牦牛角藥用功效及物質(zhì)基礎(chǔ)研究進展與資源化利用展望△

趙晶晶，劉睿，武文星，朱昭穎，宿樹蘭，晉玲，昂青才旦，段金廒*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 南京 210023；

2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 教育部中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000；

3.青海藏醫(yī)院，青海 西寧 810007

牦牛角是牛科動物牦牛Bos grunrtiensL.（藏族語稱yak）的犄角，是傳統(tǒng)藏族醫(yī)藥學(xué)中的一種特有藥材[1]。牦牛角呈圓錐形，角先向上，再向外，近末端復(fù)向內(nèi)向上，角尖略向后彎；表面呈棕黑色或灰黑色，全角中上部富有光澤，中下部則有縱裂紋及堅硬刺手的疏毛，靠近基部有粗糙狀環(huán)紋，習(xí)稱“角輪”；基部略扁，鋸口面類圓形，內(nèi)有堅硬質(zhì)重的角柱，習(xí)稱“骨塞”，骨塞長度約占全角的2/3，表面有突起的縱棱，與其外部角鞘通過軟組織緊密嵌合，內(nèi)部光滑致密有珍珠光澤；質(zhì)堅硬，氣微腥，味酸、咸[2]。

本文綜述了牦牛角的化學(xué)成分組成、生物活性評價、藥用價值體現(xiàn)、資源化利用等方面的研究進展，并就加強牦牛角的醫(yī)藥領(lǐng)域的基礎(chǔ)性研究、研究與制定牦牛角藥材標(biāo)準(zhǔn)、重視牦牛角藥用價值的深度挖掘等方面提出了若干建議，以期為牦牛角這一寶貴民族動物藥資源的多元化、高值化利用提供參考。

1 牦牛角功效物質(zhì)基礎(chǔ)

1.1 蛋白質(zhì)及含巰基多肽類

牦牛角入藥部分為外層角鞘，主要成分為角蛋白等蛋白質(zhì)及多肽類物質(zhì)?；谕凰貥?biāo)記相對和絕對定量技術(shù)（iTRAQ），從角類動物藥（犀角、廣角、羚羊角、水牛角、牦牛角、藏羚羊角、山羊角）中鑒定出591個蛋白質(zhì)，主要為Ⅰ型角蛋白（KRT）、Ⅱ型KRT 等與連接蛋白（junction plakoglobin、plakophilin、desmoglein 等）[3-4]?；诘鞍踪|(zhì)類成分定量分析，結(jié)合多元統(tǒng)計方法對蛋白質(zhì)類型、蛋白質(zhì)相對含量歸類比較，結(jié)果表明牦牛角與犀角的蛋白質(zhì)類成分組成接近。采用二維電泳（2-DE）聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法（MALDITOF-MS）對牦牛角中的蛋白質(zhì)成分進行分析，鑒定出5個與活性相關(guān)的蛋白質(zhì)成分[5]。

KRT是一種由長而中空的纖維小管組成的復(fù)合構(gòu)造，通過硫交聯(lián)（-S-S-）來完成纖維與基體中間的連接[6]。然而，這些含-S-S-鍵的蛋白質(zhì)在特定條件下降解及-S-S-鍵斷裂，可形成含有巰基（-SH）的多肽、寡肽類物質(zhì)。采用熒光衍生法測定巰基含量，間接表征角類動物藥中含巰基的多肽、寡肽類含量，結(jié)果顯示白牦牛角、黑牦牛角、花牦牛角水提液中的巰基濃度分別為56.5、66.0、69.0 mol·L-1，三者差異較小[7]。

1.2 氨基酸類

采用薄層色譜法及氨基酸分析儀分別對牦牛角中的水解氨基酸進行分析，結(jié)果表明牦牛角中含有19 種水解氨基酸，分別為谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、鳥氨酸、色氨酸。牦牛角所含的人體必需7 種氨基酸中，亮氨酸質(zhì)量分數(shù)最高（4.27%～8.58%），其次分別為蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸。牦牛角中嬰幼兒必需的精氨酸質(zhì)量分數(shù)較高，為6.81%～11.28%[8]。以鄰苯二甲醛柱前衍生法測定白、花、黑3 色牦牛角中?；撬豳|(zhì)量分數(shù)，分別為24.3、32.8、36.4 μg·g-1。對羚羊角、藏羚羊角、犀角、廣角、牦牛角、水牛角中水解氨基酸及必需氨基酸進行聚類分析及相似性評價，結(jié)果表明牦牛角在氨基酸組成方面與犀（廣）角最接近[9]。索有瑞等[10]對青海不同地區(qū)牦牛角中17 種氨基酸的含量進行分析，結(jié)果表明玉樹州牦牛角中氨基酸總量最高，其次為海北州、海南州、黃南州。

1.3 核苷類

采用親水作用色譜-超高效液相色譜-三重四聯(lián)串聯(lián)質(zhì)譜法（HILIC-UPLC-QQQ-MS/MS）對羚羊角、藏羚羊角、犀角、廣角、牦牛角、水牛角等角類動物藥中14 種核苷和堿基進行定性和定量分析，結(jié)果表明牦牛角中含胸腺嘧啶、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、鳥嘌呤、鳥苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、2′-脫氧肌苷、腺苷、胸苷、尿苷、胞苷13 種核苷及堿基成分，總質(zhì)量分數(shù)為218.02～248.80 μg·g-1。以層次聚類分析和主成分分析對核苷類成分測定結(jié)果進行歸類分析，結(jié)果表明牦牛角的核苷與堿基含量組成上與犀角相近[11]。

1.4 宏微量元素類

采用原子吸收分光光度法及原子熒光光度法分析白、花、黑3 色牦牛角中的鉛、鎘、銀、汞、硒、錫、砷、硫、硅、磷、鋇、鋰、鎳、鍶、鈣、鉀、鎂、鈉、鋁、鉻、銅、鐵、錳、鋅24 種元素，采用統(tǒng)計方法對其進行聚類分析，結(jié)果表明花、白、黑3 種牦牛角，水牛角與犀（廣）角間的相似度趨近?；?、白、黑3種牦牛角之間無明顯差異[9]。

對青海不同地區(qū)（海北州、海南州、玉樹州、黃南州）牦牛角中的16種宏微量元素進行分析（表1），結(jié)果表明這些元素在牦牛角中長期蓄積的分布量隨地區(qū)不同存在較大的差異[12]。有研究者分別采用不同數(shù)學(xué)模型計算分析青海高原不同地區(qū)牦牛角中微量元素綜合得分，對產(chǎn)地質(zhì)量進行綜合評價，結(jié)果顯示海南州共和縣所產(chǎn)牦牛角質(zhì)量最優(yōu)，依次是玉樹州、海北州、海南州貴南縣、黃南州[13-16]。

表1 青海省不同地區(qū)牦牛角宏微量元素分析

1.5 其他類物質(zhì)

本課題組前期建立了動物角中膽固醇的高效液相色譜蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD），測得白、花、黑3 色牦牛角中游離膽固醇質(zhì)量分數(shù)分別為3.77、3.73、3.61 mg·g-1，總固醇質(zhì)量分數(shù)分別為3.890、3.964、3.627 mg·g-1；運用分光光度法對白、花、黑3 色牦牛角中的氨基己糖進行分析，質(zhì)量分數(shù)分別為1.932、1.899、1.923μg·g-1；甾類HPLC 圖譜相似度評價發(fā)現(xiàn)，3 種牦牛角、水牛角、藏羚羊角與犀（廣）角的甾類成分相近，無明顯差異[9]。對青海不同地區(qū)牦牛角的常規(guī)化學(xué)成分測定結(jié)果表明，牦牛角干物質(zhì)中以粗蛋白為主，平均質(zhì)量分數(shù)為82.7%，其次為粗脂肪、粗纖維。干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、灰分等主要化學(xué)成分質(zhì)量分數(shù)在海北州牦牛角中最高，其次為玉樹州、黃南州、海南州[10]。

2 生物活性

2.1 解熱活性

牦牛角超細粉對過期三聯(lián)疫苗-NS 致發(fā)熱家兔具有解熱作用，口服給予1.5 g·kg-1（以生藥量計）牦牛角后90 min 產(chǎn)生明顯的解熱作用，且作用維持到給藥后120 min[9,17]。經(jīng)熱提法所得的牦牛角中牦牛肽粗提取液對酵母致發(fā)熱小鼠具有解熱效應(yīng)[18-19]，并且呈劑量依賴性。比較分別以3、9 g·kg-1生藥劑量的西藏牦牛角與水牛角替代古方犀角湯中的犀角后對發(fā)熱家兔的解熱作用，結(jié)果表明以牦牛角替代的犀角湯給藥后60 min 表現(xiàn)出明顯的解熱作用，藥效維持4 h以上，解熱效應(yīng)優(yōu)于以水牛角替代的犀角湯[20]。采用微量熱技術(shù)表征羚羊角、山羊角、水牛角、牦牛角仿生提取液作用于模式生物（大腸埃希氏菌）時的生物反應(yīng)差異，以建立相應(yīng)的生物反應(yīng)指紋來評價動物角樣本的生物熱特性，結(jié)果表明羚羊角、山羊角、水牛角、牦牛角仿生提取液給藥后均減少了大腸桿菌生長的總熱量，提示羚羊角、山羊角、水牛角、牦牛角具有潛在的抗菌特性，與傳統(tǒng)角類藥物具有解熱作用觀念相一致[21]。基于活性導(dǎo)向?qū)﹃笈ｋ拇痔嵛锛瓣笈＝菬崽嵋哼M行分離，跟蹤分離產(chǎn)物的解熱鎮(zhèn)痛活性，結(jié)果表明牦牛角熱水提取液中肽類成分活性確切，這些肽類成分對熱穩(wěn)定，相對分子質(zhì)量＜30 kDa[18-19]。

2.2 鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛活性

采用光電法與協(xié)同戊巴比妥鈉睡眠實驗探究牦牛角鎮(zhèn)靜效應(yīng)，結(jié)果表明灌胃給予牦牛角（1.375、2.750、5.500 g·kg-1，以生藥量計）能明顯減少小鼠自發(fā)性活動次數(shù)及延長小鼠睡眠時間，且鎮(zhèn)靜作用呈一定劑量依賴性[9,22]。采用熱板法和醋酸扭體法探究牦牛角鎮(zhèn)痛效應(yīng)，結(jié)果表明牦牛角經(jīng)熱提及5%的堿提所得肽粗提物具有明顯的鎮(zhèn)痛活性[18-19]。采用醋酸扭體法探究經(jīng)熱提所得的牦牛角肽粗提物的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，結(jié)果表明牦牛角肽粗提物組小鼠扭體次數(shù)遠低于空白組小鼠，提示牦牛角肽粗提物具有較強的鎮(zhèn)痛活性[19]。

2.3 凝血與活血雙重活性

研究表明，經(jīng)不同提取方式得到的牦牛角提取物的凝血作用呈現(xiàn)雙重藥理學(xué)活性，采用毛細管法探究牦牛角超細粉對小鼠凝血時間的影響，口服給予5.5 g·kg-1生藥牦牛角超細粉后，小鼠凝血時間較空白對照組顯著縮短（P＜0.05），表明牦牛角原粉具有一定的促進凝血作用[9]。牦牛角超聲提取液可顯著延長家兔血漿復(fù)鈣時間、凝血酶時間和凝血酶原時間，具有良好的抗凝作用[23]。觀察牦牛角超聲提取液對家兔體外血栓溶解率和全血凝塊在12、24、48 h 溶解率以評價牦牛角的抗血栓作用，結(jié)果表明牦牛角超聲提取液對家兔體外血栓溶解率與空白組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），全血凝塊48 h溶解率可達94%，具有良好的抗血栓作用[23]。牦牛角的主要生物活性見表2。

表2 牦牛角生物活性

3 現(xiàn)代用藥劑型

角類藥物在使用方面尚存在有效成分溶出率低、患者順應(yīng)性差等劣勢。為此，有團隊研究了一種牦牛角新型藏藥飲片炮制方法[24]，即取牦牛角粉進行水解、超聲提取，得到濾液和濾渣，將濾渣進行2次提取，合并3 次濾液并調(diào)節(jié)pH，得到牦牛角提取液，加入輔料牛奶和黃酒后濃縮、干燥，得到牦牛角藏藥飲片。所制得的牦牛角藏藥飲片口服異味小、口感好，有效成分含量提高，炮制時間短，適合于工業(yè)生產(chǎn)。此外，制備牦牛角膠凝膠劑亦可改善溶出率與順應(yīng)性問題[25]，即將牦牛角進行破碎、漂洗、浸泡、砂燙，將砂燙后的牦牛角在pH 4.5～5.5 的條件下加入蛋白酶混合液酶解，然后煎煮，所獲煎煮液加入明礬攪拌、靜置，除沫后加入冰糖、黃酒、豆油和凝膠劑進行加熱濃縮，至清膠液開始掛旗呈稠膏狀，冷卻至半固體后切制、攤晾，獲得牦牛角膠，其L-羥脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸4 種氨基酸質(zhì)量分數(shù)平均提高97.20%。

4 建議與展望

動物藥資源是我國中醫(yī)藥體系的重要組成部分，在我國有悠久的應(yīng)用歷史，由于其臨床療效顯著，為歷代醫(yī)藥學(xué)家推崇，為民族健康與發(fā)展做出了獨特貢獻。近年來動物藥研究與開發(fā)備受關(guān)注，其相關(guān)科學(xué)研究逐漸深入和系統(tǒng)[26]。

4.1 牦牛角的傳統(tǒng)功效物質(zhì)基礎(chǔ)與生物學(xué)機制科學(xué)表征有待深入

相較于植物源藥材，我國動物源藥材的功效物質(zhì)等基礎(chǔ)性研究尚有較大差距，除了自身理化性質(zhì)較為復(fù)雜外，其蛋白質(zhì)類及雜化的糖蛋白、糖肽、糖脂等生物大分子物質(zhì)的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、活性表征和作用機制闡明均存在技術(shù)瓶頸，有待生命科學(xué)的進一步發(fā)展和生物化學(xué)與分子生物學(xué)的進步提供關(guān)鍵支撐。迄今，關(guān)于牦牛角的藥用價值研究以其解熱、鎮(zhèn)靜、凝血、抗血栓等活性的初步研究較多，尚缺乏系統(tǒng)深入的傳統(tǒng)功效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究。因此，需要進一步對牦牛角的蛋白質(zhì)類、多（寡）肽類、特殊氨基酸類、特征小分子類等多種類型化學(xué)組（成）分進行系統(tǒng)分析與活性評價，并結(jié)合生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)及多組學(xué)技術(shù)揭示牦牛角傳統(tǒng)功效的科學(xué)內(nèi)涵，為牦牛角新資源藥材的開發(fā)提供系統(tǒng)的科學(xué)證據(jù)。

類效物質(zhì)替代是解決動物藥資源供給不足的有效策略，人工牛黃、人工麝香已是成功的典范。揭示其功效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制，是類效物質(zhì)替代策略的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是替代產(chǎn)品創(chuàng)制的基礎(chǔ)和前提。圍繞珍稀角類動物性藥材的功效物質(zhì)及其替代性研究取得了一定的進展?；凇拔镔|(zhì)基礎(chǔ)-生物效應(yīng)-體內(nèi)過程”開展牦牛角、山羊角、水牛角替代羚羊角應(yīng)用基礎(chǔ)研究[27]，基于活性肽組釋放與類效性評價牦牛角、山羊角替代資源[28]，基于蛋白質(zhì)組的水牛角、山羊角替代羚羊角類效性研究[29]，基于“蛋白質(zhì)/肽組-修飾組”研究策略建立動物藥質(zhì)控新模式[30]等，對珍稀動物藥替代資源的發(fā)現(xiàn)進行了不懈的探索。

4.2 牦牛角的多元化高附加值產(chǎn)品開發(fā)利用亟待加強和深入

中藥資源學(xué)研究內(nèi)容貫穿于中藥資源生產(chǎn)與利用全過程，通過進一步集成現(xiàn)代科學(xué)體系中藥學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)與分析學(xué)、工程技術(shù)、信息技術(shù)等理論與方法，服務(wù)于中藥資源的合理生產(chǎn)與科學(xué)利用，為我國牦牛資源經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)鏈的延伸、資源利用效率和經(jīng)濟效益的提升、資源性產(chǎn)品的品質(zhì)提高等提供有力支撐，為充分挖掘和釋放青藏高原牦牛資源產(chǎn)業(yè)蘊含的巨大價值潛能提供有效的支持。通過科技賦能，逐步改變長期以來依賴自然資源和依靠粗放、廉價、低效的資源耗竭式發(fā)展方式和層次結(jié)構(gòu)相對較低的發(fā)展模式，不斷拓展和推動這一特色藥用動物資源多層次、多途徑開發(fā)模式的形成，必將造福于民族區(qū)域經(jīng)濟，豐富我國動物藥資源寶庫。

中藥資源是國家戰(zhàn)略資源，是中醫(yī)藥事業(yè)和中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。探索中藥資源的科學(xué)保護和合理開發(fā)利用，以及新資源發(fā)現(xiàn)和替代性研究等諸方面的理論和技術(shù)創(chuàng)新，保障中藥資源的可持續(xù)利用是中藥及民族藥物資源永恒的話題。隨著以中藥及天然藥物資源為原料的資源產(chǎn)業(yè)鏈日益延伸，中藥資源經(jīng)濟在國民經(jīng)濟和生物醫(yī)藥行業(yè)的地位日益凸顯，國內(nèi)外消費市場對綠色產(chǎn)品的需求不斷提高。應(yīng)采取積極的尋找替代和資源補償策略，聚焦藥用價值大、資源供給難的中藥材品種，采用行之有效的多元化手段，切實解決保障供給問題。