朱纓花抗氧化物質(zhì)含量及花青素組分分析

李成悅，陳麗芳，范 全，賀朋飛，邱棟梁

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002)

朱纓花(CalliandrahaematocephalaHassk.)俗名：紅合歡、美蕊花、紅絨球、美洲合歡，原產(chǎn)于南美，如今在我國福建、廣東、臺灣等地有引種。朱纓花喜光，生長茂盛，頭狀花序腋生，花絲離生部分鮮紅色，雄蕊管白色，株形緊湊，并且花型獨(dú)特酷似一團(tuán)絨球，花期長，花色絢麗，在盛花時節(jié)滿樹紅花；并且葉片可以吸收空氣中硫氧化物，起到凈化空氣、美化環(huán)境的作用；是冬季園林綠化中一類優(yōu)良木本觀賞花卉[1-3]。

花青素是一類水溶性色素，存在于植物花瓣、果實(shí)等部位，屬于多酚類化合物中類黃酮物質(zhì)[4]?；ㄇ嗨卦谑称饭I(yè)中被稱為人體第7大必需營養(yǎng)素[5]。目前已知有20種花青素，常見的花青素種類有矢車菊素、飛燕草素、天竺葵素、牽?；ㄋ亍㈠\葵素和芍藥花素等，若花瓣呈現(xiàn)紅色或粉紅色說明矢車菊素含量較高，呈現(xiàn)橙紅色說明天竺葵色素含量較高，若呈現(xiàn)藍(lán)色表明飛燕草色素含量較高[6-9]。目前，有關(guān)朱纓花花青素組分分析的研究較少。本研究旨在探究不同時期朱纓花花青素組分變化以及總酚和類黃酮含量變化，以期為提高朱纓花的使用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

朱纓花均采自福建農(nóng)林大學(xué)校園。隨機(jī)從植株的東、西、南、北各個方向采取健康生長處于花蕾期、盛花期、末花期的花朵各30朵，3次重復(fù)。不同時期朱纓花采樣標(biāo)準(zhǔn)見圖1：花蕾期的花苞閉合，處于顯色狀態(tài)(圖1a)；盛花期花朵花絲離生部分呈鮮紅色，其莢果線狀倒披針形，由頂至基部沿縫線開裂，果瓣外反(圖1b)；末花期花絲卷曲成團(tuán)，顏色加深(圖1c)。

圖1 不同時期的朱纓花

1.2 含水量的測定

隨機(jī)選取花蕾期、盛花期、末花期的新鮮花30朵，單個樣品取樣量為3 g，其質(zhì)量記為M1，放入60 ℃烘箱中48 h烘干至恒重取出用電子天平測其重量記為M2?；ǘ浜?%)=(M1-M2)/M1×100。

1.3 總酚含量測定

1.3.1 樣品提取液制備 新鮮花朵經(jīng)液氮研磨后用分析天平準(zhǔn)確稱取粉末0.5 g，將研磨充分的樣品倒入離心管中，加入2%的鹽酸甲醇溶液10 mL，超聲30 min后，4 ℃避光浸提24 h、11000 r·min-1條件下離心10 min，上清液即為提取液。每個處理3次重復(fù)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參考劉霞等[10]的測定方法，配制質(zhì)量濃度分別為 20、40、60、80、100 μg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL于離心管中，加入福林酚試劑0.5 mL和去離子水4 mL，搖勻后反應(yīng)5 min，加入7%Na2CO3溶液1 mL，室溫下避光放置2 h后，用UV5100H紫外分光光度計(jì)在765 nm波長處測定其吸光值。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品測定方法 分別取樣品溶液0.1 mL置于試管中，按1.3.2的方法處理后測定其吸光度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品干重的總酚含量(以每克朱纓花中含有沒食子酸的毫克數(shù)來表示)。

1.4 類黃酮含量測定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參考孫月婷等[11]有關(guān)類黃酮含量測定方法，配制質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.2 mL置于試管中，加入5%NaNO3溶液0.12 mL，震蕩混勻后靜置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.24 mL，震蕩混勻后靜置 6 min，后加入0.8 mol·L-1NaOH溶液，用0.44 mL雙蒸水稀釋；用UV5100H紫外分光光度計(jì)在510 nm處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 測定方法 取樣品提取液各0.4 mL于試管中，加入蒸餾水2 mL，按1.4.1的方法處理后測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算干重的類黃酮含量(以每克朱纓花中含有蘆丁的毫克數(shù)來表示)。

1.5 花青素含量測定

1.5.1 總花青素含量測定 參照魁小花等[12]的測定方法，取樣品提取液2 mL于試管中，用水稀釋至4 mL，震蕩搖勻。以2%甲醇鹽酸作為對照，用UV5100H紫外分光光度計(jì)在520nm處測定吸光度。計(jì)算朱纓花干重的花青素含量。

1.5.2 花青素各組分含量測定 參照錢大偉等[13]的測定方法，將制備的飛燕草素葡萄糖苷(Dp)、錦葵素-3-O-葡萄糖苷(Mv)、矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cy)、芍藥素葡萄糖苷(Pn)、天竺葵素-3-氯化葡萄糖苷(Pg)等標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用LC-100高效液相色譜儀測定液相圖譜標(biāo)識峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，液相圖譜標(biāo)識峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將樣品提取液經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后在色譜條件下進(jìn)行測定。進(jìn)樣量：20 μL；色譜柱C-18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；色譜條件：流動相A為水∶甲酸∶乙腈=40∶10∶50(體積比)，流動相B為水∶乙腈∶甲酸=87∶3∶10(體積比)，柱溫38 ℃，檢測波長520 nm，流速1 mL·min-1，梯度洗脫條件為：①0～15 min：6%～30% A；②15～30 min：30%～50% A；③30～35 min：50%～60% A；④35～40 min：60%～6% A。

1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010和GraphPad進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖；應(yīng)用LC-WS100色譜工作站軟件進(jìn)行HPLC圖譜繪制；利用IBM SPSS Statistics v26.0軟件的Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期朱纓花含水量的變化

不同小寫字母為差異顯著(P<0.05)， 下同。 圖2 朱纓花不同時期含水量圖

朱纓花不同時期含水量的變化見圖2。盛花期含水量最高，達(dá)46%；末花期的含水率最低，僅17%；兩者差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

2.2 朱纓花類黃酮及總酚含量比較

從圖3可知，總酚含量隨著花朵衰老呈下降趨勢，花蕾期總酚含量顯著高于盛花期、末花期，末花期總酚含量顯著降低。類黃酮含量隨著花朵衰老呈上升趨勢，在花蕾期、盛花期含量低，末花期含量顯著上升。

圖3 朱纓花類黃酮及總酚含量

2.3 朱纓花花瓣花青素組分及含量比較

由圖4可知，3個時期(花蕾期、盛花期、末花期)均在7、9、11、13、15 min左右開始出現(xiàn)單一高峰，這與標(biāo)準(zhǔn)品檢測到的時間相符合。對不同時期花青素含量進(jìn)行比較分析(圖5 a)可知，不同時期的花青素含量差異顯著(P<0.05)；末花期花青素含量均高于花蕾期、盛花期。采用HPLC對其花青素成分及含量進(jìn)行分析(圖5b)可知，矢車菊素是最主要的花青素組分，其花蕾期含量為118.42 μg·mL-1，占總花青素的70.77%，而天竺葵素、錦葵素、芍藥素、飛燕草色素含量分別為19.88%、3.51%、2.57%、3.3%；盛花期矢車菊素含量為86.39 μg·mL-1，占總花青素的67.43 %，天竺葵素、錦葵素、芍藥素、飛燕草素含量分別占花青素的25.62%、2.12%、2.52%、2.32%；末花期矢車菊素含量為122.14 μg·mL-1，占總花青素的59.85%，天竺葵素、錦葵素、芍藥素、飛燕草素含量分別占花青素的23.48%、4.68%、3.60%、3.05%。

3 結(jié)論與討論

花青素的生物活性較強(qiáng)，屬于天然食用色素，花色素清除DPPH和OH-自由基能力優(yōu)于Vc，清除ABTS+自由基的能力與Vc相當(dāng)[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，盛花期的花青素含量顯著低于花蕾期，可能在花苞形成早期已完成花青素的合成，花朵開放速度比花青素合成的速度快，且含水量顯著上升的結(jié)果。末花期花青素含量顯著高于盛花期，可能是隨著花朵衰老期含水量減少，花青素濃度呈上升趨勢。這與崔虎亮等[15]關(guān)于不同牡丹品種花期總花青素含量不斷積累，在衰敗期時達(dá)到最高的研究結(jié)果相一致，也與劉安成等[16]關(guān)于‘火焰’忍冬開花過程中冬末花期的總花青苷含量仍高于初花期的研究結(jié)果一致。

Dp為飛燕草素葡萄糖苷；Cy為矢車菊素葡萄糖苷；Pg為天竺葵素葡萄糖苷；Pn為芍藥素葡萄糖苷；Mv為錦葵素葡萄糖苷；下同。圖4 不同時期朱纓花花青素高效液相色譜圖

圖5 朱纓花干重時總花青素含量及組分

類黃酮化合物普遍存在于植物發(fā)育和防御過程，近年來在抑菌、抗氧化、清除自由基等藥理功能受到人們廣泛關(guān)注[17]。朱纓花末花期類黃酮的含量顯著高于盛花期以及花蕾期，推測在花青素積累的同時類黃酮含量增加的增色效應(yīng)是其末花期花的顏色加深的主要原因?？偡雍侩S著花朵的開放呈下降趨勢，3個時期總酚含量差異達(dá)到極顯著水平，這與植物酚類物質(zhì)具有清除自由基，抗氧化抗衰老的作用，且隨著花朵枯萎含水量下降，植物內(nèi)總酚含量呈逐漸下降趨勢相關(guān)。

開發(fā)和利用天然色素對保護(hù)人類身體健康具有重要意義，并在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)具有廣闊前景[18]。矢車菊素屬于天然食用色素，具有抗炎、抗癌、抗氧化、預(yù)防糖尿病、抑制腫瘤生長、保護(hù)心臟、增強(qiáng)血液循環(huán)和保護(hù)感受器細(xì)胞等作用[19-22]；矢車菊素增加肝細(xì)胞的抗氧化性，從而降低脂肪變性所引起的細(xì)胞氧化損傷[23]。從不同時期朱纓花花青素組分可以看出，矢車菊素是朱纓花最主要的花青素組分，因此今后從基因、分子等角度研究朱纓花色素的形成機(jī)制，對于增加朱纓花觀賞性及開發(fā)天然矢車菊素有重要的意義。

綜上所述，朱纓花中共檢測到5種花青素組分，分別是矢車菊素、天竺葵素、飛燕草素、芍藥素和錦葵素，矢車菊素為朱纓花中花青素的主要組分?；ㄇ嗨睾磕┗ㄆ谧罡撸ɡ倨诘目偡雍孔罡?，末花期的類黃酮含量最高。