副溶血性弧菌產(chǎn)耐熱直接溶血毒素對黑色素瘤的抑制作用研究

楊蘭珠, 李詩怡, 鄭雯靜, 李 靜, 包哲隈, 楊靖亞

副溶血性弧菌產(chǎn)耐熱直接溶血毒素對黑色素瘤的抑制作用研究

楊蘭珠, 李詩怡, 鄭雯靜, 李 靜, 包哲隈, 楊靖亞

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院, 上海 201306)

為探討耐熱直接溶血毒素(Thermostabile direct hemolysin, TDH)在體內(nèi)和體外對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的抑制作用, 本研究通過MTT法、克隆形成試驗、凋亡試驗、Caspase-8和Caspase-3的活性試驗、線粒體膜電位的檢測以及體內(nèi)C57BL/6小鼠()荷瘤實驗, 比較TDH作用于不同細(xì)胞的半抑制濃度(IC50), 評價TDH對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的體內(nèi)外抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460、人正常肝細(xì)胞LO2、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16在TDH處理24 h之后, 細(xì)胞的半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為151、118、54和48 μg/mL, 正常細(xì)胞的IC50高出癌細(xì)胞近2～3倍。當(dāng)質(zhì)量濃度低于20 μg/mL時, TDH以劑量依賴性的方式抑制B16細(xì)胞的克隆形成, 6 mg/kg TDH在移植瘤模型中顯著抑制體內(nèi)腫瘤的生長(<0.001)。流式細(xì)胞術(shù)和熒光試劑盒檢測表明: 20 μg/mL的TDH能誘導(dǎo)19.4%的B16細(xì)胞發(fā)生早期凋亡, 并激活Caspase-8和Caspase-3, 但不影響線粒體膜電位。TDH具有體內(nèi)外的抗腫瘤活性, 可能通過細(xì)胞表面的死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號通路引起凋亡, 從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

海洋毒素; 耐熱直接溶血毒素; 抗腫瘤; 死亡受體; 凋亡

黑色素瘤是一種侵襲性生長的惡性腫瘤, 包括播散性黑色素瘤、結(jié)節(jié)狀黑色素瘤、肢端黑色素瘤、黏膜黑色素瘤、眼部黑色素瘤等9種亞型, 與黑素細(xì)胞系的侵襲性生長和早期擴(kuò)散有關(guān)[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示, 世界各地的黑色素瘤發(fā)病率和死亡率差異很大, 這主要與種族遺傳表型的差異以及陽光照射的差異有關(guān)[3]。臨床上黑色素瘤的典型療法是手術(shù)切除, 但對于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者, 單獨(dú)的手術(shù)治療不會完全治愈, 還需進(jìn)一步結(jié)合藥物治療。氮烯唑胺(dacarbazine, DTIC), 又稱達(dá)卡巴嗪, 是治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的一線藥物, 但它仍存在許多弊端, 如臨床效率低、患者生存期無明顯延長、大多數(shù)患者出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)[4-5]。因此, 尋找新型、高效的藥物對治療黑色素瘤有重要的臨床意義。

細(xì)菌毒素是新型抗腫瘤藥物開發(fā)的重要研究熱點(diǎn)[6], BRIGOTTI等[7]發(fā)現(xiàn)由致病大腸桿菌產(chǎn)生的Stx1毒素與表達(dá)神經(jīng)酰胺三己糖苷的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合后, 增強(qiáng)了環(huán)磷酰胺對淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。KREITMAN等[8]構(gòu)建了一種含有抗CD22抗體Fv段與截短的銅綠假單胞菌()外毒素的融合毒素, 并進(jìn)行了I期臨床實驗, 結(jié)果顯示3個周期的治療對白血病效果顯著。耐熱直接溶血毒素(Thermostabile direct hemolysin, TDH)是由革蘭氏陰性菌副溶血性弧菌()分泌的一種破壞細(xì)胞膜的海洋細(xì)菌毒素, 被認(rèn)為是通過海鮮傳播引起急性腸胃炎的主要病原體之一[9]。通常情況下該毒素蛋白具有由兩個相同亞基組成的二聚體結(jié)構(gòu), 其分子量為42 kDa[10]。研究報道TDH可顯著降低小鼠腫瘤模型的腫瘤體積[11], 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系的增殖[12]。因此, 它對治療腫瘤開辟了新的可能性。本研究主要通過皮下注射B16細(xì)胞構(gòu)建小鼠()黑色素瘤模型, 通過瘤周給藥的方式觀察TDH對小鼠黑色素瘤生長的影響。此外, 本文還通過體外細(xì)胞實驗研究了TDH對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響, 并探討其抗腫瘤活性的機(jī)理。以期為海洋生物毒素的抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論依據(jù), 同時為治療黑色素瘤提供新思路。

1 材料

1.1 耐熱直接溶血毒素TDH

實驗中使用的TDH毒素蛋白由本實驗室分離純化自致病性副溶血弧菌ATCC33846, 制備過程參照馬燕等[10]的方法。

1.2 細(xì)胞

小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16、人肝癌細(xì)胞(SMMC- 7721)來自中國科學(xué)院細(xì)胞庫, 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(NCM460)和人正常肝細(xì)胞(LO2)由華東理工大學(xué)劉建文教授惠贈。

1.3 小鼠

從北京斯貝福生物技術(shù)有限公司購買30只7周齡的雄性C57BL/6小鼠(質(zhì)量20 g±2 g), 飼養(yǎng)于上海海洋大學(xué)實驗動物中心, 在室溫條件下晝夜循環(huán)自由進(jìn)食飲水。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.4 試劑

Annexin V凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位JC-1試劑盒(BD pharmingen公司), Caspase-8活性試劑盒、Caspase-3熒光檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司), 喜樹堿(上海四環(huán)生物技術(shù)有限公司), 氮烯唑胺(美國APExBIO公司), BSA牛血清蛋白(上海正極生物有限公司), DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、小牛血清(上海普飛生物有限公司), 瑞氏-姬姆薩染色液、快速吉姆薩染液(生物工程股份有限公司), MTT、胰酶、PBS、生理鹽水(上海碧云天生物技術(shù)有限公司), 甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司), 二甲基亞砜(北京索萊寶科技有限公司)等。

1.5 儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(美國Thermo公司), 冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司), 倒置顯微鏡(Olympus公司), 流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)等。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

B16細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中孵育, NCM460細(xì)胞和LO2細(xì)胞在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞置于37℃、含有5%CO2的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

2.2 細(xì)胞毒性實驗

將對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于無菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 培養(yǎng)液體積為100 μL/孔, 每組設(shè)5個復(fù)孔, 于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。待細(xì)胞貼壁后, 加入不同質(zhì)量濃度的TDH(0、15、30、60、120、240 μg/mL)孵育24 h, 然后向每孔中加入10 μL MTT(質(zhì)量濃度為5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h。隨后棄去上清液并用PBS洗滌細(xì)胞, 每孔加100 μL二甲基亞砜, 置搖床上振蕩10 min, 使沉淀充分溶解。用酶標(biāo)儀在波長為570 nm處測定各孔吸光度, 采用改良寇氏法計算出每株細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50。

改良寇氏法: Log IC50=X–×(–(3–P–P)/4)

式中,X為Log最大藥物劑量,為Log(最大藥物劑量/相鄰劑量),為陽性反應(yīng)率之和,P為最大陽性反應(yīng)率,P為最小陽性反應(yīng)率

2.3 克隆形成試驗

收集對數(shù)生長期的B16細(xì)胞, 吹打成均勻的細(xì)胞懸液并進(jìn)行計數(shù), 將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個/mL。取一塊無菌的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 每孔加入1 mL上述細(xì)胞懸液, 培養(yǎng)過夜。第二天, 棄去培養(yǎng)液, 加入含不同質(zhì)量濃度TDH(0、2.5、5、10 μg/mL)的新鮮培養(yǎng)液, 孵育24 h后, 棄去培養(yǎng)液, PBS洗滌1次, 用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞, 顯微鏡下計數(shù), 將細(xì)胞密度調(diào)整為500個/mL。取6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿, 每皿加2 mL細(xì)胞密度為500個/mL的細(xì)胞懸液, 每個濃度梯度3個重復(fù)。小心將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱, 在37℃、5%CO2恒定的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)3周。

從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿, PBS小心清洗細(xì)胞2次, 盡可能除去殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞碎片。每個培養(yǎng)皿中加2 mL甲醇溶液處理15 min, 固定細(xì)胞, 棄去固定液, 加入2 mL快速吉姆薩染液, 室溫下作用20 min, 倒去染色液, 采用浸洗的方式吸取剩余的染色液, 將細(xì)胞培養(yǎng)皿倒置在鋪有吸水紙的超凈工作臺內(nèi)自然晾干后。光學(xué)顯微鏡下, 每個細(xì)胞培養(yǎng)皿取5個隨機(jī)視野拍照并統(tǒng)計大于8個細(xì)胞的克隆數(shù), 最后計算細(xì)胞克隆形成率(細(xì)胞克隆形成率=平均每皿細(xì)胞克隆數(shù)/每皿中加入的細(xì)胞數(shù)× 100%)。

2.4 體內(nèi)實驗

將B16細(xì)胞(100 μL/只, 5×105個細(xì)胞/100 μL)接種到8周齡雄性C57BL/6小鼠的左后肢皮下, 7 d后當(dāng)可觸及的腫瘤形成后(50 mm3), 將小鼠隨機(jī)分為5組, 每組6只。瘤周給藥的方式給予不同劑量的TDH(2、4、6 mg/(kg/d))、PBS(陰性對照)、氮烯唑胺(10 mg/(kg/d), 陽性對照), 連續(xù)7 d給藥, 每日1次。同時每2 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤垂直側(cè)的最大直徑(a)和長度(b), 腫瘤體積按照(a×b2/2) cm3計算。實驗結(jié)束時, 從尾部取20 μL血液置于干凈的載玻片上, 再取一張干凈光滑的載玻片, 以30°～ 45°的角度平滑地推開血液。干燥后, 用瑞氏-姬姆薩染色液染色。紅細(xì)胞個數(shù)用ImageJ軟件進(jìn)行計數(shù), 以各個視野中平均數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析, 白細(xì)胞計數(shù)(×109/L)=高倍鏡視野中白細(xì)胞平均個數(shù)×2× 109/L[13]。

最后采用頸椎脫臼的方式處死所有小鼠, 取出腎臟、大腦、心臟、肝、脾臟和肺。所有器官用生理鹽水洗滌, 然后稱質(zhì)量, 并計算臟器系數(shù), 臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。

2.5 細(xì)胞凋亡實驗

取對數(shù)生長期的B16細(xì)胞, 以 2×105個/孔接種于無菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 37 ℃過夜培養(yǎng)。加入終質(zhì)量濃度分別為5、10、20 μg/mL TDH的培養(yǎng)基, 陰性對照組加入等體積的PBS, 處理24 h后用胰酶(不含EDTA)消化并收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞樣品用預(yù)冷的PBS溶液洗滌2遍, 加入凋亡試劑盒中提供的1× Binding Buffer, 將B16細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/mL。取出其中100 μL細(xì)胞液(1×105個)至新的EP管中, 分別加入凋亡試劑盒中提供的5 μL Annexin V-FITC以及5 μL碘化丙啶試劑, 小心混勻, 室溫下避光孵育20 min。每個樣品中再分別加入400 μL 1×Binding Buffer溶液, 用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞總凋亡率(%)=第二象限細(xì)胞凋亡率(晚期凋亡)+第四象限細(xì)胞凋亡率(早期凋亡)[14]。

2.6 細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-8的活性分析

B16細(xì)胞在含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中用20 μg/mL TDH處理。在第0、3、6、9、12、15、18和24 h時分別按照Caspase-8活性試劑盒和Caspase-3熒光檢測試劑盒的要求處理B16細(xì)胞, 用酶標(biāo)儀檢測波長在405 nm處的吸光度以評價Caspase-8的活性, 另外Caspase-3活性檢測的激發(fā)波長為485 nm, 發(fā)射波長為535 nm。

2.7 線粒體膜電位

B16細(xì)胞在6孔細(xì)胞板中培養(yǎng), 在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的TDH(0、5、10、20 μg/mL)、PBS(陰性對照)或0.25 μg/mL喜樹堿(陽性對照), 37℃下孵育24 h。然后收集細(xì)胞, 按照J(rèn)C-1試劑盒的說明, 用親脂性物質(zhì)JC-1進(jìn)行染色, 染色結(jié)束后用流式細(xì)胞儀分析B16細(xì)胞膜電位的變化趨勢。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 TDH的細(xì)胞毒性作用

所有細(xì)胞系經(jīng)不同濃度的TDH處理后培養(yǎng)24 h, 使用MTT法測定細(xì)胞活力。從表1可以看出, 不同細(xì)胞系的IC50值有所不同。B16細(xì)胞對TDH最為敏感, IC50值為48 μg/mL。其次是人肝癌細(xì)胞(SMMC- 7721), 而正常細(xì)胞(NCM460和LO2)對TDH不敏感。以上結(jié)果說明TDH對腫瘤細(xì)胞具有良好的選擇性殺傷效應(yīng), 這對TDH用于腫瘤的治療具有積極的意義。

表1 TDH對不同細(xì)胞系的IC50

3.2 TDH對B16細(xì)胞克隆形成的影響

暴露于TDH后, 觀察B16細(xì)胞集落形成的情況。如圖1所示, 與對照組TDH質(zhì)量濃度為0 μg/mL相比較, TDH處理可顯著抑制B16細(xì)胞的集落形成能力, 且呈濃度依賴性(<0.001), 當(dāng)TDH質(zhì)量濃度為10 μg/mL, B16細(xì)胞克隆形成率降低至45.07%。并且對照組的單個細(xì)胞克隆中的B16細(xì)胞數(shù)量多于實驗組。由此可見, TDH可在體外顯著抑制B16細(xì)胞系的克隆形成。

圖1 TDH對B16細(xì)胞克隆形成的影響

與對照組比較, **.<0.01, ***.<0.001

Compared with control group, **.<0.01, ***.<0.001

3.3 TDH對移植瘤模型體內(nèi)腫瘤生長的影響

TDH對通過移植B16細(xì)胞引起小鼠體內(nèi)黑色素瘤生長的影響如圖2所示, 6 mg/kg TDH實驗組和陽性對照組(dacarbazine, 氮烯唑胺)小鼠的腫瘤體積均顯著低于陰性對照組(PBS處理)小鼠的腫瘤體積(< 0.001), 且6 mg/kg TDH實驗組小鼠的腫瘤體積要小于陽性對照組。而2 mg/kg TDH實驗組和4 mg/kg TDH實驗組的小鼠腫瘤體積與陰性對照組均無顯著差異。此外, TDH和氮烯唑胺處理對荷瘤小鼠血細(xì)胞數(shù)量的影響如表2所示, 與陰性對照組相比, TDH處理不影響白細(xì)胞和紅細(xì)胞的數(shù)量, 而陽性對照氮烯唑胺可顯著減少小鼠紅細(xì)胞數(shù)量(<0.001)。從表3可以看出, TDH和氮烯唑胺對荷瘤小鼠的各個臟器系數(shù)均無影響。這些結(jié)果表明, TDH在抑制黑色素瘤發(fā)展的有效劑量范圍內(nèi)對心、肝、脾、肺、腎、腦等器官和血液沒有表現(xiàn)出明顯的毒性, 提示TDH是阻止黑色素瘤發(fā)展的潛在抑制劑。

3.4 TDH對B16細(xì)胞凋亡的影響

用0、5、10、20 μg/mL TDH處理B16細(xì)胞24 h后, FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明(圖3), TDH濃度為0 μg/mL時B16細(xì)胞凋亡率為3.2%, 而TDH濃度為20 μg/mL時細(xì)胞凋亡率增加到19.4%(<0.001)。這表明誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是TDH抑制黑色素瘤的重要機(jī)制之一。

圖2 TDH對小鼠體內(nèi)黑色素瘤的影響

與陰性對照組(PBS)比較, ***.<0.001

Compared with negative control group(PBS), ***.<0.001

表2 TDH和氮烯唑胺對荷瘤小鼠血細(xì)胞的影響

表3 TDH對荷瘤小鼠臟器系數(shù)的影響

圖3 TDH誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的作用

與對照組比較, ***<0.001

compared with control group, ***<0.001

3.5 TDH對B16細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-8激活的影響

半胱氨酸蛋白酶(Caspases)是一種蛋白水解酶, 在控制細(xì)胞死亡中起著重要作用。在TDH處理后, Caspase-8和Caspase-3分別在6和8 h被激活(圖4a和4b), 說明TDH激活Caspase-8之后, 引起了下游信號分子Caspase-3的活化, 提示TDH可誘導(dǎo)Caspase級聯(lián)反應(yīng), 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.6 TDH對B16細(xì)胞線粒體膜電位的影響

在哺乳動物細(xì)胞中, Caspase-3依賴的凋亡由兩條途徑啟動: 細(xì)胞表面死亡受體的外源性途徑或線粒體起始的內(nèi)源性途徑[10, 15]。用0、5、10、20 μg/mL TDH刺激B16細(xì)胞24 h后, 檢測到線粒體膜電位的變化趨勢。圖5結(jié)果顯示, 不同濃度TDH刺激的B16細(xì)胞與陰性對照組細(xì)胞的線粒體膜電位無明顯差異, 提示TDH誘導(dǎo)的B16細(xì)胞凋亡與線粒體膜電位無關(guān)。結(jié)合圖4, 說明TDH是通過細(xì)胞表面的死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑從而誘發(fā)Caspase-3級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

圖4 TDH對B16細(xì)胞中Caspase-3(a)和Caspase-8(b)激活的影響

圖5 TDH對B16細(xì)胞線粒體膜電位的影響

4 討論

黑色素瘤是一種由黑素細(xì)胞引起的惡性皮膚癌。由于黑素細(xì)胞分布相對廣泛, 如皮膚、葡萄膜、黏膜、直腸等, 所以黑色素瘤可能無處不在[16-19]。對于早期患者, 黑色素瘤通過手術(shù)切除即可, 并且存活率很高, 但轉(zhuǎn)移后存活率顯著下降。對于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療而言, 過去10年開發(fā)的幾種新藥極大地改善了轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的預(yù)后[20]。然而, 大多數(shù)患者對這些藥物治療沒有表現(xiàn)出持久的反應(yīng)。因此, 亟待開發(fā)更有效的黑色素瘤治療藥物。

近年來, 研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和細(xì)菌毒素具有潛在的抗癌活性。鏈球菌()和梭狀芽孢桿菌(spp.)是最早被用作抗癌劑的細(xì)菌[21]。目前新式梭狀芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌()、化膿性鏈球菌() OK-432等是常見的細(xì)菌抗癌劑, 主要用于子宮肌瘤、淋巴瘤等實體瘤的治療[22-24]。細(xì)菌毒素是一種有價值的癌細(xì)胞生長抑制因子, 具有抗腫瘤活性的細(xì)菌毒素分為兩類: 與腫瘤表面抗原結(jié)合的毒素和與配體結(jié)合的毒素[25]。如產(chǎn)氣莢膜弧菌()產(chǎn)生的腸毒素與結(jié)直腸癌細(xì)胞表面大量存在的claudin-3和claudin-4結(jié)合在一起, 使細(xì)胞失去滲透平衡而導(dǎo)致癌細(xì)胞的溶解[26]。近年來的研究表明, 副溶血性弧菌耐熱直接溶血毒素(TDH) 在直接殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮重要作用, 最終導(dǎo)致實體瘤的抑制或消退[10-12]。

本研究采用MTT法檢測發(fā)現(xiàn), 不同細(xì)胞系經(jīng)TDH處理后, 兩株人的正常細(xì)胞的IC50比B16細(xì)胞高出2～3倍。由此可知, TDH對腫瘤細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞, 對腫瘤細(xì)胞具有一定的選擇性。隨后研究TDH對B16細(xì)胞克隆形成的影響, 結(jié)果表明TDH能顯著抑制癌細(xì)胞的克隆形成。進(jìn)一步的移植瘤模型體內(nèi)實驗結(jié)果說明: 6 mg/kg TDH處理小鼠的腫瘤體積小于PBS和氮烯唑胺對照組; 同時與對照組相比, TDH處理不影響白細(xì)胞和紅細(xì)胞的數(shù)量, 對荷瘤小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦等器官的臟器系數(shù)沒有顯著影響, 表明TDH在抑制黑色素瘤發(fā)展的有效劑量范圍內(nèi)對小鼠的各種器官和血液沒有表現(xiàn)出明顯毒性。體外和體內(nèi)實驗結(jié)果提示TDH可能是治療黑色素瘤的潛在抑制劑。

進(jìn)一步的凋亡實驗、Caspase-8和Caspase-3的活性分析以及線粒體膜電位檢測發(fā)現(xiàn), TDH能有效誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡, 并依次激活Caspase-8和Caspase-3, 但不影響B(tài)16細(xì)胞的線粒體膜電位。由圖4、圖5結(jié)果分析可知, TDH誘導(dǎo)的凋亡可能屬于細(xì)胞表面死亡受體起始的外源性途徑。目前, 已知的死亡受體有8種: TNFR-1(又稱CD120a或p55)、FAS(CD95或Apo-1)、死亡受體3(DR3)、死亡受體4(DR4, TRAIL-R1)和死亡受體5(DR5, TRAIL-R2)、死亡受體6(DR6)、EDA-R(ectodermal dysplasia receptor)和NGF-R[27-28]。研究報道: DR3主要分布于淋巴組織, 如脾臟、胸腺以及外周血淋巴細(xì)胞, 包括淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[29]; FAS和NGF-R在正常組織細(xì)胞中高表達(dá), 在癌細(xì)胞中低表達(dá)[30-31]; DR6在正常組織細(xì)胞和癌細(xì)胞中均高表達(dá)[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)TDH對正常細(xì)胞和小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的毒性相差約2～3倍, 這一現(xiàn)象說明與正常組織比較, TDH結(jié)合的受體在B16細(xì)胞膜表面是高表達(dá)的, 可能是TNFR-1、EDA-R、DR4和DR5中的某一個或者一個目前尚未報道的新的受體。由此可推測TDH可能通過與腫瘤細(xì)胞膜表面高表達(dá)的死亡受體相互作用, 誘發(fā)了死亡受體起始的外源性途徑, 進(jìn)而激活了Caspase-8, 并順次激活Caspase-3, 最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡(圖6)。

圖6 TDH誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的可能信號通路

5 結(jié)論

綜上所述, 本實驗研究了TDH對黑色素瘤的抗腫瘤作用, 發(fā)現(xiàn)TDH顯著抑制了小鼠體內(nèi)腫瘤的生長和體外B16細(xì)胞的增殖, 并促進(jìn)B16細(xì)胞的凋亡。其作用機(jī)制可能是通過與腫瘤細(xì)胞膜表面高表達(dá)的死亡受體相互作用, 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡, 從而達(dá)到治療黑色素瘤的目的, 但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Study on the inhibitory effect of thermostable direct hemolytic toxin fromon melanoma

YANG Lan-zhu, LI Shi-yi, ZHENG Wen-jing, LI Jing, BAO Zhe-wei, YANG Jing-ya

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

This paper aims to investigate the inhibitory effect of thermostable direct hemolysin (TDH) on B16 mouse melanoma cellsand. The half maximal inhibitory concentration (IC50) of TDH on different cells were compared, and the inhibitory effect of TDH on B16 mouse melanoma cellsandwas evaluated using MTT assay, clone formation test, apoptosis test, activity test of caspase-8 and caspase-3, detection of mitochondrial membrane potential, and tumor-bearing test of C57BL/6 mice. After 24 h of TDH treatment, the IC50of human colon epithelial cell NCM460, human liver fibroblast LO2, human liver cancer cell SMMC-7721, and mouse melanoma cell B16 were 151 μg/mL, 118 μg/mL, 54 μg/mL, and 42 μg/mL, respectively. The IC50of normal cells was 2–3 times higher than that of cancer cells. TDH could inhibit the clonal formation of B16 cells in a dose-dependent manner below a concentration of 20 μg/mL. TDH at 6 mg/kg significantly inhibited tumor growthin the transplanted tumor model (<0.05). Flow cytometry and fluorescent reagent detection revealed that 20 μg/mL TDH could induce early apoptosis in B16 cells by 19.4% and activate caspase-8 and caspase-3, but it had no effect on mitochondrial membrane potential.TDH has antitumor activity bothand. It may induce apoptosis via the apoptosis signal pathway mediated by the death receptor on the cell surface, thereby acting as an antitumor agent.

Marine toxins; thermostable direct hemolytic toxin; antitumor; death receptor; apoptosis

Mar. 28, 2022

R979.1

A

1000-3096(2022)08-0121-09

10.11759/hykx20220328006

2022-03-28;

2022-06-14

上海市教委高原學(xué)科中青年人才培育項目(A1-3203-20-100617)

[Young and Middle-aged Talents Cultivation Project of Top Disciplines of Shanghai Municipal Education Commission, No. A1-3203- 20-100617]

楊蘭珠(1995—), 女, 河南信陽人, 碩士研究生, 主要從事腫瘤藥理學(xué)研究, E-mail: yanglanzhuy@163.com; 楊靖亞(1978—),通信作者, E-mail: jyyang@shou.edu.cn

(本文編輯: 譚雪靜)