墊狀卷柏中化學(xué)成分的分離及其抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性

蔡 蕊，于遠(yuǎn)洋，謝 寧，徐 強(qiáng)，萬(wàn)慧慧，王世盛,4*

1大連理工大學(xué)分析測(cè)試中心，大連 116024；2大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，大連 116081；3大連理工大學(xué)化工學(xué)院，大連 116024；4大連理工大學(xué)寧波研究院，寧波 315016

墊狀卷柏Selaginellapulvinata(Hook. & Grev.) Maxim．為卷柏科卷柏屬多年生草本植物，又名萬(wàn)年青、長(zhǎng)生草、九死還魂草等。卷柏屬植物在中國(guó)約有50余種，廣泛分布于廣西、遼寧、云南、福建、浙江、山東、吉林、湖南、陜西，河北等地?！侗静萸笳妗酚涊d其治有分生熟，生則微寒，力能破血通經(jīng)，故治癥瘕淋結(jié)等癥；炙則辛溫，能以止血，故治腸紅脫肛等癥[1,2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，墊狀卷柏具有清熱解毒、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、治療心血管疾病等作用[3,4]。墊狀卷柏主要成分有雙黃酮類、黃酮類、炔酚類、生物堿類、有機(jī)酸類等[5,6]，其中雙黃酮和炔酚類化合物是墊狀卷柏主要的活性成分，而且selaginellin類化合物是目前僅在墊狀卷柏屬植物中發(fā)現(xiàn)的新型炔酚骨架類化合物。因此，對(duì)墊狀卷柏中雙黃酮類和炔酚類化合物進(jìn)行純化，對(duì)其進(jìn)行深入藥理作用機(jī)制研究具有重要的意義。

由于selaginellin類及雙黃酮類化合物結(jié)構(gòu)相近，用常規(guī)的分離手段難以分離[7,8]。因此利用質(zhì)譜引導(dǎo)的自動(dòng)純化分離技術(shù)，通過(guò)質(zhì)譜對(duì)selaginellin類及雙黃酮類化合物的分子及碎片的分子量進(jìn)行檢出，然后將相應(yīng)的化合物進(jìn)行在線液相制備，同時(shí)結(jié)合減壓、常壓柱層析等手段，從墊狀卷柏95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分中，對(duì)雙黃酮和炔酚類化合物進(jìn)行選擇性分離，得到四個(gè)雙黃酮類化合物和七個(gè)selaginellin類化合物，通過(guò)化學(xué)和波譜數(shù)據(jù)確定了它們的結(jié)構(gòu)，并評(píng)價(jià)了這些化合物對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NSCLC)H322的體外增殖抑制活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters自動(dòng)分離純化系統(tǒng)(2767樣品管理器，2545二元梯度泵，2489紫外檢測(cè)器，515補(bǔ)償泵，系統(tǒng)流路管理器，SQD2質(zhì)譜，MassLynx 和 FractionLynx 操作系統(tǒng))；HPLC色譜柱：Unitary C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；制備液相色譜柱：Unitary C18(250 mm × 4.6 mm，10 μm)。EYELA N-3010、N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)；Milli-Q Direct16純水/超純水的一體化系統(tǒng)；Bruker Avance 400 MHz核磁共振儀；Agilent 1200型液相色譜儀。

薄層層析硅膠及柱層析硅膠(青島海洋化工有限公司)；HPLC所用水為超純水，甲醇為色譜甲醇(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，其余試劑均為分析純(西隴化工股份有限公司)；墊狀卷柏藥材2014

圖1 組分Ⅰ的制備液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of preparative-scale separation of Fr.I注：A、C：優(yōu)化前、后LC-UV圖；B、D：優(yōu)化前、后LC-MS圖，下同。Note:A and C:LC-UV chromatograms before and after optimization;B and D:LC-MS chromatograms before and after optimization,the same below.

年3月購(gòu)自安徽省亳州市龍輝藥業(yè)銷售有限公司，經(jīng)大連藥檢所鑒定為墊狀卷柏的干燥全草，樣本存放于大連理工大學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系。

1.2 提取與分離

干燥的墊狀卷柏粉末1 kg用95%乙醇5 000 mL回流提取2 h，提取2次，乙醇提取液濃縮干燥后得到浸膏69 g。浸膏加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，并分別濃縮，得到乙酸乙酯萃取層浸膏21 g。取乙酸乙酯部分16 g，經(jīng)減壓硅膠柱層析分離，二氯甲烷/甲醇梯度洗脫得到化合物1(89 mg)、化合物2(6 mg)及組分Ⅰ(90 mg)、組分Ⅱ(592 mg)、組分Ⅲ(417 mg)。

組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ分別用Waters自動(dòng)分離純化系統(tǒng)進(jìn)一步分離。樣品分析與制備所用流動(dòng)相均為甲醇-水體系。自動(dòng)純化系統(tǒng)色譜、質(zhì)譜條件：流速為1 mL/min，柱溫為23 ℃，分流比為1/1 000，補(bǔ)償液為質(zhì)譜級(jí)甲醇，補(bǔ)償液流速1 mL/min，以ESI源為離子化源進(jìn)行負(fù)模式檢測(cè)，毛細(xì)管電壓：3.0 kV，錐孔電壓：30 V，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣溫度：500 ℃，錐孔氣體流速：50 L/h，脫溶劑氣流速：1 000 L/h。

1.2.1 組分Ⅰ的分離純化

組分Ⅰ(54 mg)用甲醇溶解后，進(jìn)行制備LC-MS分析，流動(dòng)相為80%甲醇等度洗脫15 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm，ESI(-)模式下在保留時(shí)間6.98 min的色譜峰中，獲得的質(zhì)荷比m/z551信號(hào)(圖1A、1B)。針對(duì)性優(yōu)化制備色譜條件，選擇制備流動(dòng)相82%甲醇等度洗脫8 min(圖1C、1D)，收集保留時(shí)間為5.28 min的組分，得到化合物3(8 mg)。

1.2.2 組分Ⅱ的分離純化

組分Ⅱ(427 mg)甲醇溶解后進(jìn)行LC-MS分析。流動(dòng)相：65%～80%甲醇梯度洗脫15 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，在保留時(shí)間依次為4.47、5.92和11.38 min的色譜峰中，ESI(-)模式下依次獲得的質(zhì)荷比分別為m/z511、511、537信號(hào)(圖2A、2B)。針對(duì)性優(yōu)化制備色譜條件，制備液相色譜流動(dòng)相：60%～80%甲醇梯度洗脫15 min(圖2C、2D)，依次收集保留時(shí)間5.58、7.73、11.92 min的組分，得到化合物4(19 mg)、化合物5(17 mg)和化合物6(20 mg)。

圖2 組分II的制備液相色譜圖Fig.2 Chromatograms of preparative-scale separation of Fr.II

1.2.3 組分Ⅲ的分離純化

組分Ⅲ(298 mg)，甲醇溶解后進(jìn)行LC-MS分析。流動(dòng)相：75%～85%甲醇梯度洗脫12 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，在保留時(shí)間為5.18、6.15、6.85、7.83 和9.48 min的色譜峰中，ESI(-)模式下獲得的質(zhì)荷比分別為m/z509、555、509、481、495信號(hào)(圖3A、3B)。針對(duì)性優(yōu)化制備色譜條件，用75%甲醇等度洗脫14 min(圖3C、3D)，根據(jù)關(guān)注的MS信號(hào)，依次收集保留時(shí)間5.20、6.38、7.20、8.73和11.70 min的組分，分別得到化合物7(8 mg)、化合物8(6 mg)、化合物9(8 mg)、化合物10(17 mg)、化合物11(6 mg)。

圖3 組分III的制備液相色譜圖Fig.3 Chromatograms of preparative-scale separation of Fr.III

1.3 體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試

化合物1～11分別配成終濃度為100 μmol/L受試樣品母液(DMSO)，-4 ℃保存。采用MTT方法對(duì)上述化合物進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H322，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔8 000個(gè)細(xì)胞，體積為100 μL。37 ℃孵育，培養(yǎng)24 h，顯微鏡觀察，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，狀態(tài)正常。取終濃度為100 μmol/L的受試樣品母液，用含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液分別稀釋，濃度梯度為100、80、60、40、20 μmol/L。同時(shí)設(shè)置空白組(含培養(yǎng)液、無(wú)細(xì)胞)和對(duì)照組(培養(yǎng)細(xì)胞不加藥)，重復(fù)三次，采用MTT方法進(jìn)行活性測(cè)試[9]。抑制率計(jì)算公式如下：

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=

[1-(OD實(shí)驗(yàn)-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)]×100%

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0方法，用t檢驗(yàn)分析不同組間差異，P<0.05則視為差異顯著，用SPSS 13.0進(jìn)行IC50的計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品分析純化

制備高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離效率高，但是天然產(chǎn)物成分復(fù)雜，直接用乙醇提取物分離制備化合物單體較難實(shí)現(xiàn)。墊狀卷柏中的炔酚類化合物含量較低，且結(jié)構(gòu)差異很小，常規(guī)色譜方法分離效率極低。所以首先用石油醚萃取乙醇提取物，除去其中的脂溶性色素等雜質(zhì)，然后用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分經(jīng)LC-MS分析，主要成分的分子量為512、510、538、556、482、496、552。其中分子量為538的化合物，推測(cè)分子式是C30H18O10，經(jīng)查閱文獻(xiàn)與穗花杉雙黃酮的分子式相同。在此基礎(chǔ)上，分子量552的化合物，推測(cè)為分子量是538的雙黃酮類化合物中一個(gè)羥基被甲氧基取代而成。分子量為512的化合物，分子式為C34H24O5，與已報(bào)道的炔酚類化合物selaginellin分子式相同。在此基礎(chǔ)上，推測(cè)分子量為510的化合物，應(yīng)該是此類結(jié)構(gòu)中脫去-2H，增加一個(gè)不飽和度的結(jié)構(gòu)；分子量為556的化合物是在510的基礎(chǔ)上，結(jié)構(gòu)中原子數(shù)增加了C2H6O；分子量為482的化合物是在510的基礎(chǔ)上，分子量減少28，推測(cè)為脫去C2H4或CO；分子量為496的化合物是在510的基礎(chǔ)上，結(jié)構(gòu)中原子數(shù)減少了CH2形成的；故確定乙酸乙酯部分主要含有雙黃酮和炔酚類化合物。針對(duì)LC-MS分析發(fā)現(xiàn)的這兩類結(jié)構(gòu)的組分，通過(guò)減壓硅膠柱層析進(jìn)行分段，并采用質(zhì)譜引導(dǎo)的制備液相色譜對(duì)組分I～I(xiàn)II進(jìn)行精細(xì)分離，快速高效得到雙黃酮及炔酚類化合物1～11。

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

分離得到的化合物1～11，均通過(guò)HPLC確定純度，化合物1～11的純度分別為：98.0%、87.6%、89.2%、99.6%、99.7%、99.2%、93.6%、68.2%、92.6%、98.4%、98.7%。經(jīng)MS及NMR數(shù)據(jù)分析，鑒定了11個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。

化合物1土黃色固體；ESI-MS：m/z537[M-H]-，分子式為C30H18O10。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.02(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′/6′)，7.98(2H，d，J=8.8 Hz，H-2?/6?)，7.04(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′/5′)，6.95(2H，d，J=8.8 Hz，H-3?/5?)，6.87(2H，s，H-3/3″)，6.74(1H，s，H-8″)，6.49(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：164.2(C-2)，103.8(C-3)，181.8(C-4)，160.6(C-5)，98.9(C-6)，163.1(C-7)，94.6(C-8)，157.1(C-9)，103.9(C-10)，124.2(C-1′)，128.3(C-2′/6′)，115.3(C-3′/5′)，161.3(C-4′)，164.2(C-2″)，102.6(C-3″)，182.1(C-4″)，153.1(C-5″)，124.7(C-6″)，157.4(C-7″)，94.0(C-8″)，153.7(C-9″)，104.2(C-10″)，121.1(C-1?)，128.6(C-2?/6?)，116.0(C-3?/5?)，161.4(C-4?)。經(jīng)與文獻(xiàn)[10]對(duì)照，鑒定化合物1為扁柏雙黃酮(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4)。

化合物2土黃色無(wú)定型粉末；ESI-MS：m/z551[M-H]-，分子式為C31H20O10。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.02(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′/6′)，8.01(2H，d，J=8.8 Hz，H-2?/6?)，7.13(1H，s，H-8″)，7.04(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′/5′)，6.96(2H，d，J=8.8 Hz，H-3?/5?)，6.94(1H，s，H-3)，6.86(1H，s，H-3″)，6.49(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，3.89(3H，s，7″-OCH3)。經(jīng)與文獻(xiàn)[11]對(duì)照，鑒定化合物2為異柳杉雙黃酮。

化合物3黃色無(wú)定型粉末；ESI-MS：m/z551[M-H]-，分子式為C31H20O10。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：8.08(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，8.03(1H，dd，J=8.4，2.4 Hz，H-6′)，7.65(2H，d，J=8.8 Hz，H-2?/6?)，7.24(1H，d，J=8.8 Hz，H-5′)，6.83(2H，d，J=8.8 Hz，H-3?/5?)，6.71(1H，s，H-3)，6.67(1H，s，H-3″)，6.60(1H，s，H-6″)，6.52(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.25(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，3.92(3H，s，7″-OCH3)。經(jīng)與文獻(xiàn)[12]對(duì)照，鑒定化合物3為蘇鐵雙黃酮。

化合物4黃色粉末；ESI-MS：m/z537[M-H]-，分子式為C30H18O10。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：8.13(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，8.03(1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-6′)，7.65(2H，d，J=8.8 Hz，H-2?/6?)，7.25(1H，d，J=8.8 Hz，H-5′)，6.83(2H，d，J=8.8 Hz，H-3?/5?)，6.73(1H，s，H-3)，6.66(1H，s，H-3″)，6.45(1H，s，H-6″)，6.52(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.24(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：163.4(C-2)，104.4(C-3)，183.5(C-4)，160.3(C-5)，99.8(C-6)，99.8(C-8)，165.1(C-7)，158.9(C-9)，104.4(C-10)，123.4(C-1′)，132.7(C-2′)，123.5(C-3′)，161.8(C-4′)，117.6(C-5′)，128.9(C-6′)，164.9(C-2″)，103.8(C-3″)，183.1(C-4″)，94.8(C-6″)，158.9(C-5″)，162.6(C-7″)，105.4(C-8″)，156.2(C-9″)，105.6(C-10″)，120.9(C-1?)，129.2(C-2?/6?)，116.8(C-3?/5?)，162.8(C-4?)。經(jīng)與文獻(xiàn)[13]對(duì)照，鑒定化合物4為穗花杉雙黃酮。

化合物5紫紅色粉末；ESI-MS：m/z511[M-H]-，分子式為C34H24O5。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-16)，7.36(1H，d，J=8.0 Hz，H-17)，7.14(2H，d，J=8.6 Hz，H-3/5)，7.14(2H，d，J=8.6 Hz，H-8/12)，7.08(2H，d，J=8.4 Hz，H-28/32)，6.86(2H，d，J=8.4 Hz，H-20/24)，6.74(2H，d，J=8.4 Hz，H-29/31)，6.64(2H，d，J=8.4 Hz，H-21/23)，6.52(2H，d，J=8.6 Hz，H-2/6)，6.52(2H，d，J=8.6 Hz，H-9/11)，5.00(2H，s，H-34)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：173.5(C-1)，122.2(C-2/6)，137.2(C-3/5)，131.3(C-4)，160.4(C-7)，137.2(C-8/12)，122.2(C-9/11)，173.5(C-10)，131.3(C-13)，122.5(C-14)，143.4(C-15)，127.8(C-16)，130.5(C-17)，142.1(C-18)，141.8(C-19)，130.7(C-20/24)，115.5(C-21/23)，157.5(C-22)，132.5(C-25)，84.7(C-26)，99.8(C-27)，133.9(C-28/32)，116.4(C-29/31)，159.0(C-30)，114.3(C-33)，63.0(C-34)。經(jīng)與文獻(xiàn)[14]對(duì)照，鑒定化合物5為selaginellin。

化合物6紅色粉末；ESI-MS：m/z511[M-H]-，分子式為C34H24O5。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.75(1H，d，J=7.8 Hz，H-17)，7.67(1H，d，J=8.2 Hz，H-24)，7.59(1H，d，J=7.8 Hz，H-16)，7.16(2H，d，J=8.7 Hz，H-3/5)，7.16(2H，d，J=8.7 Hz，H-8/12)，6.99(2H，d，J=8.6 Hz，H-28/32)，6.84(1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-23)，6.81(2H，d，J=8.6 Hz，H-29/31)，6.80(1H，d，J=2.0 Hz，H-21)，6.67(2H，d，J=8.7 Hz，H-2/6)，6.67(2H，d，J=8.7 Hz，H-9/11)，4.83(2H，s，H-34)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：156.8(C-1/10)，115.1(C-2/6)，131.0(C-3/5)，134.7(C-4/13)，65.7(C-7)，131.0(C-8/12)，115.1(C-9/11)，119.6(C-14)，142.8(C-15)，126.7(C-16)，119.4(C-17)，140.6(C-18)，152.8(C-19)，157.2(C-20)，113.3(C-21)，158.7(C-22)，115.5(C-23)，121.4(C-24)，131.7(C-25)，85.2(C-26)，102.0(C-27)，133.4(C-28/32)，116.4(C-29/31)，158.7(C-30)，115.2(C-33)，63.1(C-34)。經(jīng)與文獻(xiàn)[15]對(duì)照，鑒定化合物6為selaginpulvilin A。

化合物7黃色粉末；ESI-MS：m/z509[M-H]-，分子式為C34H22O5。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.92(1H，d，J=8.0 Hz，H-16)，7.89(1H，d，J=8.0 Hz，H-17)，7.82(1H，d，J=8.3 Hz，H-24)，7.18(2H，d，J=8.8 Hz，H-3/5)，7.18(2H，d，J=8.8 Hz，H-8/12)，7.03(2H，d，J=8.7 Hz，H-28/32)，6.91(1H，dd，J=8.3，2.2 Hz，H-23)，6.85(1H，d，J=2.2 Hz，H-21)，6.82(2H，d，J=8.7 Hz，H-29/31)，6.70(2H，d，J=8.8 Hz，H-2/6)，6.70(2H，d，J=8.8 Hz，H-9/11)，10.54(1H，s，H-34)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：157.1(C-1/10)，115.3(C-2/6)，131.0(C-3/5)，133.8(C-4/13)，65.8(C-7)，131.0(C-8/12)，115.3(C-9/11)，125.3(C-14)，134.8(C-15)，128.1(C-16)，119.6(C-17)，147.7(C-18)，153.8(C-19)，158.9(C-20)，113.3(C-21)，160.3(C-22)，116.2(C-23)，123.1(C-24)，130.4(C-25)，83.5(C-26)，104.6(C-27)，133.8(C-28/32)，116.5(C-29/31)，159.4(C-30)，114.2(C-33)，191.3(C-34)。經(jīng)與文獻(xiàn)[15]對(duì)照，鑒定化合物7為selaginpulvilin B。

化合物8紅色粉末；ESI-MS：m/z509[M-H]-，分子式為C34H20O5。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：10.70(1H，s，H-34)，8.02(1H，d，J=8.0 Hz，H-16)，7.50(1H，d，J=8.0 Hz，H-17)，7.17(2H，m，H-3/5)，7.17(2H，m，H-8/12)，7.17(2H，m，H-28/32)，6.94(2H，d，J=8.4 Hz，H-20/24)，6.76(2H，d，J=8.6 Hz，H-29/31)，6.68(2H，d，J=8.4 Hz，H-21/23)，6.51(2H，d，J=8.6 Hz，H-2/6)，6.51(2H，d，J=8.6 Hz，H-9/11)。經(jīng)與文獻(xiàn)[14]對(duì)照，鑒定化合物8為selaginellin O。

化合物9紅色粉末；ESI-MS：m/z555[M-H]-，分子式為C36H28O4。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.74(1H，d，J=8.0 Hz，H-16)，7.36(1H，d，J=8.0 Hz，H-17)，7.12(2H，m，H-3/5)，7.12(2H，m，H-8/12)，7.12(2H，m，H-28/32)，6.87(2H，d，J=8.4 Hz，H-20/24)，6.75(2H，d，J=8.4 Hz，H-29/31)，6.65(2H，d，J=8.4 Hz，H-21/23)，6.52(2H，d，J=8.6 Hz，H-2/6)，6.52(2H，d，J=8.6 Hz，H-9/11)，5.86(1H，s，H-34)，3.48(6H，s，OCH3)。經(jīng)與文獻(xiàn)[16]對(duì)照，鑒定化合物9為selaginellin E。

化合物10紫紅色粉末；ESI-MS：m/z481[M-H]-，分子式為C33H22O4。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.64(1H，d，J=8.0 Hz，H-15)，7.54(1H，t，J=7.6 Hz，H-16)，7.34(1H，d，J=8.0 Hz，H-17)，7.13(2H，d，J=8.6 Hz，H-3/5)，7.13(2H，d，J=8.6 Hz，H-8/12)，7.06(2H，d，J=8.4 Hz，H-28/32)，6.86(2H，d，J=8.4 Hz，H-20/24)，6.73(2H，d，J=8.4 Hz，H-29/31)，6.64(2H，d，J=8.4 Hz，H-21/23)，6.52(2H，d，J=8.6 Hz，H-2/6)，6.52(2H，d，J=8.6 Hz，H-9/11)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：157.7(C-1/10)，122.3(C-2/6)，137.1(C-3/5)，131.1(C-4)，132.5(C-7)，137.1(C-8/12)，122.3(C-9/11)，131.1(C-13)，125.6(C-14)，131.1(C-15)，130.0(C-16)，130.8(C-17)，144.0(C-18)，142.0(C-19)，130.7(C-20/24)，115.6(C-21/23)，159.0(C-22)，115.6(C-25)，87.4(C-26)，94.5(C-27)，134.0(C-28/32)，116.3(C-29/31)，159.7(C-30)，114.3(C-33)。經(jīng)與文獻(xiàn)[17]對(duì)照，鑒定化合物10為selaginellin A。

化合物11紅色粉末；ESI-MS：m/z495[M-H]-，分子式為C34H24O4。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.45(1H，d，J=8.0 Hz，H-16)，7.23(1H，d，J=8.0 Hz，H-17)，7.13(2H，d，J=9.2 Hz，H-3/5)，7.13(2H，d，J=9.2 Hz，H-8/12)，7.09(2H，d，J=8.6 Hz，H-28/32)，6.85(2H，d，J=8.6 Hz，H-20/24)，6.73(2H，d，J=8.6 Hz，H-29/31)，6.63(2H，d，J=8.4 Hz，H-21/23)，6.50(2H，d，J=9.2 Hz，H-2/6)，6.50(2H，d，J=9.2 Hz，H-9/11)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：157.5(C-1/10)，122.3(C-2/6)，137.0(C-3/5)，131.2(C-4)，132.6(C-7)，137.0(C-8/12)，122.3(C-9/11)，131.2(C-13)，125.1(C-14)，139.3(C-15)，130.4(C-16)，131.0(C-17)，142.1(C-18)，141.2(C-19)，130.7(C-20/24)，115.5(C-21/23)，158.9(C-22)，115.5(C-25)，87.4(C-26)，94.5(C-27)，133.9(C-28/32)，116.3(C-29/31)，159.9(C-30)，114.6(C-33)，21.2(C-34)。經(jīng)與文獻(xiàn)[17]對(duì)照，鑒定化合物11為selaginellin B。

圖4 化合物1～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of compound 1～11

2.3 抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性

采用MTT法測(cè)定化合物1～11體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，結(jié)果如表1所示。

表1 化合物1～11對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H322細(xì)胞抑制作用結(jié)果

IC50結(jié)果顯示，化合物4和7對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H322細(xì)胞抑制活性較低，其余化合物均有較好的抑制活性，尤其是化合物3(蘇鐵雙黃酮)和10(selaginellin A)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H322細(xì)胞抑制活性最強(qiáng)，顯示此兩類結(jié)構(gòu)的化合物具有潛在的抗腫瘤應(yīng)用前景。據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道，炔酚類化合物(selaginellin A)具有抑制細(xì)胞增殖活性，其中對(duì)U251、Hela以及MCF-7細(xì)胞系的IC50值分別約為56、47、102 μmol/L，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，炔酚類化合物對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H322細(xì)胞抑制作用更強(qiáng)。

3 結(jié)論

利用質(zhì)譜引導(dǎo)的PHPLC-MS分離技術(shù)，結(jié)合減壓、常壓柱層析等手段，對(duì)墊狀卷柏中的雙黃酮類和炔酚類化合物進(jìn)行了選擇性制備分離，得到了四個(gè)雙黃酮類化合物(1～4)和七個(gè)炔酚類化合物(5～11)，該方法可快速、高效地得到高純度的雙黃酮類和炔酚類化合物。抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，這些天然化合物對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H322細(xì)胞均有較好的增殖抑制活性，其中化合物3和10的IC50值分別為16.70 μmol/L和9.54 μmol/L。雙黃酮及炔酚類化合物在抗腫瘤及抑制COX-2等方面都顯示出較強(qiáng)的活性[19]，炔酚類化合物顯示出對(duì)氟康唑、酮康唑的抗念珠菌活性的體外增效作用[20]。因此,本文制備得到的化合物具備進(jìn)一步研究及結(jié)構(gòu)改造的價(jià)值。尤其是炔酚類結(jié)構(gòu)目前僅在卷柏屬植物中發(fā)現(xiàn)，建立的快速制備方法，也為墊狀卷柏中雙黃酮及炔酚類化合物的快速及規(guī)?；蛛x純化提供了有效的手段。