體離子(母離子)，排除掉其他分子量物質(zhì)對應(yīng)的離子以初步排除干擾；前體離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標(biāo)離子干擾，使定量更為精確，重復(fù)性更好。

根據(jù)新村金礦床原生暈及各項地球化學(xué)參數(shù)的研究，繪制礦床成礦元素空間分布示意圖(圖5)。從示意圖中可以看出，成礦熱液由礦區(qū)北北西側(cè)深部沿構(gòu)造通道多次分期上侵至礦區(qū)。根據(jù)礦床原生暈的大致分帶情況可知，礦區(qū)的原生暈軸向分帶為以Mo-Ni-Co-Cu為后尾暈，以W-Au-Ag-As-Sb為中心暈，以Mn-Ba-Zn-Pb-Hg為前緣暈。而示意圖中實線所標(biāo)示的原生暈中心正是新村金礦主要礦體部分，故可以推斷在-60中段的下方，仍舊有大部分金礦體的存在，同時也表明礦區(qū)北北西側(cè)深部仍有較大找礦空間。

1.2.4 代謝物定性定量分析

圖1A所示為混合樣品的總離子流圖(TIC)，縱坐標(biāo)為離子流強度，橫坐標(biāo)為保留時間。基于“1.2.3”所列代謝數(shù)據(jù)庫，對本實驗所有樣本的代謝物進行了質(zhì)譜定性定量分析。為了比較所檢測到代謝物的含量差異，對檢測到的每個代謝物的質(zhì)譜峰進行校正。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進行積分校正。

圖1 QC樣本質(zhì)譜檢測TIC重疊圖(A)與混合樣品TIC圖(B)Fig.1 TIC overlapping map of QC sample (A) and TIC map of mixed sample (B)

1.2.5 樣本質(zhì)控分析

在實驗過程中，為確保實驗的準(zhǔn)確性，在每2個檢測分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程中的重復(fù)性。通過對不同質(zhì)控樣本質(zhì)譜檢測分析的總離子流圖(見圖1B)進行重疊展示分析，可以判斷代謝物提取和檢測的重復(fù)性，即技術(shù)重復(fù)。儀器的高穩(wěn)定性為數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性提供了保障。

1.2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理分析

1.2.6.1 藥物成分及靶點篩選

使用PubChem數(shù)據(jù)庫獲得藥用黃精與食用黃精差異代謝物相對含量變化前10且上調(diào)的化合物的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，取預(yù)測得分大于0的靶標(biāo)作為藥物靶點。

1.2.6.2 IR疾病靶點蛋白的確認(rèn)

以“insulin resistance”為檢索詞檢索DisGeNET、CTD、GeneCards與OMIM數(shù)據(jù)庫獲取IR的疾病靶點蛋白，去除重復(fù)值后運用UniProt數(shù)據(jù)庫對其進行蛋白名稱標(biāo)準(zhǔn)化，以備進一步分析。運用R 3.6.0將黃精的藥物靶點與IR的疾病靶點取交集，作為黃精治療IR的潛在作用靶點。

1.2.6.3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network Analyzer功能對黃精的主要活性成分進行分析，將黃精潛在活性成分與藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape軟件中，繪制出“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.6.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述藥物-疾病共同靶點輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中進行檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，構(gòu)建蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6.5 分子對接驗證

運用AutoDock Vina軟件(1.2.2)和Pymol軟件對“1.2.6.1”和“1.2.6.2”篩選活性成分與關(guān)鍵靶點進行對子對接，評價黃精活性成分與關(guān)鍵靶點之間的結(jié)合活性，并以結(jié)合能來評價其結(jié)合活性。

1.2.7 細(xì)胞實驗驗證

1.2.7.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁且匯合度達80%以上，用0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.7.2 MTT法檢測野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對HepG2細(xì)胞存活率的影響

將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以4 000個/孔的密度接種于2塊96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基。設(shè)置空白組、對照組和藥物處理組?？瞻捉M僅加入不含藥DMEM完全培養(yǎng)基，不接種細(xì)胞，對照組加入不含藥DMEM完全培養(yǎng)基，藥物處理組加入用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制的不同濃度的野漆樹苷(濃度處理分別為：30、15、7.5、3.8、1.9、1 μg/mL)、不同濃度的異野漆樹苷(濃度處理分別為100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6 μg/mL)、不同濃度的異鼠李素(濃度處理分別為200、100、50、25、12.5、6.3 μg/mL)，每組濃度設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT液(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min，于570 nm處測每孔吸光度值并計算細(xì)胞存活率，公式如下：

細(xì)胞存活率=(藥物處理組OD值-空白組OD值)/

(對照組OD值-空白組OD值)×100%

1.2.7.3 建立HepG2細(xì)胞胰島素抵抗(IR)模型與藥物干預(yù)處理

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以懸液濃度為8×105個/皿的密度接種于直徑為100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁且匯合度達80%，吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，將饑餓培養(yǎng)后的細(xì)胞隨機分組為對照組、模型組、陽性對照組、野漆樹苷組、異野漆樹苷組、異鼠李素組，饑餓培養(yǎng)后吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，對照組加入DMEM完全培養(yǎng)基，其他組加入新配制的含有胰島素(胰島素濃度為：1×10-6mol/L)的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h即得胰島素抵抗(IR)模型。24 h后，對照組加入DMEM完全培養(yǎng)基，模型組加入含有胰島素的培養(yǎng)基，陽性對照組加入含有二甲雙胍和胰島素的培養(yǎng)基，根據(jù)MTT實驗結(jié)果，野漆樹苷組加入含有胰島素和野漆樹苷的培養(yǎng)基，異野漆樹苷組加入含有胰島素和異野漆樹苷的培養(yǎng)基，異鼠李素組加入含有胰島素和異鼠李素的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后取培養(yǎng)基上清，離心，按照葡萄糖檢測試劑盒說明書操作，計算細(xì)胞葡萄糖消耗量。

1.2.7.4 Western blot檢測PI3K、AKT1、VEGF、mTOR、AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達情況

將藥物干預(yù)后的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗2次，加入新配制的RIPA裂解液并收集細(xì)胞于預(yù)冷的1.5 mL離心管中，用槍頭反復(fù)吹打細(xì)胞裂解液數(shù)次，冰上裂解30 min，于4 ℃、13 000 r/min離心30 min，取上清，用BCA法測蛋白濃度，蛋白加入5×loading buffer于98 ℃煮8 min，使蛋白變性，煮完后冰上預(yù)冷，渦旋，離心，放-20 ℃保存?zhèn)溆?。制備蛋白上樣樣品，取蛋白樣?0 μg進行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后加入適量含5%脫脂奶粉的TBST封閉液于搖床上室溫封閉2 h，封閉完成后，用TBST洗膜，共3次，每次10 min，洗膜完成后加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日回收一抗，用TBST洗膜，共3次，每次10 min，加入二抗，于搖床上室溫孵育1 h，用TBST洗膜，共3次，每次10 min，洗膜后ECL法顯影。采用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析：目的蛋白表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.2.7.5 數(shù)據(jù)分析

2 實驗結(jié)果

2.1 樣品中次生代謝產(chǎn)物的鑒定

經(jīng)過分析本文共鑒定出319種次生代謝產(chǎn)物，包括酚酸類86種，黃酮類96種，蒽醌類5種，木脂素與香豆素25種，鞣質(zhì)3種，生物堿51種，萜類11種，甾體21種，其他類21種。代謝物含量數(shù)據(jù)采用極差法進行歸一化處理，通過R軟件(www.r-project.org/)，對代謝物在不同樣本間的積累模式進行聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)。通過聚類分析(見圖2A)可知，同一品種不同批次的藥用黃精和食用黃精存在次生代謝物差異，種內(nèi)次生代謝物變異較大；不同批次藥用黃精與食用黃精次生代謝物分別聚為一類，可以明顯區(qū)分。從熱圖可以判斷，藥用黃精與食用黃精次生代謝產(chǎn)物差異較大，藥用黃精次生代謝物相對含量普遍高于食用黃精，且相對含量較高的次生代謝物數(shù)量占優(yōu)。

圖2 藥用黃精與食用黃精代謝物的聚類(A)與主成分(B)分析Fig.2 HCA (A) and PCA (B) analyses of medicinal and edible Polygonati Rhizoma

2.2 主成分分析(PCA)與正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

本文通過主成分分析方法將次生代謝物的差異通過降維處理以直觀反映樣本之間的代謝物差異情況。圖2B中可以看出，主成分PC1與PC2的占比分別達到了48.01%和20.36%，積累貢獻率達到了68.37%。藥用黃精與食用黃精分別聚為一類，可明顯區(qū)分，實驗結(jié)果與聚類分析一致；正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)被廣泛用于代謝組數(shù)據(jù)的分析，由于其分析方法可以最大化組間差異常被用于差異代謝物的篩選。在OPLS-DA分析中，Q2是一個重要的參數(shù)，若數(shù)值大于0.9，則可以反映該模型的可靠性與穩(wěn)定性。圖3A中可以看出，藥用黃精與食用黃精比較組OPLS-DA模型中Q2為0.996，其數(shù)值大于0.90，證實該模型可以用以下一步的差異代謝物分析。

圖3 藥用黃精與食用黃精代謝物的OPLS-DA(A)與差異代謝物分析(B)圖Fig.3 OPLS-DA (A) and volcanic plots (B) of differential metabolites of medicinal and edible Polygonati Rhizoma

2.3 差異代謝物的篩選、注釋與富集

本文結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)值(fold change)與多變量分析OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in project，VIP)數(shù)值進行樣品之間的差異代謝物篩選。篩選標(biāo)準(zhǔn)為選取fold change≥2或fold change≤0.5和VIP≥1的差異代謝物，即代謝物在組間差異為2倍以上或0.5倍以下以及VIP≥1，則認(rèn)為差異顯著。結(jié)果表明，藥用黃精與食用黃精共計篩選出106種差異代謝物，從圖3B中可以看出，上調(diào)化合物85種，下調(diào)化合物21種。藥用黃精與食用黃精樣品之間差異代謝物經(jīng)過數(shù)據(jù)庫KEGG注釋，其分類結(jié)果顯示(見圖4A)，差異代謝物主要參與次級代謝生物合成、黃酮類生物合成、黃酮與黃酮醇生物合成、異黃酮生物合成與生物堿生物合成；KEGG富集結(jié)果顯示(見圖4B)，差異代謝物富集主要集中于黃酮、異黃酮與黃酮醇代謝途徑。為進一步了解藥用黃精與食用黃精次生代謝物含量差異變化較大物質(zhì)，篩選了差異代謝物相對含量變化前十的化合物(見表1)。藥用黃精與食用黃精比較相對含量上調(diào)的9種，分別為：異鼠李素、薯蕷皂苷元-3-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-(6′′-對香豆酰)葡萄糖苷、異野漆樹苷、野漆樹苷、苜蓿素-4′-O-葡萄糖苷-7-O-葡萄糖苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-葡萄糖苷、延齡草苷-6′-O-槐三糖苷；相對含量下調(diào)的化合物1種：27-O-(3-羥基-3-甲基戊二酰)螺柱-5-烯-3β,27-二醇(異炔醇酮)-3-O-鼠李糖-(1→2)-O-[葡萄糖-(1→4)]-葡萄糖苷。

圖4 藥用黃精與食用黃精差異代謝物KEGG分類圖(A)與富集圖(B)Fig.4 KEGG classification (A) and KEGG enrichment statistics (B) of medicinal and edible Polygonati Rhizoma

表1 藥用黃精與食用黃精差異代謝物相對含量變化前10的化合物

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理分析

將藥用黃精與食用黃精差異代謝物相對含量變化前十的化合物作用的靶點與IR的疾病靶點用R 3.6.0取交集后獲取靶點59個，為藥用黃精改善IR的作用靶點，用Venny 2.1做出韋恩圖，如圖5A所示，黃色代表IR的疾病靶點，藍(lán)色代表化合物的作用靶點，重合部分為化合物靶點與疾病靶點的交集靶點，其中僅5種化合物與IR疾病靶點相重合。從“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖(見圖5B)可以看出，異鼠李素、野漆樹苷、異野漆樹苷3種黃酮類化合物通過PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK等核心靶點作用于PI3K-Akt、mTOR、VEGF、AMPK等信號通路，同時通路中各靶點蛋白相互作用(見圖5C～5D)。KEGG富集圖(見圖5E)結(jié)果表明，PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路等信號通路富集明顯。分子對接結(jié)果表明(見圖6)，異鼠李素、野漆樹苷、異野漆樹苷與核心靶點PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK結(jié)合度好，其結(jié)合能均≤20.9 kJ/mol。

圖5 黃精與治療疾病的網(wǎng)絡(luò)藥理分析Fig.5 Network pharmacological analysis of Polygonati Rhizoma and therapeutic diseases注：(A)黃精與胰島素抵抗靶點韋恩圖；(B)藥物-成分-靶點-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖；(C～D)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)；(E)黃精治療胰島素抵抗的KEGG富集分析。Note:(A) Venn diagram of Polygonati Rhizoma and insulin resistance targets;(B) Network diagram of drug-component-target-disease interactions;(C-D) Protein-protein interaction network;(E) KEGG enrichment analysis of Polygonati Rhizoma for insulin resistance.

2.5 野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對HepG2 細(xì)胞活性的影響

采用MTT法檢測野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對HepG2細(xì)胞活性的影響，結(jié)果如圖7所示。與對照組相比，HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度的藥物處理24 h后，細(xì)胞活性發(fā)生明顯改變，野漆樹苷藥物處理組中30、7.5 μg/mL濃度處理組的細(xì)胞存活率較高，異野漆樹苷藥物處理組中25、3.2、1.6 μg/mL濃度處理組的細(xì)胞存活率較高，異鼠李素藥物處理組中100、50 μg/mL濃度處理組的細(xì)胞存活率較高。基于藥物對細(xì)胞活性的影響、藥物濃度的有效性以及藥物配制過程中的誤差，本實驗選擇7.5 μg/mL野漆樹苷、3.2 μg/mL異野漆樹苷和100 μg/mL異鼠李素進行下一步的實驗。

2.6 野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對IR HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對IR HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響的結(jié)果如圖8所示，與對照組比較，經(jīng)過胰島素處理后，模型組細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明模型組細(xì)胞葡萄糖消耗量降低，模型組細(xì)胞產(chǎn)生了IR作用，IR模型建立成功。與模型組比較，野漆樹苷和異野漆樹苷組細(xì)胞葡萄糖含量升高，且差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明野漆樹苷和異野漆樹苷干預(yù)后不能改善HepG2細(xì)胞IR狀態(tài)；與模型組比較，異鼠李素組和陽性對照組細(xì)胞葡萄糖含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明異鼠李素組細(xì)胞葡萄糖消耗量增加，異鼠李素干預(yù)后能改善HepG2細(xì)胞IR狀態(tài)，選擇異鼠李素進行下一步的實驗。

圖6 異鼠李素、野漆樹苷、異野漆樹苷與核心靶點PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK分子對接結(jié)果Fig.6 Docking results of isorhamnetin,rhoifolin and isorhoifolin with core targets PI3K,AKT1,VEGFA,mTOR and AMPK注：A1～A5分別為異鼠李素與靶點PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK對接圖；B1～B5分別為野漆樹苷與靶點PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK對接圖；C1～C5分別為異野漆樹苷與靶點PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK對接圖。Note:A1-A5 are docking diagrams of isorhamnetin with target PI3K,AKT1,VEGFA,mTOR and AMPK respectively;B1-B5 are docking diagrams of rhoifolin and target PI3K,AKT1,VEGFA,mTOR and AMPK respectively;C1-C5 are docking diagrams of isorhoifolin and target PI3K,AKT1,VEGFA,mTOR and AMPK respectively.

圖7 野漆樹苷(A)、異野漆樹苷(B)、異鼠李素(C)對HepG2 細(xì)胞活性的影響Fig.7 Effects of rhoifolin (A),isorhoifolin (B) and isorhamnetin (C) on HepG2 cells 注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

圖8 野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對IR HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.8 Effects of rhoifolin,isorhoifolin and isorhamnetin on glucose consumption of IR HepG2 cells 注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with control group, *P<0.05,**P<0.01;Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01.

2.7 異鼠李素對IR HepG2細(xì)胞PI3K、AKT1、VEGF、mTOR、AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

如圖9所示，本實驗選取β-actin作為內(nèi)參蛋白，結(jié)果顯示內(nèi)參表達水平趨于一致，表明該實驗具有可靠性。與對照組比較，模型組細(xì)胞PI3K、AKT1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，VEGF、mTOR蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，AMPK蛋白表達雖升高，但不具有顯著性差異；與模型組比較，異鼠李素藥物干預(yù)后PI3K、AKT1蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，VEGF和mTOR蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，且均與陽性對照趨勢一致。實驗結(jié)果表明異鼠李素主要通過影響PI3K、AKT1、VEGF和mTOR蛋白表達從而改善HepG2細(xì)胞IR狀態(tài)。

圖9 異鼠李素對IR HepG2細(xì)胞PI3K、AKT1、VEGF、mTOR、AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響Fig.9 Effects of isorhamnetin on expression of PI3K,AKT1,VEGF,mTOR and AMPK signaling pathway related proteins in IR HepG2 注：C：對照組；M：模型組；P：陽性對照組；A：異鼠李素組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Note:C:Control group;M:Model group;P:Positive group;A:Isorhamnetin group.Compared with control group,*P<0.05;Compared with model group,#P<0.05.

3 討論與結(jié)論

本文基于UHPLC-ESI-MS/MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法對藥用黃精與食用黃精的次生代謝產(chǎn)物進行分析。結(jié)果共鑒定出319種次生代謝產(chǎn)物，包括酚酸類86種，黃酮類96種，蒽醌類5種，木脂素與香豆素25種，鞣質(zhì)3種，生物堿51種，萜類11種，甾體21種，其他類21種。藥用黃精與食用黃精所含次生代謝物差異較大，PCA與HCA均可顯著區(qū)別。另藥用黃精與食用黃精比較組中共篩選出106種差異代謝物，其中上調(diào)化合物85種，下調(diào)化合物21種，藥用黃精在次生代謝產(chǎn)物數(shù)量與相對含量方面具有明顯優(yōu)勢。為進一步比較藥用黃精與食用黃精次生代謝物的變化規(guī)律，將差異代謝物經(jīng)過數(shù)據(jù)庫KEGG注釋，由KEGG分類與富集結(jié)果表明，藥用黃精在黃酮、黃酮醇、異黃酮、生物堿代謝途徑發(fā)生明顯富集，這可能與藥用黃精品質(zhì)形成相關(guān)。由文獻報道可知[13]，植物在生長過程中，由于生長環(huán)境或逆境的脅迫會產(chǎn)生種類豐富的次生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物往往具有抗旱、抵御病害、蟲害等特定的生物功能，同時這些次生代謝物的積累也有利于植物藥用部位藥效品質(zhì)的提升。如：黃酮類成分的積累有利于抗氧化、抗炎、抗腫瘤功效的提高[14]；生物堿類成分積累則表現(xiàn)出有較高的抗肝癌作用及抑制α-糖苷酶活性的作用[15]；甾體皂苷具有多樣生物活性的成分，如抗炎，抗腫瘤等[16]。因此，在對這些差異積累的黃酮類、生物堿類以及甾體類化合物的深入分析，有利于篩選出與藥用黃精品質(zhì)相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)志物。

目前《中國藥典》2020年版一部黃精項下并未對黃酮、生物堿類等次生代謝產(chǎn)物進行含量限定。本研究對藥用黃精與食用黃精差異代謝物相對含量變化前十的化合物進行比較發(fā)現(xiàn)，50%的代謝物屬于黃酮類化合物，這與差異代謝物KEGG分類與富集結(jié)果一致。其中藥理活性較高的代謝物，如：異鼠李素具有較好的抗腫瘤、抗心肌缺氧、缺血，緩解心絞痛，抗心律失常，治療冠心病和高血壓，清除氧自由基，降低血清膽固醇，保護心血管，促進血流通暢等多種生物學(xué)效應(yīng)，廣泛應(yīng)用于臨床[17,18]；纖細(xì)薯蕷皂苷在抗腫瘤、抗菌、殺滅寄生蟲、溶血、降血脂、抗骨質(zhì)疏松、抗突變等方面也有一定的生理活性[19,20]。而異鼠李素與纖細(xì)薯蕷皂苷僅在來源于黃精PolygonatumsibiricumRed.這一物種表現(xiàn)出明顯差異上調(diào)。基于此，下一步可以食用黃精(水果黃精)為對照，探究來源于藥典收載的滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.、多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua以及地方可藥用黃精品種(如：四川南充、重慶秀山、湖南新化等地廣泛種植的大葉黃精)干燥塊莖為實驗組，基于廣泛靶向代謝組分析各比較組次生代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，進而結(jié)合特定類別代謝物的生物活性篩選出中藥黃精品質(zhì)相關(guān)代謝物，為正品黃精的品質(zhì)評價與質(zhì)量控制提供依據(jù)。

為了進一步驗證代謝組學(xué)篩選出的差異上調(diào)化合物的活性，本文結(jié)合黃精傳統(tǒng)功效健脾以及主治內(nèi)熱消渴證，以IR為疾病模型進行網(wǎng)絡(luò)藥理分析，通過KEGG通路分析的結(jié)果可以看出：異鼠李素、野漆樹苷、異野漆樹苷3種差異上調(diào)化合物于PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路、雌激素信號通路、AMPK等信號通路富集顯著性程度較高，通過對既往文獻進行查閱并分析可以發(fā)現(xiàn)：PI3K/AKT信號通路涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和葡萄糖代謝，而胰島素主要作用于肌肉、肝臟和脂肪組織，它通過與胰島素受體結(jié)合來激活PI3K/AKT信號通路，從而調(diào)控葡萄糖和脂肪代謝過程[21]；mTOR信號通路通過參與調(diào)控骨骼肌葡萄糖攝入量及胰島素抵抗，通路激活可提高胰島素敏感性，然而當(dāng)其過度激活時則會抑制胰島素的敏感性[22]；VEGFA作為VEGF信號通路的重要靶點蛋白，通過提高脂肪和肌肉中胰島素的敏感性來改善IR，進而控制血糖[23]；腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是調(diào)節(jié)機體能量代謝的重要物質(zhì)，研究表明多種天然化合物能激活A(yù)MPK，增強胰島素的敏感性，是改善胰島素抵抗的潛在靶點[24]。此外，黃精改善IR的作用靶點還可能通過作用于雌激素信號通路等相關(guān)通路，調(diào)節(jié)垂體-腎上腺軸及其他組織器官，直接或者間接起到了改善IR的作用[25]。以上研究結(jié)果與文獻報道單體成分異鼠李素治療糖尿病結(jié)果一致[26]。另通過分子對接技術(shù)進一步揭示黃精對改善IR的功效的作用機制，結(jié)果顯示PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路、雌激素信號通路、AMPK等信號通路關(guān)鍵靶點與異鼠李素、野漆樹苷、異野漆樹苷對接效果好，結(jié)合能均≤-20.9 kJ/mol。因此推測黃精活性成分與關(guān)鍵靶點的結(jié)合可能是黃精發(fā)揮治療IR的關(guān)鍵。通過進一步的細(xì)胞實驗驗證發(fā)現(xiàn)差異代謝物中異鼠李素可以有效改善HepG2細(xì)胞IR狀態(tài)，主要通過影響PI3K、AKT1、VEGF和mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果表明異鼠李素可以使IR HepG2細(xì)胞PI3K、AKT1蛋白表達水平升高，VEGF、mTOR蛋白表達水平降低。

綜上所述，本文通過廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)準(zhǔn)確、全面地鑒定了藥用與食用黃精中的次生代謝物，藥用黃精與食用黃精相比差異上調(diào)化合物異鼠李素等通過PI3K、AKT1、VEGFA和mTOR等核心靶點作用于PI3K、AKT1、VEGF和mTOR等信號通路起到了改善IR的目的，充分體現(xiàn)了中藥多成分-多靶點-多途徑的藥效特點。該研究結(jié)果為黃精活性成分的篩選與品質(zhì)評價奠定了基礎(chǔ)、為闡述黃精治療IR作用機制提供了依據(jù)。