牛乳中慶大霉素的殘留及檢測(cè)

張 波，馬 婭，張欣鈺

（1.蘭州石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省中醫(yī)藥大學(xué) 定西校區(qū)，甘肅定西 743000）

1 牛乳中慶大霉素的殘留

抗生素在預(yù)防及治療奶牛疾病中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)人體長(zhǎng)期食用含有抗生素的牛奶會(huì)應(yīng)危害人體建康，因此，1979年世界衛(wèi)生組織（WHO）明確提出牛奶中不應(yīng)檢出抗生素。牛奶中應(yīng)檢測(cè)的抗生素種類(lèi)如表1所示。

表1 牛奶中應(yīng)檢測(cè)的抗生素種類(lèi)

慶大霉素（Gentamicin）屬于氨基糖苷類(lèi)抗生素，是靜止期殺菌藥，抗菌活性強(qiáng)且高，因價(jià)廉易得而廣泛應(yīng)用于禽畜疾病的預(yù)防和治療。慶大霉素抗菌活性作用機(jī)理：依靠離子吸附在菌體表面，造成膜的損傷，與細(xì)菌核糖體30S小亞基不可逆結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄和病原菌蛋白質(zhì)的合成，從而消滅病菌，可以治療需氧革蘭氏陰性細(xì)菌所致的感染，但其有比較嚴(yán)重的耳毒性和腎毒性。奶牛在養(yǎng)殖過(guò)程中使用過(guò)量的慶大霉素會(huì)在體內(nèi)殘留、積聚，影響所獲乳品的質(zhì)量，人們長(zhǎng)期食用會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重甚至?xí)l(fā)毒性作用。耳毒性的主要表現(xiàn)是：眩暈、平衡失調(diào)、聽(tīng)力減退、耳鳴甚至耳聾。腎毒性癥狀可為蛋白尿、腎功能減退嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)腎衰竭和尿毒癥[1]。為了保證人體的安全，中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中，規(guī)定了牛奶中慶大霉素的最高殘留標(biāo)準(zhǔn)為 200μg/kg。

2 慶大霉素殘留的檢測(cè)方法

2.1 理化分析法

理化分析方法基于慶大霉素的理化性質(zhì)來(lái)分離和檢測(cè)，檢測(cè)部分多采用紫外分析、熒光分析、質(zhì)譜等方法，而分離部分多采用色譜分離技術(shù)和電泳分離技術(shù)。理化分析方法因其檢測(cè)靈敏度高、分離效果好，所獲得的結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性高、準(zhǔn)確可靠而得到了廣泛應(yīng)用。慶大霉素因?yàn)榫哂辛己玫乃苄?，大的分子量及極性等特征，適合使用液相色譜進(jìn)行分析，而采用氣相色譜進(jìn)行分析的報(bào)道極為少見(jiàn)。

Kowalczuk D 等建立了一種慶大霉素簡(jiǎn)單靈敏的檢測(cè)方法，該方法基于鄰苯二醛（OPA）與N-乙酰半胱氨酸（NAC）在堿性培養(yǎng)基中的結(jié)合反應(yīng)。用NAC代替液體硫醇形成異吲哚衍生物，避免了形成的硫醇化合物令人不快的氣味。該測(cè)定方法所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為 0.4～12.8μg/mL（r=0.9997），該方法的精密度在1.5～8.5。平均回收率可達(dá)100.02%[2]。

Kabra 等建立了一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、特異的液相色譜法測(cè)定50μL血清中慶大霉素的方法。慶大霉素在70℃反應(yīng)30min，轉(zhuǎn)化為其三硝基苯衍生物。用氯仿從粗混合物中提取衍生物，用流動(dòng)相沖洗反相辛基柱將慶大霉素分離為三種主要異構(gòu)體。洗脫后的化合物在340nm處檢測(cè)，并根據(jù)峰高或峰面積進(jìn)行定量，色譜分析在11min內(nèi)完成。慶大霉素的檢出下限小于0.5mg/L，分析回收率為96.6%～99.3%，線性范圍為15.0mg/L，精密度為2.2%～2.9%[3]。

高效液相色譜法（HPLC）又稱(chēng)“高壓液相色譜”，指利用高壓輸送系統(tǒng)，通過(guò)液體流動(dòng)相將樣品泵入色譜柱，不同抗生素在柱內(nèi)高效分離，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，完成分析。高燕霞等[4]用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（HPLC-ELSD）法，以三氟乙酸-甲醇為流動(dòng)相使硫酸慶大霉素在Apollo C18柱中得到了有效分離。依據(jù)ELSD原理，樣品濃度與檢測(cè)器對(duì)數(shù)響應(yīng)呈線性關(guān)系，以此來(lái)測(cè)定硫酸小諾霉素、硫酸西索米星的濃度，該方法準(zhǔn)確性好，靈敏度高。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是牛乳中抗生素分離和檢測(cè)的一種重要的分析方法。色譜法最大的優(yōu)勢(shì)在于分離效率高，為混合物的檢測(cè)提供了有力的保證。質(zhì)譜法能幫助分析人員進(jìn)行雜質(zhì)分析，樣品分析用量少，分析時(shí)間短，結(jié)果可靠準(zhǔn)確。但是樣品預(yù)處理復(fù)雜，為了能夠最大限度地發(fā)揮每種分析方法的優(yōu)勢(shì)，常將兩種方法聯(lián)用，聯(lián)用技術(shù)有：薄層液相色譜-質(zhì)譜（TLCMS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、毛細(xì)管區(qū)域電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（GIE-MS）等。劉雪紅等報(bào)道了一種采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速地檢測(cè)了牛奶中的7種氨基糖苷類(lèi)抗生素（鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、安普霉素、大觀霉素）。分析過(guò)程采用乙酸銨緩沖溶液提取樣品，分離色譜柱為CORTECS HILIC，流動(dòng)相采用甲酸銨溶液洗脫。采用該方法所獲的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1～5μg/m L（r＞0.996），平均回收率可達(dá)80%～117.5%，檢測(cè)限為10μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%[5]。

2.2 微生物法

微生物檢測(cè)法是牛乳中抗生素檢測(cè)的一種傳統(tǒng)方法，能夠比較直觀地反映抗生素的抗菌活性，使用的檢測(cè)儀器簡(jiǎn)單，檢測(cè)價(jià)格低廉，檢測(cè)速度快，檢測(cè)靈敏度高，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。微生物檢測(cè)的原理是：抗生素會(huì)對(duì)微生物的代謝產(chǎn)生抑制作用，以此來(lái)定性、定量確定牛乳中放熱抗生素。如氯化三苯基四氮唑試驗(yàn)法（TTC法）、紙片法（PD法）和試劑盒法等。

TTC法的檢測(cè)原理是在牛乳中生長(zhǎng)的嗜熱鏈球菌會(huì)將無(wú)色TTC溶液還原為紅色的三苯甲臜，而牛乳中有抗生素存在會(huì)抑制嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)，TTC不會(huì)被還原溶液呈無(wú)色。TTC法應(yīng)用廣泛價(jià)格便宜。黃怡君等[6]使用TTC法對(duì)牛乳中的抗生素（青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等9種）進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)的靈敏性均達(dá)到了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對(duì)抗生素殘留最高限量的要求。

王志強(qiáng)等報(bào)道了一種牛奶中多種抗生素殘留的快速檢驗(yàn)方法。該方法基于抗生素對(duì)細(xì)菌的抑制作用，快速檢測(cè)牛奶中10種殘留抗生素。該方法氨芐青霉素、青霉素最低檢出限為0.001μg/mL，金霉素、土霉素、紅霉素、四環(huán)素最低檢出限為0.01μg/mL，鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素最低檢出限為0.1μg/mL，該方法最低檢出限結(jié)果優(yōu)于GB/T 4789.27—2003TTC法。采用本方法成本低、靈敏度高、穩(wěn)定性好，檢測(cè)時(shí)間短，能同時(shí)測(cè)定10種抗生素[7]。

紙片法，目前主要使用的是：枯草桿菌法、嗜熱脂肪桿菌法?？莶輻U菌法只能檢測(cè)β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，而嗜熱鏈球菌法可以檢測(cè)除了β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的多種抗生素。檢測(cè)原理為浸有牛奶的濾紙片貼在含有枯草桿菌或嗜熱脂肪桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。若牛奶中含有抗生素會(huì)抑制菌種的生長(zhǎng)，紙片周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)抑菌圈。若牛奶中不含有抗生素，菌種正常地生長(zhǎng)，紙片周?chē)胁煌该鞯木鷮覽8]。

Qin Wu等建立了一種微生物抑制法，用于牛奶中抗生素的快速篩選。該方法樣品預(yù)處理簡(jiǎn)便，以嗜熱地芽孢桿菌 ATCC12980 作為指示菌，該試劑盒對(duì)牛奶中34種常見(jiàn)抗生素殘留的檢出限均低于或接近歐盟和中國(guó)規(guī)定的最大殘留限量，包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)（13）、氨基糖苷類(lèi)（6）、四環(huán)素類(lèi)（4）、磺胺類(lèi)（6）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（4）、林可酰胺類(lèi)（1）。檢測(cè)的假陽(yáng)性率為1%，假陰性小于5%。該試劑盒在4℃條件下，保質(zhì)期超過(guò)6個(gè)月。此外，試劑盒檢測(cè)結(jié)果與采用超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法結(jié)果保持一致，該試劑盒可用于牛乳中的抗生素篩查。該試劑盒具有靈敏度、特異性高、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、可靠性高、操作簡(jiǎn)單、成本低、通量大等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。[9]

2.3 免疫分析法

免疫測(cè)定法基于抗原、半抗原同抗體特異性結(jié)合，檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，測(cè)定成本低，廣泛引用于醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。免疫分析法和其他方法的聯(lián)用也是牛乳中慶大霉素檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的重要方向之一。

Yeluri T 等描述了基于 cyclamn-Au NPs的敏感比色法檢測(cè)新霉素和慶大霉素的進(jìn)展。利用紫外-可見(jiàn)光譜、傅里葉變換紅外光譜、透射電子顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射和zeta電位等方法對(duì)cyclamn-Au NPs進(jìn)行了表征。在新霉素和慶大霉素存在下cyclamn-Au NPs會(huì)聚集，導(dǎo)致顏色從紫色變?yōu)樗{(lán)色，530nm處的特征吸收峰被紅移到一個(gè)更長(zhǎng)的波長(zhǎng)（660nm）。采用紫外-可見(jiàn)吸收法測(cè)定了新霉素和慶大霉素的檢出限，分別為 1.87 × 10-8mol/L 和 2.35 × 10-8mol/L[10]。

R.M Van Es等為了開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速的基于現(xiàn)場(chǎng)方法將牛奶中的慶大霉素量化到監(jiān)管范圍中，已經(jīng)評(píng)估了許多方法，包括免疫分析與流動(dòng)注射分析和電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合?？箲c大霉素抗體被吸附在硝酸纖維素和聚碳酸酯固相載體上，并放置在與流動(dòng)池安裝的電極接觸或電極-電池組件的上游。在競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定之后，根據(jù)電化學(xué)測(cè)量的葡萄糖氧化酶標(biāo)記活性的程度對(duì)分析物水平進(jìn)行量化。完全組裝的流動(dòng)池裝置（原位方法）能夠在10min內(nèi)檢測(cè)牛奶中 0到 100μg/kg的慶大霉素，變異系數(shù)值為 13.2%，并且沒(méi)有樣品預(yù)處理。在細(xì)胞組裝和信號(hào)測(cè)量之前，流通池外需要孵育90min和高達(dá) 38.7% 的 CV 值。原位測(cè)定操作簡(jiǎn)單、可自動(dòng)化，并且通過(guò)使用廉價(jià)、可大量生產(chǎn)的絲網(wǎng)印刷電極，適合開(kāi)發(fā)一次性使用測(cè)量盒[11]。

王永智等[12]基于免疫分析法抗原和抗體的高特異性，結(jié)合表面等離子共振（SPR）技術(shù)將慶大霉素-BSA-GM偶聯(lián)到S系列CM5芯片上，利用競(jìng)爭(zhēng)抑制性準(zhǔn)確高效地檢測(cè)了牛乳中的慶大霉素。該方法檢測(cè)準(zhǔn)確度高，平均回收率為102.60%，RSD為9.58。采用該檢測(cè)方法結(jié)果的重復(fù)性好，牛乳中慶大霉素濃度為3.2、12.8、51.2ng/mL時(shí)，計(jì)算所得的 RSD 結(jié)果分別為4.56%、4.83%、3.84%。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的中間精密度高，選擇實(shí)驗(yàn)員A和B獨(dú)立操作，檢測(cè)六次，計(jì)算所得RSD為4.65%。慶大霉素在 0.8～102.4ng/mL的濃度范圍內(nèi)，儀器響應(yīng)單位（Ru）和慶大霉素的濃度（ng/mL）有良好的線性回歸關(guān)系（R2=0.997 7）。

3 結(jié)束語(yǔ)

牛乳中抗生素殘留的常用的三種檢測(cè)方法：理化分析法、微生物法及免疫分析法。理化檢測(cè)法檢測(cè)速度快、靈敏性高、特異性好、重復(fù)性強(qiáng)，但是儀器價(jià)格昂貴、樣品的前處理過(guò)程復(fù)雜、程序復(fù)雜，常用于技術(shù)部門(mén)。微生物法操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉但是微生物的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，與檢測(cè)人員的操作水平關(guān)系密切，在企業(yè)中使用較為廣泛。免疫分析法靈敏度高，特異性強(qiáng)，樣品處理量大，檢測(cè)時(shí)間短，但是方法建立難度大，使用范圍逐漸擴(kuò)大。