酶抑制法在蔬菜質(zhì)量安全控制中的應(yīng)用

田 野

（湘潭市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測管理站，湖南湘潭 411100）

蔬菜是與人們?nèi)粘Ｉ蠲懿豢煞值某Ｓ棉r(nóng)產(chǎn)品，蔬菜質(zhì)量安全是政府和廣大人民群眾十分關(guān)注的一件事情，它不僅關(guān)系到廣大人民群眾的生命安全，而且關(guān)系到社會(huì)的穩(wěn)定發(fā)展。蔬菜產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留已成為威脅百姓餐桌安全的“隱形殺手”，成為全社會(huì)關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)[1]。因此，加強(qiáng)蔬菜產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測，有效防止不合格蔬菜進(jìn)入市場，做好蔬菜產(chǎn)品“從農(nóng)田到餐桌”的全程質(zhì)量安全管控十分重要。

目前農(nóng)藥殘留快速生化檢測技術(shù)，主要有酶抑制法[2]和酶聯(lián)免疫法[3]。酶聯(lián)免疫法集測定的高靈敏性和抗體反應(yīng)的強(qiáng)特異性于一體，是檢測某些重要痕量生物活性物質(zhì)的好方法，但開發(fā)該種方法需要投入較多的資金和花費(fèi)較長的時(shí)間，不利于廣泛推廣使用；酶抑制法是根據(jù)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的毒理特性，建立的一種快速檢測農(nóng)藥殘留的方法，是一種簡便、靈敏、快捷、經(jīng)濟(jì)的檢測方法。因此，該法得到了大力推廣和使用，已經(jīng)成為我國蔬菜農(nóng)藥殘留快速檢測的主流技術(shù)之一。

1 酶抑制法檢測的基本原理和特點(diǎn)

1.1 酶抑制法的基本原理

有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥種類雖然繁多，但具有相同靶標(biāo)作用的乙酰膽堿酯酶，都能抑制昆蟲中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶的活性。根據(jù)昆蟲毒理學(xué)反應(yīng)共性這一原理，在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶正常功能具有抑制作用，酶催化乙酰膽堿水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)。通過蔬菜樣品提取液對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制程度的測定，即可判斷蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)[4]。在酶反應(yīng)中加入顯色劑和底物，觀察溶液顏色的變化，采用分光光度計(jì)測定溶液體系的吸光度，即可判定乙酰膽堿酯酶受到抑制的程度，從而判定蔬菜中農(nóng)藥殘留量的情況。即乙酰膽堿酯酶有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥和乙酰膽堿酯酶反應(yīng)，則酶活性被抑制。

樣本提取液和乙酰膽堿酯酶：如果樣本提取液中含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，則酶活性被抑制；如果樣本提取液中不含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，則酶活性正常[5]。有機(jī)磷農(nóng)藥與乙酰膽堿酯酶的反應(yīng)可用下式表示：

EOH+AX→X-+H++EOA

1.2 酶抑制法的特點(diǎn)

酶抑制法是根據(jù)有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的毒理特性，建立的一種快速檢測農(nóng)藥殘留的方法。該法檢測時(shí)間短，整個(gè)檢測過程最多20min左右，靈敏度較高，對(duì)操作人員的要求、成本消耗及后期維護(hù)的費(fèi)用均較低，具有簡便、快捷、靈敏、經(jīng)濟(jì)、檢測人員易于掌握等特點(diǎn)。

2 酶抑制法檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留的應(yīng)用

2.1 檢測范圍

（1）蔬菜：葉果類、瓜果類、豆菜、根莖類、蔥蒜類、茄果類等，其中小白菜、空心菜等極易存在農(nóng)藥殘留。

（2）有機(jī)磷類農(nóng)藥：甲胺磷、對(duì)硫磷、敵敵畏等；氨基甲酸酯類農(nóng)藥：涕滅威、西維因、異索威、抗蚜威等[6]。

2.2 檢測條件

室溫保持在25～30℃，室內(nèi)濕度不能高于85%[7]。

2.3 酶抑制法檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留

2.3.1 主要儀器與試劑

WX-201型農(nóng)藥殘留快速檢測儀；臺(tái)式恒溫培養(yǎng)箱；微型樣品混合器；電子天平；移液槍；Agilent 6890N型氣相色譜儀，配有火焰光度檢測器和自動(dòng)進(jìn)樣器；N-EVAPI 12型旋轉(zhuǎn)氮吹儀。

稀釋液：用磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀和適量蒸餾水溶解。酶液：用乙酰膽堿酯酶配制。顯色劑：二硫代雙對(duì)硝基苯甲酸。底物試劑：碘化硫代丁酰膽堿。

2.3.2 檢測方法

取一定量的蔬菜樣品，切碎，混合均勻。稱取2g蔬菜樣品（非葉菜類稱取4g），置于玻璃瓶中，加入緩沖液20mL，振蕩3min后，倒出提取液，并靜置3～5min。將小試管進(jìn)行編號(hào)，用50μL移液槍移取酶液50μL，放入每個(gè)小試管中，在1號(hào)小試管中加入緩沖液3mL。在剩下的小試管中，用3mL移液槍移取樣品提取液上清液3mL依次加入其中，再用50μL移液槍移取顯色劑50μL依次加入小試管中，搖勻，置于38℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)放置30min。將小試管取出，用50μL移液槍移取底物50μL依次加入小試管中，混勻后，分別倒入1cm比色皿中，立即放入儀器的樣品器皿中，關(guān)閉樣品池蓋，按下儀器“開始樣品分析”鍵，自動(dòng)完成檢測。對(duì)照測試，用1號(hào)小試管，其他步驟按照樣品測試，得出空白試驗(yàn)。同時(shí)將蔬菜樣品檢測結(jié)果與氣相色譜法進(jìn)行驗(yàn)證[8]。

依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，抑制率≥70%，樣品中殘留有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，表明樣品不合格；抑制率＜70%，表明樣品合格。蔬菜農(nóng)藥殘留抑制率為-10%～110%，超出該范圍則說明操作失誤，必須重新檢測[9]。

2.3.3 檢測試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)酶抑制法檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留不合格的樣品，采用氣相色譜法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。酶抑制法檢測的不合格樣品的檢測結(jié)果與氣相色譜法驗(yàn)證的檢測結(jié)果如表1所示，農(nóng)藥濃度與抑制率關(guān)系的結(jié)果如表2所示。從表1可以看出，酶抑制法的檢測結(jié)果與氣相色譜法的檢測結(jié)果符合率在90%以上。從表2可以看出，農(nóng)藥濃度與抑制率呈現(xiàn)正相關(guān)。

表1 酶抑制法檢測結(jié)果和氣相色譜法驗(yàn)證結(jié)果

表2 農(nóng)藥濃度與抑制率的關(guān)系

3 酶抑制法對(duì)蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測存在的不足

3.1 檢測農(nóng)藥種類的有限性

酶抑制法檢測蔬菜中農(nóng)藥的殘留，只有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥可以檢測出，但有機(jī)氯類農(nóng)藥、菊酯類農(nóng)藥和殺蟲雙、噻螨酮、多殺菌素等其他類農(nóng)藥則無法檢測出。酶抑制法對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥雖然可以檢測出，但不能準(zhǔn)確判斷超標(biāo)農(nóng)藥的品種和超標(biāo)量[10]。

3.2 誤檢現(xiàn)象的發(fā)生

（1）蔬菜樣品色素的干擾對(duì)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。待測蔬菜樣品的色素如果含葉綠素、胡蘿卜素等較高時(shí)，則會(huì)影響透過率，使測得的透過率較低，影響對(duì)吸光度隨時(shí)間變化值的計(jì)算，使檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性大大降低。

（2）出現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象。假陽性是由于酶活性降低或失活，底物不與酶反應(yīng)，從而不能被水解，無法與顯色劑結(jié)合顯色；假陰性是由于某些農(nóng)藥對(duì)酶抑制作用很小或無作用而產(chǎn)生的，表現(xiàn)出無農(nóng)藥殘留的假象。另外在反應(yīng)過程中，化學(xué)、物理干擾都可能導(dǎo)致假陽性、假陰性現(xiàn)象的發(fā)生。對(duì)蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測出現(xiàn)的假陽性和假陰性現(xiàn)象，都會(huì)影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，出現(xiàn)誤檢現(xiàn)象[11]。

（3）空白值偏低。酶抑制法對(duì)蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測過程中，比色時(shí)記載的空白3min前后吸光值差值在0.3～0.8為好。如果酶活性不夠，溫度太低，空白吸光值差值可能會(huì)偏低，低于0.3。

3.3 實(shí)際操作中易出現(xiàn)誤判現(xiàn)象

國內(nèi)對(duì)于蔬菜農(nóng)藥殘留的檢測，蔬菜樣品前處理環(huán)節(jié)比較簡單，主要按照國家標(biāo)準(zhǔn)《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量快速檢測》。實(shí)際操作時(shí)，蔬菜樣品提取液只在緩沖液中經(jīng)過簡單的振蕩、混勻、靜置，沒有經(jīng)過凈化和富集過程，干擾物質(zhì)去除非常困難，因此，實(shí)際操作中容易出現(xiàn)誤判現(xiàn)象。

4 檢測過程中需注意的事項(xiàng)

1）檢測試劑必須保存在0～5℃低溫中，檢測前必須恢復(fù)至常溫，溫度過高或過低，都會(huì)使酶的活性受影響。配好的檢測試劑存放時(shí)間不宜過長，最長不超過30d。

2）靜置時(shí)間過長或過短都會(huì)對(duì)檢測結(jié)果有影響，因此，靜置時(shí)間最佳為10min。

3）測定體系的pH對(duì)乙酰膽堿酯酶的活性影響很大，因此，測定體系的pH最佳為7.5～8.0。

4）酶顯色最佳溫度為37～38℃，溫度低于37℃時(shí)，酶反應(yīng)的速度減小，酶液和顯色劑反應(yīng)的時(shí)間需相對(duì)延長，反應(yīng)時(shí)間得延長，需根據(jù)乙酰膽堿酯酶空白對(duì)照測試3min，吸光度變化△A0值在0.2～1.0，才可繼續(xù)往下操作。應(yīng)當(dāng)特別注意，樣品溶液的放置時(shí)間必須與空白對(duì)照溶液的放置時(shí)間保持一致[12]，否則會(huì)影響檢測結(jié)果。

5 結(jié)論

1）對(duì)酶抑制法檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留不合格的樣品，采用氣相色譜法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，將酶抑制法的檢測結(jié)果與氣相色譜法驗(yàn)證的檢測結(jié)果進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明，酶抑制法檢測的結(jié)果與氣相色譜法檢測的結(jié)果符合率達(dá)到95%，農(nóng)藥濃度與抑制率呈現(xiàn)正相關(guān)。

2）酶抑制法對(duì)蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測很有效用，該技術(shù)是現(xiàn)階段控制高毒性、高殘留農(nóng)藥，防止不合格蔬菜進(jìn)入市場的一種十分有效的檢測方法，具有簡便、快捷、靈敏、經(jīng)濟(jì)、檢測人員易于掌握等特點(diǎn)，在整個(gè)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全體系中發(fā)揮著重要作用，現(xiàn)已得到廣泛普及。