急性腦卒中患者外周血miRNA-602水平動(dòng)態(tài)變化及臨床意義*

高 偉

福建省福州市第一醫(yī)院神經(jīng)外科 350009

MicroRNA(miRNA)是一種由18～25個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA。經(jīng)內(nèi)切酶作用后，一部分miRNA靶向調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄物，進(jìn)而調(diào)控下游RNA水平和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)[1]。每個(gè)miRNA可以針對(duì)多個(gè)下游基因。同時(shí)，也可由多個(gè)miRNA調(diào)控一個(gè)靶基因，這樣便形成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)并準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)功能基因的表達(dá)[2]。已有許多研究發(fā)現(xiàn)[3]，血漿miRNA水平的變化與心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。有研究者在基于人群的前瞻性研究中確定了循環(huán)miRNAs與所有卒中類型發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行了后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)了多種miRNAs可能在腦卒中的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。miRNA-602是一種非組織特異性miRNA，有研究表明miRNA-602在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中發(fā)揮著重要作用[5]，但有關(guān)miRNA-602在腦卒中的作用研究較少。因此，本研究探討了急性腦卒中患者外周血miRNA-602水平動(dòng)態(tài)變化及臨床意義，以期為腦卒中患者的早期防治提供更多依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016年1月—2020年1月我院收治的80例急性腦卒中患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)影像學(xué)手段確診為腦卒中；(2)從卒中發(fā)作到入院的時(shí)間<6h；(3)年齡30～80歲；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)院內(nèi)死亡患者；(2)非首次發(fā)作，曾有腦卒中史；(3)合并其他重要器官的嚴(yán)重疾病，如嚴(yán)重心力衰竭、COPD等；(4)合并惡性腫瘤。同時(shí)，選擇同期在我院行體檢的80名健康志愿者為對(duì)照組。病例組中男52例，平均年齡(60.5±9.8)歲，女28例，平均年齡(61.3±8.7)歲；對(duì)照組中男49例，平均年齡(61.5±9.2)歲，女31例，平均年齡(62.3±10.5)歲。兩組年齡、性別資料比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，有可比性。

1.2 RT-PCR檢測(cè) 所有受試者經(jīng)肘靜脈采集靜脈血5ml，并立即離心。上清液轉(zhuǎn)移到無(wú)核糖核酸酶的EP管中，保存于-80℃冰箱。從血漿中提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定RNA完整性。miRNA-602引物序列為上游5’-TTCGGGTGTGTGAGTGTTTCC-3’，下游5’-TGTCGGTACATTGTTGTGGA-3’。GAPDH引物序列為上游5’-GGAAGAGAGTCCTAGAGGG-3’，下游5’-GGGCTGGAAGACAAAGGTG-3’。RT-PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10min，然后95℃變性30s，50℃退火30s，40個(gè)循環(huán)，最后70℃延伸10min結(jié)束。

1.3 臨床資料收集 以患者入院后首次血液學(xué)檢查為基線資料，包括患者記錄中的血小板計(jì)數(shù)和HDL-C水平。通過(guò)電子病歷系統(tǒng)收集患者的基線資料，包括年齡、性別、身高、體重、既往病史(高血壓病史、高脂血癥、糖尿病病史等)及腦出血量。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS量表)評(píng)判患者腦卒中后的神經(jīng)缺損程度。量表包含對(duì)意識(shí)、語(yǔ)言、運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、共濟(jì)運(yùn)動(dòng)、眼球運(yùn)動(dòng)、視野等方面的評(píng)判，評(píng)分為0～42分，分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)缺損程度越嚴(yán)重。NIHSS評(píng)分≤4分為輕型卒中，4分

1.4 隨訪 利用電話或門診復(fù)查對(duì)患者進(jìn)行隨訪。門診隨訪檢查項(xiàng)目包括體格檢查、血液檢查和腦部CT掃描，出院后前6個(gè)月，每個(gè)月都進(jìn)行隨訪，之后每3～6個(gè)月隨訪1次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0和 GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。生存評(píng)估采用Kaplan-Meier分析，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，并確定曲線下面積(AUC)。

2 結(jié)果

2.1 腦卒中患者與健康人群外周血miRNA-602水平比較 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，病例組、對(duì)照組外周血miRNA-602相對(duì)表達(dá)水平分別為(26.74±3.52)、(5.52±1.03)，病例組顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miRNA-602水平與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 病例組患者中位miRNA-602水平為(25.68±2.41)，以中位值為標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為miRNA-602高表達(dá)組(n=40)與miRNA-602低表達(dá)組(n=40)。χ2檢驗(yàn)顯示，miRNA-602水平與患者HDL-C水平、出血量及NIHSS評(píng)分顯著相關(guān)(P<0.05)，患者HDL-C表達(dá)水平越低、出血量及NIHSS評(píng)分越高，miRNA-602相對(duì)表達(dá)水平也越高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 miRNA-602不同表達(dá)水平與患者病理參數(shù)的相關(guān)性

2.3 miRNA-602水平與患者生存的相關(guān)性 隨訪至6個(gè)月時(shí)，19例患者死亡，總體生存率為76.25%(61/80)。存活組、死亡組患者的miRNA-602相對(duì)表達(dá)水平分別為(3.62±0.87)、(30.52±6.78)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。生存曲線顯示，miRNA-602低表達(dá)組患者的6個(gè)月生存率顯著好于miRNA-602高表達(dá)組(χ2=3.658,P=0.012)。

2.4 miRNA-602水平對(duì)患者生存的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線顯示，血清miRNA-602對(duì)患者預(yù)后預(yù)測(cè)的靈敏度為67.8%，特異度為52.2%，AUC為0.66，這表明血清miRNA-602表達(dá)水平對(duì)腦卒中患者預(yù)有后較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。見(jiàn)圖1。

圖1 miRNA-602水平對(duì)患者生存的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

腦血管病是世界上最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，其發(fā)病率在越來(lái)越年輕的低收入人群中迅速上升。腦卒中是一種急性腦血管病，可導(dǎo)致局部神經(jīng)系統(tǒng)突然受損[6]。其發(fā)生和修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜多變的動(dòng)態(tài)過(guò)程，受炎癥、血管生成、缺血再灌注損傷等多種生理病理因素的影響，但目前臨床尚無(wú)有效的藥物提前預(yù)防或治療缺血性腦卒中。

miRNA幾乎參與所有已知的生物調(diào)節(jié)過(guò)程，如細(xì)胞分化、凋亡等，其作用非常廣泛，miRNA作為一種生物標(biāo)記物在人類循環(huán)血液系統(tǒng)中高度表達(dá)[7]。最新的研究表明，miRNA異常表達(dá)與腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)[8]，miR-148b、miR-27a、miR-29、miR-137等多種miRNA在腦卒中患者中表達(dá)顯著下調(diào)，而miR-497、miR-215、miR-324-3p等多種miRNA表達(dá)顯著上調(diào)。miRNA-602是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，在各種疾病中都有異常表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，病例組外周血miRNA-602相對(duì)表達(dá)水平表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。這表明，miRNA-602可能在腦卒中患者的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦卒中進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵因素，可導(dǎo)致毒性酶的激活、自由基超載等[9]。由于炎癥細(xì)胞的激活和釋放以及炎癥細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)引起腦組織結(jié)構(gòu)的改變。有研究表明，在應(yīng)激條件下，炎癥反應(yīng)加劇，炎癥介質(zhì)如IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2和IL-10在腦卒中損傷中起重要作用，而miRNA在炎癥過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

2017年1月，中國(guó)腦卒中學(xué)組經(jīng)過(guò)嚴(yán)格分層抽樣的全國(guó)疾病監(jiān)測(cè)點(diǎn)開(kāi)展，按照腦卒中患病率約1%的抽樣估算，確定調(diào)查人群60萬(wàn)人，結(jié)果顯示，腦卒中死亡率為127.2/10萬(wàn)，加權(quán)率為85.9/10萬(wàn)，農(nóng)村地區(qū)為116.8/10萬(wàn)，顯著高于城市居民的74.9/10萬(wàn)[10]。在本研究中，隨訪至6個(gè)月時(shí)，19例患者死亡，總體生存率為76.25%(61/80)。存活組、死亡組患者的miRNA-602相對(duì)表達(dá)水平分別為(3.62±0.87)、(30.52±6.78)。生存曲線顯示，miRNA-602低表達(dá)組患者的6個(gè)月生存率顯著好于miRNA-602高表達(dá)組。這表明，miRNA-602高表達(dá)可作為預(yù)測(cè)腦卒中患者預(yù)后不良的可靠指標(biāo)。

綜上所述，血清miRNA-602表達(dá)水平對(duì)腦卒中患者預(yù)后有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。但本文為單中心研究，且樣本量較小，未來(lái)在多中心聯(lián)合的基礎(chǔ)上，實(shí)施更大樣本量的研究，或能得出更具說(shuō)服力的證據(jù)。