鐵鹽對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌效應(yīng)研究

馮程遠(yuǎn)，徐 丹，王猷勝，彭姝瑞，莫海珍，李紅波，胡梁斌*

1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021 2.江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，江蘇 南京 210019

阪崎腸桿菌是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧的條件致病菌，可在人體腸道寄生，使人感染發(fā)病。2002年，國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)將阪崎腸桿菌列為“嚴(yán)重危害特定人群，危害生命或慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥或長期影響”的一種致病菌[1]。阪崎腸桿菌可引起所有年齡段人群感染，其中嬰幼兒為高危人群，有統(tǒng)計(jì)表明嬰兒在阪崎腸桿菌感染后的主要臨床表現(xiàn)有壞死性小腸結(jié)腸炎、嚴(yán)重的腦膜炎和菌血癥，整體感染后死亡率高達(dá)20%～50%[2]。2004年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織認(rèn)為新生兒阪崎腸桿菌感染與嬰兒配方奶粉密切相關(guān)，該菌是導(dǎo)致嬰幼兒感染、發(fā)病和死亡的主要原因[3]。阪崎腸桿菌比大腸桿菌具有更強(qiáng)的耐高滲透壓能力，能產(chǎn)生莢膜和海藻糖酶，可在奶粉中長期存活；此外，該菌還具有很強(qiáng)的繁殖能力，如在23 ℃只需要40 min就可以在嬰兒奶粉中成長起來[4]。因此，即使奶粉中阪崎腸桿菌的污染極微量，也能在一定情況下繁殖，導(dǎo)致感染的發(fā)生。阪崎腸桿菌極易在不銹鋼、塑料等表面黏附，形成生物膜，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)清潔劑和殺菌劑的抵抗力，導(dǎo)致乳制品加工管道中的阪崎腸桿菌難以徹底清除[5]。此外，阪崎腸桿菌所具有的菌毛結(jié)構(gòu)能使菌形成共生集合體，抵抗抗生素[6]，若長期大量使用抗生素殺菌不僅會(huì)使微生物產(chǎn)生耐藥性，還會(huì)污染環(huán)境[7]。

近年來對(duì)阪崎腸桿菌的防控研究越來越多，有許多物理與化學(xué)方法被提及，如Harouna等[8]發(fā)現(xiàn)通過功率550 W的微波僅需10 s左右即可殺滅阪崎腸桿菌；Lin等[9]發(fā)現(xiàn)在65 ℃射頻21 h后對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌效果顯著增加；郭都等[10]發(fā)現(xiàn)硫辛酸對(duì)阪崎腸桿菌具有較好的抑制效果；Tian等[11]研究發(fā)現(xiàn)百里香酚可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞膜的破損殺滅阪崎腸桿菌，降低其胞內(nèi)ATP水平，使pH值下降，從而達(dá)到較好的抗菌能力。

雖然這些物理或者化學(xué)方法都可以起到抑制阪崎腸桿菌的作用，但是相關(guān)物理性的干預(yù)技術(shù)都會(huì)對(duì)乳粉中的熱敏營養(yǎng)部分造成一定的損失，或者由于其成本較高而很難在實(shí)際生產(chǎn)中使用；而所使用的化學(xué)方法中，有機(jī)酸或精油都有相關(guān)安全性和特異性問題，其真正使用在嬰幼兒配方乳粉中的愿景無法實(shí)現(xiàn)。因此，為保障嬰幼兒健康，亟須開發(fā)出能安全、高效殺滅阪崎腸桿菌的殺菌劑。

此前有許多研究發(fā)現(xiàn)鐵螯合物[12]、鐵離子配合物[13]、有機(jī)酸鐵鹽[14-15]等具有較強(qiáng)的抑菌效果。我國衛(wèi)生計(jì)生委此前頒布的《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 14880—2012)、《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—2014)中都允許硫酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵、乳酸亞鐵等作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑及食品添加劑，氯化鐵也可應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[16]補(bǔ)充鐵元素，改善食品品質(zhì)。本研究考察乳酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵、硫酸亞鐵、氯化亞鐵、氯化鐵5種鐵鹽對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌作用，從殺菌效果、胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度等方面探討鐵鹽對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌機(jī)制，以期為鐵鹽在控制食源性致病菌中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

阪崎腸桿菌 ATCC 29544購買于美國微生物菌株保藏中心，保存在-80 ℃冰箱中。

1.1.2 培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)：稱取30 g TSB干粉培養(yǎng)基溶于1 L超純水，于121 ℃滅菌15 min。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)：稱取40 g TSA干粉培養(yǎng)基溶于1 L超純水，加熱溶解后于121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

乳酸亞鐵、氯化鐵、葡萄糖酸亞鐵、硫酸亞鐵、氯化亞鐵：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；TSA、TSB：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；碘化丙啶(PI)、活性氧熒光探針DCFH-DA：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)過氧化探針C11-BODIPY(581/591)：美國賽默飛世爾科技公司；Liproxstatin-1(Lip-1)：Med Chem Express；N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

L5分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；Pico 17高速離心機(jī)：美國賽默飛公司；Novo Cyte 300 s流式細(xì)胞儀：艾森生物杭州有限公司；Zeiss Axio Vert A1倒置熒光顯微鏡：德國蔡司集團(tuán)；ZWY-1102C臺(tái)式高速離心機(jī)：上海智誠分析儀器制造有限公司；BIONOON-200C恒溫金屬浴裝置：上海般諾生物科技有限公司；MSC-100恒溫混勻儀：杭州奧盛儀器有限公司；LHP-160E智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市豪成實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；PL-303電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺(tái)：中國蘇州智凈凈化有限公司；YM100L高壓滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及菌液制備

將阪崎腸桿菌劃線接種于TSA培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)；然后挑取單克隆接種于TSB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，將菌液以1∶100的體積比例轉(zhuǎn)接至新鮮TSB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD600為0.8～1.2；最后用TSB培養(yǎng)液稀釋菌液至OD600為0.1，于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集菌體重懸于0.9% NaCl，備用。

1.3.2 鐵鹽對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌效果研究

分別取100 μL(濃度均為3 mmol/L)的乳酸亞鐵、氯化鐵、氯化亞鐵、葡萄糖酸亞鐵和硫酸亞鐵加入3 mL阪崎腸桿菌菌液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 h，然后于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于0.9% NaCl，將菌液進(jìn)行梯度稀釋(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)，每個(gè)稀釋度下的菌液吸取5 μL接種于TSA培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，觀察阪崎腸桿菌菌落生長情況，同時(shí)以不加鐵鹽的菌液作為空白對(duì)照，分析鐵鹽對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌效果。

1.3.3 氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌的最小殺菌濃度(MBC)測定

分別取0、25、50、100、200 μL氯化鐵(濃度為3 mmol/L)加入3 mL阪崎腸桿菌菌液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 h，然后于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于0.9% NaCl，將菌液進(jìn)行梯度稀釋(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)，每個(gè)稀釋度下的菌液吸取5 μL接種于TSA培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，觀察阪崎腸桿菌菌落生長情況，參考文獻(xiàn)[17]將殺死99%細(xì)菌所需最低濃度確定為氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌的MBC。

1.3.4 氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響

將200 μL濃度為3 mmol/L的氯化鐵加入3 mL阪崎腸桿菌菌液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 h，然后于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于0.9% NaCl，向菌液中加入1 μL濃度為10 mmol/L的PI染液，37 ℃孵育20 min，然后于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于0.9% NaCl，用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀察菌液的紅色熒光強(qiáng)度，同時(shí)以不加氯化鐵的菌液作為空白對(duì)照，分析氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響。

1.3.5 氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌胞內(nèi)ROS水平的影響

向3 mL阪崎腸桿菌菌液中加入1 μL濃度為10 mmol/L的熒光染料DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，然后加入200 μL濃度為3 mmol/L的氯化鐵溶液，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 h，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于0.9% NaCl，用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀察菌液的綠色熒光強(qiáng)度，同時(shí)以不加氯化鐵的菌液作為空白對(duì)照，分析氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌胞內(nèi)ROS水平的影響。

1.3.6 氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌脂質(zhì)過氧化程度的影響

將200 μL濃度為3 mmol/L的氯化鐵加入3 mL阪崎腸桿菌菌液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 h，然后于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于0.9% NaCl，向菌液中加入1 μL濃度為10 mmol/L的C11-BODIPY熒光探針，37 ℃孵育20 min，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于0.9% NaCl，用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀察菌液的綠色熒光強(qiáng)度，同時(shí)以不加氯化鐵的菌液作為空白對(duì)照，分析氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌脂質(zhì)過氧化程度的影響。

1.3.7 ROS清除劑對(duì)氯化鐵殺菌效果的影響

N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)是ROS清除劑[18]。鐵死亡發(fā)生時(shí)谷胱甘肽(GSH)的消耗會(huì)增多，使谷胱甘肽過氧化物酶(GPX4)失活，導(dǎo)致ROS積累[19]。NAC可以通過合成谷胱甘肽(GSH)增強(qiáng)胞內(nèi)抗氧化能力，或是直接清除ROS[20]，達(dá)到緩解鐵死亡的效果。因此本研究選擇通過在氯化鐵處理阪崎腸桿菌前加入NAC，觀察其是否對(duì)細(xì)胞死亡起緩解作用，以此判斷氯化鐵是否誘導(dǎo)阪崎腸桿菌發(fā)生鐵死亡。

將阪崎腸桿菌分成3組：(1)空白對(duì)照組：菌液不做任何處理；(2)氯化鐵處理組：菌液經(jīng)200 μL濃度為3 mmol/L的氯化鐵處理；(3)氯化鐵和NAC處理組：菌液經(jīng)200 μL濃度為3 mmol/L的氯化鐵和30 μL濃度為50 mmol/L的NAC處理。按照1.3.3、1.3.4、1.3.5分別對(duì)上述菌液進(jìn)行菌落生長、細(xì)胞膜完整性、胞內(nèi)ROS水平的研究，分析ROS清除劑NAC對(duì)氯化鐵殺菌效果的影響。

1.3.8 鐵死亡抑制劑對(duì)氯化鐵殺菌效果的影響

liproxstatin-1(Lip-1)作為鐵死亡抑制劑[21]可以阻斷鐵死亡，可以緩解因鐵死亡而發(fā)生的細(xì)胞死亡。本研究在氯化鐵處理阪崎腸桿菌前加入Lip-1，觀察是否對(duì)細(xì)胞死亡起緩解作用。將阪崎腸桿菌分成3組：(1)空白對(duì)照組：菌液不做任何處理；(2)氯化鐵處理組：菌液經(jīng)200 μL濃度為3 mmol/L的氯化鐵處理；(3)氯化鐵和Lip-1處理組：菌液經(jīng)200 μL濃度為3 mmol/L的氯化鐵和30 μL濃度為10 mmol/L的Lip-1處理。按照1.3.3、1.3.4、1.3.6分別對(duì)上述菌液進(jìn)行菌落生長、細(xì)胞膜完整性、脂質(zhì)過氧化程度的研究，分析鐵死亡抑制劑Lip-1對(duì)氯化鐵殺菌效果的影響。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，使用Origin 8.5、FlowJo 7.6 等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵鹽對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌效果

鐵鹽對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌效果如圖1所示，5種鐵鹽對(duì)阪崎腸桿菌均有不同程度的殺菌作用，經(jīng)葡萄糖酸亞鐵、硫酸亞鐵、乳酸亞鐵和氯化亞鐵處理后，阪崎腸桿菌的存活率為25.47%～89.88%，而氯化鐵處理后菌體存活率僅為0.49%，殺菌活性依次為氯化鐵>葡萄糖酸亞鐵>硫酸亞鐵>乳酸亞鐵>氯化亞鐵。為深入研究鐵鹽對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌機(jī)制，后續(xù)試驗(yàn)均以氯化鐵為殺菌劑。

2.2 氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌的MBC

如圖2a所示，氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌效果呈濃度依賴，隨著氯化鐵濃度的增大，菌體存活率逐漸下降。由圖2b可知，當(dāng)氯化鐵濃度分別為25、50、100、200 μmol/L時(shí)，阪崎腸桿菌的存活率依次為54.76%、40.51%、10.20%和0.019%。加入200 μmol/L氯化鐵時(shí)，99.98%的菌體細(xì)胞被殺滅，表明氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌的MBC為200 μmol/L。

2.3 氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響

盡管PI染料不能通過活細(xì)胞膜，卻能穿過破損的細(xì)胞膜對(duì)其核染色。為進(jìn)一步確證氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌的抗菌能力是殺菌，本研究通過PI染料觀察細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，處理組中PI陽性群體也發(fā)生了同步右移(圖3a)，這與2.2中的結(jié)果符合。研究還通過熒光顯微鏡檢測，與對(duì)照組相比，氯化鐵處理后阪崎腸桿菌的PI陽性群體數(shù)更多(圖3b)。這表明氯化鐵處理后的阪崎腸桿菌發(fā)生細(xì)胞死亡。

2.4 氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌胞內(nèi)活性氧和脂質(zhì)過氧化程度的影響

由于鐵死亡的特征是胞內(nèi)ROS累積和脂質(zhì)過氧化水平的上升，為了分析氯化鐵是否導(dǎo)致阪崎腸桿菌死亡也伴隨著ROS和脂質(zhì)過氧化的爆發(fā)，本研究利用 DCFH-DA 熒光探針和C11-BODIPY 熒光探針檢測活性氧和脂質(zhì)過氧化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡結(jié)合測定氯化鐵處理后的阪崎腸桿菌，其DCFH-DA陽性群體相比對(duì)照組發(fā)生了右移(圖4a)，顯示出的綠色熒光相比對(duì)照組更強(qiáng)(圖4b)；與對(duì)照組相比，處理組中C11-BODIPY陽性群體也發(fā)生了右移(圖4c)，且菌體的綠色熒光更強(qiáng)(圖4d)。這說明隨著氯化鐵的加入，阪崎腸桿菌在發(fā)生死亡的同時(shí)，其胞內(nèi)的活性氧和脂質(zhì)過氧化水平均顯著上升。

2.5 ROS清除劑(NAC)和鐵死亡抑制劑(Lip-1)對(duì)氯化鐵殺菌效果的影響

如圖5所示，NAC和氯化鐵處理的阪崎腸桿菌，其存活率與單獨(dú)氯化鐵處理組相比，由1.24%緩解到14.98%(圖5a)；通過添加PI探針和DCFH-DA 熒光探針進(jìn)行對(duì)細(xì)胞膜完整情況和活性氧水平的檢測，在有NAC加入的氯化鐵處理組中，其PI陽性群體較氯化鐵處理組發(fā)生了左移(如圖5b)，且紅色熒光更弱(圖5c)；NAC加入的氯化鐵組中，其DCFH-DA陽性群體較氯化鐵處理組發(fā)生了左移(如圖5d)，且綠色熒光也更弱(圖5e)。

如圖6所示，與氯化鐵處理組相比，Lip-1能使阪崎腸桿菌的存活率從1.06%上升到8.43%(圖6a)；通過添加PI染色和C11-BODIPY 熒光探針分析細(xì)胞膜完整性和胞內(nèi)活性氧水平，在有Lip-1加入的氯化鐵處理組中，其PI陽性群體較氯化鐵處理組發(fā)生了左移(圖6b)，且紅色熒光更弱(圖6c)；Lip-1加入的氯化鐵組中，其C11-BODIPY陽性群體較氯化鐵處理組發(fā)生了左移(圖6d)，且綠色熒光也更弱(圖6e)。結(jié)合圖5與圖6的結(jié)果，說明NAC和Lip-1可以緩解細(xì)胞死亡的發(fā)生，這進(jìn)一步表明了氯化鐵的加入誘導(dǎo)阪崎腸桿菌發(fā)生了鐵死亡。

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了乳酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵、硫酸亞鐵、氯化亞鐵、氯化鐵等鐵鹽對(duì)阪崎腸桿菌均有殺菌作用，其中氯化鐵的效果最強(qiáng)，當(dāng)氯化鐵濃度為200 μmol/L時(shí)，能殺滅99.98%的菌體細(xì)胞。此前已有關(guān)于鐵對(duì)革蘭氏陰性菌有抗菌能力的報(bào)道，楊靜等[14]發(fā)現(xiàn)乳酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵和檸檬酸亞鐵均可對(duì)變形桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌均具有抑制作用，且在pH≤4時(shí)抑制效果更好；王忠合等[13]發(fā)現(xiàn)麥芽酚鐵對(duì)大腸桿菌有較好的抑菌效果，且可以透過細(xì)胞壁對(duì)核內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生影響；Gholami等[22]發(fā)現(xiàn)鐵離子在有氧和無氧的條件下均能對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生不錯(cuò)的殺菌效果。菌體經(jīng)氯化鐵處理后，細(xì)胞膜發(fā)生破損，細(xì)胞死亡，這與硫酸亞鐵對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的殺菌現(xiàn)象一致。早期研究表明硫酸亞鐵通過改變金黃色葡萄球菌等致病菌細(xì)胞膜通透性，造成細(xì)胞膜破損，引起細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子泄漏，影響ATP酶活性和能量代謝，加速細(xì)胞的死亡，并提出該殺菌機(jī)制可能涉及細(xì)胞膜上羥自由基反應(yīng)[15]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)氯化鐵使阪崎腸桿菌胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)過氧化水平顯著上升，而添加ROS清除劑NAC和鐵死亡抑制劑Lip-1可以降低氯化鐵對(duì)細(xì)胞的殺菌效果，說明氯化鐵對(duì)阪崎腸桿菌的殺菌作用為鐵死亡現(xiàn)象。

關(guān)于鐵死亡的研究，以其作為一種新型腫瘤的治療手段越來越受到人們的關(guān)注[23]。鐵死亡是一種新型的細(xì)胞死亡形式，其中鐵的積累是鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵因素之一[24]，這是一種鐵依賴性的非凋亡式細(xì)胞壞死，體外鐵過載或體內(nèi)鐵代謝調(diào)控異常就會(huì)導(dǎo)致鐵死亡。鐵死亡在形態(tài)學(xué)、生化和遺傳學(xué)上均與細(xì)胞凋亡、壞死和自噬不同，主要特征是大量的鐵離子依賴性脂質(zhì)過氧化物累積[19]。鐵死亡的發(fā)生涉及多種信號(hào)通路的參與，包括系統(tǒng)Xc-的抑制、GPX4的抑制、VDACs的激活、FSP1的抑制、鐵代謝調(diào)控途徑、脂質(zhì)代謝調(diào)控途徑等[25-28]。

由于病原細(xì)菌、病原真菌與哺乳動(dòng)物同源性較低，外源性鐵誘導(dǎo)病原菌發(fā)生鐵死亡的分子機(jī)制與哺乳動(dòng)物不同。如黃曲霉外源性鐵死亡就不依賴于芬頓反應(yīng)(哺乳動(dòng)物鐵死亡機(jī)制)，而是外源Fe2+進(jìn)入黃曲霉胞內(nèi)，激活NoxA，造成胞內(nèi)ROS爆發(fā)，通過脂質(zhì)過氧化引發(fā)膜損傷，導(dǎo)致黃曲霉孢子的壞死[29]。因此，下一步應(yīng)以阪崎腸桿菌脂質(zhì)過氧化的發(fā)生為切入點(diǎn)，深入解析氯化鐵等鐵鹽誘導(dǎo)阪崎腸桿菌發(fā)生外源性鐵死亡的分子機(jī)制，為開發(fā)新型殺菌劑奠定理論基礎(chǔ)。