羊肚菌胞外多糖液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化及其體外降血糖活性

林 杉，趙 萍，付云娜，劉 冰，馮佩瑤，李浩哲，夏興興

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730050）

羊肚菌（）屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）、盤菌綱（Discomycete）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellacea）、羊肚菌屬（）。羊肚菌是我國境內(nèi)十分珍稀的食藥用菌種之一，有“食用菌皇后”的美稱。羊肚菌多糖（polysaccharide）是從羊肚菌子實體、菌絲體或發(fā)酵液中分離出的一類天然活性產(chǎn)物，具有廣泛的藥理活性。近年來羊肚菌多糖因其保健功能良好而成為研究熱點，如羊肚菌多糖可以通過清除自由基、提高抗氧化酶活性，對機體起到免疫調(diào)節(jié)作用。

糖尿病主要是由于胰島素的顯著缺乏和胰島素抵抗而產(chǎn)生的，最主要的病理表現(xiàn)是血液中葡萄糖含量高，血液中過量的葡萄糖會降低細胞對葡萄糖的吸收和利用效率。明建等發(fā)現(xiàn)羊肚菌子實體多糖對高脂小鼠的血清甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和動脈粥樣硬化指數(shù)（AI）等指標有顯著的降低作用，從而證明了羊肚菌多糖對于高血脂癥、冠心病、動脈硬化等疾病的發(fā)生有一定的預防作用。

現(xiàn)階段，羊肚菌野生資源有限，人工栽培條件探究仍不清晰，液態(tài)深層發(fā)酵技術仍然是羊肚菌擴大規(guī)模培養(yǎng)的一個很好選擇。已有研究發(fā)現(xiàn)深層發(fā)酵培養(yǎng)羊肚菌具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)勢，可以得到大量的羊肚菌胞外多糖。且菌絲體發(fā)酵胞外多糖生產(chǎn)周期短、方便易得，現(xiàn)研究對三地羊肚菌菌株和羊肚菌胞外多糖降血糖評價鮮有報道。

因此，本研究在單因素實驗基礎上，首次通過Box-Behnken 響應面方法優(yōu)化液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)三地羊肚菌菌株胞外多糖的培養(yǎng)基配方，分離提取發(fā)酵液中羊肚菌胞外粗多糖（extracellular polysaccharides，MEP），評價其體外降血糖活性，為開發(fā)羊肚菌相關保健食品、加強羊肚菌多糖類的應用，改善羊肚菌的科學和綜合利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌 由蘭州理工大學生命科學與工程學院趙萍老師課題組分離純化得到，經(jīng)鑒定為三地羊肚菌（KT819369.1）；瓊脂、尿素、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鈉 天津大茂化學試劑廠；氫氧化鈉 天津益仁達化工有限公司；葡萄糖天津市致遠化學試劑有限公司；濃硫酸、苯酚 天津市富宇精細化工有限公司；-淀粉酶（2000 U/g）、-葡萄糖苷酶（300000 U/g） 源葉生物；A832719 阿卡波糖水合物 98%，上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯--D-葡萄糖（4-nitrophenyl-D-glucopyranoside，PNPG） 上海阿拉丁試劑有限公司；馬鈴薯、紅糖、玉米粉、黃豆粉 市售；所有試劑 均為分析純。

DHP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海恒一科學儀器有限公司；FA2004 電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；YX280B 壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；SHZ-82 恒溫振蕩器 上海賀帆儀器有限公司；TG22-WS 臺式高速離心機 上海秉越電子儀器有限公司；RE52-86A 旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Cary50 紫外分光光度計 美國瓦里安公司；680 i-Mark 酶標儀 美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊肚菌液態(tài)搖瓶培養(yǎng)

1.2.1.1 培養(yǎng)基配制 基礎培養(yǎng)基：采用PDA 培養(yǎng)基，具體配方：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水至1000 mL。液態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯碎丁，煮軟后濾去殘渣，加葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.25 g，水1000 mL。

1.2.1.2 菌株活化 將高壓滅菌后的PDA 固態(tài)培養(yǎng)基傾倒到培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，從冰箱中取出保藏的三地羊肚菌菌株，挑取菌絲接到基礎培養(yǎng)基上，24 ℃培養(yǎng)7 d，待菌絲長滿平面。經(jīng)5 次如上操作，完成菌種活化。

1.2.1.3 搖瓶培養(yǎng) 取250 mL 三角瓶，每瓶裝入100 mL 液態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，經(jīng)120 ℃、121 kPa 滅菌30 min。將活化后的菌塊接種三角瓶中，26 ℃，150 r/min 條件下進行搖瓶培養(yǎng)。

1.2.2 羊肚菌胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實驗 取250 mL 三角瓶21 個，分7 組，每瓶裝入100 mL 基礎培養(yǎng)基，其他條件保持不變。按（A）紅糖添加量：1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 g/L；（B）玉米粉添加量：1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 g/L；（C）黃豆粉添加量：1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 g/L；（D）葡萄糖添加量：1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 g/L；（E）硫酸銨添加量：2.6、2.8、3.0、3.2、3.4 g/L；（F）蛋白胨添加量：1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 g/L 和（G）尿素添加量：2.6、2.8、3.0、3.2、3.4 g/L 的比例加入分裝好的培養(yǎng)基中，將活化后的菌落塊接入120 ℃、121 kPa 滅菌30 min 的培養(yǎng)基中，26 ℃，150 r/min 條件下進行搖瓶培養(yǎng)。具體發(fā)酵操作同1.2.1。

1.2.2.2 Plackett-Burman 試驗 在單因素實驗基礎上，對發(fā)酵培養(yǎng)基中的7 種成分進行研究。每個因素取高（+1）、低（-1）兩個水平（見表1），以胞外多糖含量為響應值，進行Plackett-Burman 試驗。具體發(fā)酵操作同1.2.1。

我被她說服了。因為是同代人，很容易理解各自的苦衷。更重要的是，這次交談使我學會了換位思考。如果你試著站在大媽們的立場上去思考一下，或許就會理解當今老年婦女內(nèi)心的酸甜苦辣，甚至會對她們?nèi)倘柝撝?、甘于奉獻，苦苦支撐著一個個家庭的毅力、韌性和無私，寄予無限同情和敬意了。做兒女的想過嗎，母親們多半輩子都在操勞，與其責怪她們，何不平時善待她們，有空多帶她們到各處走一走看一看？見多識廣，走過了、見過了、嘗過了，她們還會少見多怪么？

表1 羊肚菌胞外多糖Plackett-Burman 試驗設計與水平Table 1 Plackett-Burman experiment design and level of exopolysaccharide in Morchella

1.2.2.3 Box-Behnken 響應面設計試驗 在單因素實驗的基礎上，于100 mL 的液態(tài)培養(yǎng)基中接入菌種，搖瓶培養(yǎng)6 d，根據(jù)Box-Behnken 中心組合設計的原理，采用Design-Expert 8.0.6 分析軟件設計對紅糖、尿素、玉米粉進行三因素三水平的響應面分析試驗，以此來確定獲得胞外多糖的最佳的條件。以紅糖添加量（1.8、2.0、2.2 g/L）、玉米粉添加量（2.0、2.4、2.8 g/L）、尿素添加量（3.0、3.2、3.4 g/L）為自變量，胞外多糖含量為響應值，設計水平見表2。

表2 羊肚菌胞外多糖Box-Behnken 試驗的因素和水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment of exopolysaccharides from Morchella

1.2.2.4 多糖含量測定 采用苯酚硫酸法測定。首先對進行葡萄糖標準曲線測定。配制出濃度為0.01 mg/mL 的葡萄糖標準溶液，取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 該標準液于5 支試管中，加入蒸餾水使試管溶液達0.5 mL，再分別加入5%的0.5 mL 苯酚和2.5 mL 濃HSO，振蕩混勻，室溫下靜置20 min。在分光光度計490 nm 波長處測定吸光值，以葡萄糖濃度為X 軸，吸光值為Y 軸，繪制葡萄糖標準曲線。苯酚硫酸法測定葡萄糖標準曲線為y=0.1099x-0.156（=0.9971）。羊肚菌發(fā)酵液多糖含量：通過測定吸光值，比對標準曲線得到羊肚菌發(fā)酵液中多糖含量，具體操作同標準曲線方法測定。

1.2.3 體外降血糖活性測定

1.2.3.1 羊肚菌胞外粗多糖的制備 收集液態(tài)發(fā)酵后得到的發(fā)酵液，4200 r/min，20 min 離心取上清液，旋轉蒸發(fā)至原體積1/10，加入3 倍體積無水乙醇，4 ℃條件下靜止24 h，沉淀多糖。加無水乙醇，4200 r/min，20 min 條件下離心充分洗滌沉淀，直至沉淀無色，凍干得到羊肚菌胞外粗多糖，將得到粗多糖復溶，Sevag 法除蛋白，考馬斯亮藍法和紫外檢測至無蛋白。再次醇沉、離心，加蒸餾水復溶，冷凍干燥得到羊肚菌胞外粗多糖（extracellular polysaccharides，MEP）。將多糖用去離子水復溶，制成0.1、0.25、0.50、0.75 和1.0 mg/mL 的多糖溶液。

1.2.3.2-淀粉酶抑制活性 37 ℃條件下，將0.4 mL的-淀粉酶（2 U/mL）溶液與0.2 mL 多糖溶液混合10 min。加0.3 mL 的淀粉溶液（5%），反應10 min，加入2 mL 的DNS 試劑，并沸水浴加熱15 min。冷卻后，在540 nm 處測量吸光度，阿卡波糖作陽性對照。

-淀粉酶抑制活性的計算如下：

式中：A為樣品溶液；A為空白對照（水）；A為磷酸鹽緩沖液+樣品；A為水+磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖溶液（pH6.8）配制：取7.2 g 磷酸二氫鈉和0.68 g 氫氧化鈉，加水定容至1 L。

1.2.3.3-葡萄糖苷酶抑制活性 37 ℃條件下，100 μL-葡萄糖苷酶溶液（0.5 U/mL）添加到50 μL 的樣品溶液中，反應10 min 后再加入100 μL PNPG（5 mmol/L），反應20 min。加入1 mL NaCO溶液（1 mol/L）終止反應，波長405 nm 下測吸光度，阿卡波糖作對照，并使用以下公式計算-葡萄糖苷酶的抑制率：

式中：A為PNPG 溶液+樣品；A為空白對照（水）；A為磷酸鹽緩沖液+樣品；A為水+磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖溶液配制同1.2.3.2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

有效數(shù)據(jù)均用三組平行實驗的平均值表示，用SPSS Statistics 21、OriginPro 2019b、Design-Expert 8.0.6 等軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌胞外多糖液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結果

2.1.1 單因素實驗結果 羊肚菌胞外多糖是羊肚菌生長發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生的重要活性物質(zhì)。不同含量添加物對胞外多糖含量的影響存在一定差異。隨著不同物質(zhì)的添加量的增加，胞外多糖含量均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。如圖1 所示，不同物質(zhì)的最佳添加量分別為：紅糖2.0 g/L、玉米粉2.4 g/L、黃豆粉1.2 g/L、葡萄糖2.0 g/L、硫酸銨3.2 g/L、蛋白胨2.4 g/L 以及尿素3.2 g/L。可能是因為在如上條件下，培養(yǎng)基達到最合適的碳氮比，對羊肚菌胞外多糖的生成有促進作用。如金朝霞等在對羊肚菌液態(tài)發(fā)酵進行碳源篩選時，發(fā)現(xiàn)當玉米粉、黃豆粉添加量為2%時，羊肚菌菌絲體、胞外多糖含量均為最高，與本實驗結果相符。因此選擇單因素實驗中的最佳添加濃度進行Plackett-Burman 分析。

圖1 不同添加物濃度對羊肚菌胞外多糖的影響Fig.1 Effects of different contents of additives on exopolysaccharides from Morchella

2.1.2 Plackett-Burman 試驗 根據(jù)單因素實驗得到的最佳添加量，確定每個因素的高（+1）、低水平（-1）。Plackett-Burman 分析結果表明（表3），根據(jù)值，對胞外多糖影響最顯著的三個因子依次是A＞B＞E，即紅糖＞玉米粉＞尿素，確定這三個因素進行下一步響應面試驗。

表3 Plackett-Burman 試驗設計與結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiment

2.1.3 Box-Behnken 響應面優(yōu)化試驗結果

2.1.3.1 響應面試驗結果及方差分析 Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗結果如表4 所示。利用Design-Expert 8.0.6 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析得實驗因子紅糖添加量（A）、尿素添加量（B）、玉米粉添加量（C）間的二次多項回歸方程：

表4 Box-Behnken 響應面試驗設計與結果Table 4 Design and results of Box-Behnken response surface methodology

由表5 可知，模型值為13.13，＜0.01，該模型擬合程度達到極顯著水平；失擬項=0.4703＞0.05，失擬項不顯著；由方差分析表可知：A、B、C對胞外多糖含量影響極顯著（＜0.01），A、B、C、AB、AC 有顯著影響（＜0.05），BC 對胞外多糖含量量無顯著影響（＞0.05）。對回歸方程進行檢驗，調(diào)整模型決定系數(shù)=0.8722，說明該模型能解釋約87.22%響應值的變化，總決定系數(shù)=0.9441，說明該模型的擬合程度較好，實驗誤差??；因此，此回歸模型可以對胞外多糖進行準確預測和分析。

表5 Box-Behnken 響應面試驗結果方差分析Table 5 Analysis of variance of Box-Behnken response surface methodology

2.1.3.2 響應面不同因素間交互作用分析 根據(jù)所得回歸方程繪制不同因素間交互作用對胞外多糖含量影響大小的等高線圖和響應面立體分析圖，結果如圖2 所示。

圖2 不同因素間交互作用對羊肚菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.2 Effect of interaction between different factors of exopolysaccharides from Morchella

由兩兩等高線的疏密和形狀來分析其交互作用，發(fā)現(xiàn)而AB、AC、BC 的等高線中心均呈橢圓形，說明交互作用明顯。其中AB、AC 中心橢圓形狀更為明顯，說明尿素添加量和玉米粉添加量之間交互作用較弱。AB 較AC 相比，等高線更為密集，形成的曲面較陡，說明紅糖添加量與尿素添加量之間交互作用強于紅糖添加量和玉米粉添加量。

2.1.3.3 驗證試驗 由響應面法優(yōu)化得到最佳液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基理論配方為：紅糖添加量2.20 g/L、尿素添加量3.18 g/L、玉米粉添加量2.40 g/L，胞外多糖含量可到達1.29 g/L。在此條件下，實際操作測得到胞外多糖含量為1.20 g/L，誤差為6.9%。證明該模型合理，優(yōu)化的培養(yǎng)基配方切實可行。

2.2 羊肚菌胞外多糖的體外降血糖活性

2.2.1-葡萄糖苷酶抑制活性 市面上一些常見的降血糖藥物往往可以通過抑制小腸黏膜刷狀緣的-葡萄糖苷酶活性以延緩碳水化合物的吸收。因此，測定MEP 對-葡萄糖苷酶的抑制活性也是驗證其降血糖功能是否良好的檢測方法之一。由圖3可知，MEP 對-葡萄糖苷酶有很好的抑制效果，IC值為0.38 mg/mL。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增大，對-葡萄糖苷酶活性抑制效果越來越明顯，且在0.5～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)隨著濃度增加，其抑制增長率趨于穩(wěn)定，說明MEP 對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用有飽和效應，并在1.0 mg/mL 時達到73.46%。Ye 等報道榆黃菇菌絲體多糖的半抑制濃度值為0.371 mg/mL，與阿卡波糖（0.289 mg/mL）相比，黃菇菌絲體多糖活性較低。王夢雅等對樺褐孔菌胞外多糖進行研究，報道其得到的兩種多糖在-葡萄糖苷酶抑制活性實驗中的IC值分別為0.392、0.299 mg/mL，與本次實驗結果相符。實驗結果表明，羊肚菌胞外多糖在降血糖相關產(chǎn)品研發(fā)方面有較好的應用前景，為研制羊肚菌胞外多糖相關-葡萄糖苷酶抑制劑提供參考。

圖3 羊肚菌胞外多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.3 Inhibitory activity of α-glucosidase of MEP

2.2.2-淀粉酶抑制活性 由圖4 可知，MEP 具有一定的抑制-淀粉酶活性。隨著質(zhì)量濃度升高，阿卡波糖、MEP 對-淀粉酶的抑制率均增強，但隨著濃度的增加，抑制率增長趨于穩(wěn)定，可能是因為當多糖濃度在0.75～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，多糖的抑制作用趨于飽和導致。在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時，MEP的抑制率達到36.67%，IC值為1.16 mg/mL，但活性仍低于阿卡波糖（IC值為0.263 mg/mL）。柏秋月等對4 種羊肚菌的胞外多糖-淀粉酶抑制活性進行研究，發(fā)現(xiàn)4 種羊肚菌的胞外多糖在到1.0 mg/mL 時，其抑制率分別為47.38%、35.04%、32.91%、32.20%、25.97%，但均顯著（＜0.05）低于陽性對照，與本實驗結果相近。但相同濃度下，羊肚菌多糖的-淀粉酶抑制活性顯著（＜0.05）低于-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖4 羊肚菌胞外多糖的α-淀粉酶抑制活性Fig.4 Inhibitory activity of α-amylase of MEP

3 結論

本研究表明，不同添加物的最佳添加量分別為：紅糖2.0 g/L、玉米粉2.4 g/L、黃豆粉1.2 g/L、葡萄糖2.0 g/L、硫酸銨3.2 g/L、蛋白胨2.4 g/L 以及尿素3.2 g/L；其中對胞外多糖含量影響最顯著的三個因子為紅糖＞玉米粉＞尿素。此外，最佳理論液態(tài)發(fā)酵配方是：玉米粉添加量2.4 g/L、紅糖添加量2.2 g/L、尿素添加量3.18 g/L，測得出的胞外多糖含量可到達1.20 g/L，提取分離羊肚菌液態(tài)發(fā)酵得到的MEP，發(fā)現(xiàn)其在濃度為1.0 mg/mL 時對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶活性均具有一定的抑制作用，對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制率則分別達到73.46%和36.67%，該結果證明羊肚菌多糖有較好的降血糖活性，為羊肚菌多糖的開發(fā)和應用奠定了基礎。