CⅡTA基因沉默小鼠鼻息肉組織中膠原纖維沉積和炎癥反應(yīng)的初步研究

王書(shū)敬 ,李聰穎 ,張亞明 ,馬志云

1 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 耳鼻喉-頭頸外科,河南 開(kāi)封 475000;2開(kāi)封大學(xué) 醫(yī)學(xué)部,河南 開(kāi)封475000

慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis,CRS)是發(fā)生于鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎性疾病,在我國(guó)普通人群中的發(fā)病率高達(dá)8%[1],已成為一個(gè)重要的社會(huì)衛(wèi)生問(wèn)題。依據(jù)2018年中國(guó)慢性鼻竇炎診斷和治療指南,CRS在臨床上可以分為慢性鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps,CRSs NP)和慢性鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSw NP)兩種表型。雖然CRSw NP 和CRSs NP 在癥狀上有所重疊,但CRSw NP患者比CRSs NP 患者表現(xiàn)出更多的鼻部癥狀和更高的癥狀評(píng)分[2]。目前針對(duì)這兩種表型的治療都是采用以鼻用糖皮質(zhì)激素為代表的藥物和鼻內(nèi)鏡下鼻竇開(kāi)放手術(shù)為主,根據(jù)患者主觀癥狀嚴(yán)重程度及其對(duì)藥物的反映調(diào)整治療方案。然而,有些CRSw NP患者經(jīng)過(guò)目前治療指南推薦的規(guī)范治療后癥狀復(fù)發(fā)或得不到有效的控制,國(guó)內(nèi)研究統(tǒng)計(jì)隨訪CRSw NP患者術(shù)后3 a的復(fù)發(fā)率為55%[3]。

Ⅱ類反式激活因子(CⅡTA)作為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類蛋白表達(dá)的主轉(zhuǎn)錄共激活因子,在激活自適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[4]。MHC-Ⅱ類蛋白的缺失通過(guò)阻止CD4+T 輔助細(xì)胞(Th)的產(chǎn)生和B 細(xì)胞產(chǎn)生Th細(xì)胞依賴的抗體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[5]。研究證實(shí),通過(guò)體外轉(zhuǎn)染CⅡTAsiRNA 抑制樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)的CⅡTA 基因表達(dá)來(lái)降低MHC-Ⅱ及共刺激分子CD40、CD80和CD86分子水平,減弱DC將抗原提呈給T 細(xì)胞的能力,從而使免疫反應(yīng)處于低激活狀態(tài)[6]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立CⅡTA 基因沉默型的鼻息肉(nasal polyps,NP)小鼠模型(CⅡTA-/-+NP),分析CⅡTA-/-+NP小鼠出現(xiàn)CRSw NP后的病理表現(xiàn)及炎性因子表達(dá)情況,旨在從內(nèi)在型的角度研究CRS的發(fā)病本質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

WT小鼠(C57BL/6J,從杰克森醫(yī)療科技有限公司購(gòu)買(mǎi))12 只,雄性,8 周齡,體質(zhì)量20～25 g;CⅡTA-/-小鼠(從賽業(yè)生物購(gòu)買(mǎi))12只,雄性,8周齡,體質(zhì)量20～25 g。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照河南大學(xué)淮河醫(yī)院及河南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

1.2 小鼠NP模型制作

隨機(jī)選6只WT 小鼠和6只CⅡTA-/-小鼠,按照Mingyu L等人的方法[7]建立NP小鼠模型,步驟如下:第0 天和第5 天,將25 μg 卵清蛋白(OVA)和2 mg氫氧化鋁凝膠注射到實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔中,使其免疫;第12天至第19天,用6%(m/m)的OVA 行鼻內(nèi)灌注,每日1 次;此后,繼續(xù)用6%(m/m)的OVA 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠行鼻內(nèi)灌注,每周3次,連續(xù)12周,使其鼻腔炎癥持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。此外,從第8周至第14周,在鼻內(nèi)灌注OVA 后,用金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcus aureus enterotoxin B,SEB)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠行鼻內(nèi)灌注,每次10 ng,每周3次。其余6只WT 小鼠和6只CⅡTA-/-小鼠作為對(duì)照組,僅灌注磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。顯微鏡下觀察到NP 的形成和黏膜上皮層變化,鼻息肉形成標(biāo)準(zhǔn)包括黏膜層厚度增加、腺體結(jié)構(gòu)增生、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、局部有明顯的突起、呈息肉樣病變。為了避免個(gè)體差異的可能影響,將本實(shí)驗(yàn)分為以下4組:WT 組,WT 小鼠鼻內(nèi)僅灌注PBS;WT+NP組,WT 小鼠鼻內(nèi)灌注OVA+10 ng SEB 誘導(dǎo)NP模型;CⅡTA-/-組,CⅡTA-/-小鼠鼻內(nèi)僅灌注PBS;CⅡTA-/-+NP組,CⅡTA-/-小鼠鼻內(nèi)灌注OVA+10 ng SEB誘導(dǎo)NP模型。隨后將小鼠處死進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 HE染色

取各組小鼠鼻腔外側(cè)壁組織,石蠟切片,常規(guī)脫蠟水化,蘇木素及伊紅染色,中性樹(shù)膠封片。在光鏡下觀察NP組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.4 Masson三色膠原染色

石蠟切片脫蠟后用蒸餾水沖洗;蘇木精染色染色8 min,沖洗后用Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液(GDY1451,上海古朵生物科技有限公司)浸泡8 min;蒸餾水稍沖洗后,以2%(m/m)的冰醋酸水溶液浸洗片刻,用1%(m/m)的磷鉬酸水溶液分化3～5 min;不經(jīng)水洗,直接用苯胺藍(lán)染7 min,以1%(m/m)的冰醋酸水溶液浸洗片刻,用95%(v/v)的乙醇、無(wú)水乙醇、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。用Image J圖像分析軟件分析膠原容積分?jǐn)?shù),膠原容積分?jǐn)?shù)為膠原陽(yáng)性的藍(lán)色面積與組織總面積的百分比。

1.5 ELISA檢測(cè)

小鼠通過(guò)腹腔內(nèi)注射10%(v/v)的水合氯醛麻醉后行氣管切開(kāi)。將22號(hào)導(dǎo)管從氣管的開(kāi)口向后鼻孔的方向插入,1 mL PBS經(jīng)后鼻孔輕輕灌入,從前鼻孔收集液體。收集轉(zhuǎn)染48 h 后細(xì)胞上清液。根據(jù)各試劑盒使用說(shuō)明,用ELISA 檢測(cè)方法對(duì)各組細(xì)胞上清液中小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)及炎癥因子TNFα、IL-6、IL-17的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究資料統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)比較采用單因素方差分析,計(jì)量資料以表示,組間采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,Pearson 相關(guān)性分析觀察指標(biāo)的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1)WT+NP 組小鼠鼻黏膜下炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原沉積增加,CⅡTA-/-+NP組小鼠的鼻黏膜組織病理學(xué)變化較WT+NP 組小鼠輕。HE 染色顯示:WT 和CⅡTA-/-小鼠的鼻竇和鼻黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)整齊,排列整齊,黏膜下層無(wú)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或腺體增生(圖1);相反,WT+NP 組和CⅡTA-/-+NP組小鼠鼻竇和鼻黏膜上皮組織出現(xiàn)慢性炎癥表現(xiàn),上皮細(xì)胞壞死脫落,黏膜層厚度增加,腺體結(jié)構(gòu)增生,嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),局部有明顯的突起,呈息肉樣病變(圖2)。與WT+NP小鼠鼻黏膜相比,CⅡTA-/-+NP組小鼠的組織病理學(xué)變化輕。Masson染色可將細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原染色為藍(lán)色,實(shí)驗(yàn)顯示:WT 組和CⅡTA-/-組小鼠的黏膜的上皮下層、固有層、腺體及血管周圍藍(lán)色膠原較少(圖3)。WT+NP組和CⅡTA-/-+NP組小鼠的中藍(lán)色膠原沉積增多(圖4),相比之下,WT+NP組小鼠的鼻腔黏膜組織腺體增生明顯,腺體間膠原纖維沉積嚴(yán)重;后者鼻腔黏膜組織腺體增生和腺體間膠原纖維沉積情況較WT+NP組輕。

圖1 WT小鼠(A)和CⅡTA-/-小鼠(B)鼻黏膜HE染色圖像

圖2 WT+NP組小鼠(A)和CⅡTA-/-+NP組小鼠(B)鼻黏膜HE染色圖像

圖3 WT小鼠(A)和CⅡTA-/-小鼠(B)鼻黏膜Masson染色圖像

圖4 WT+NP組小鼠(A)和CⅡTA-/-+NP組小鼠(B)鼻黏膜Masson染色圖像

2)NP小鼠模型的鼻腔灌洗液中炎性因子(b FGF、TNF-α、IL-6、IL-17)濃度較對(duì)照組增多。CⅡTA-/-+NP 組黏膜中炎性因子濃度低于WT+NP組。各組小鼠鼻腔灌洗液經(jīng)過(guò)ELISA 檢測(cè)顯示,WT+NP 組和CⅡTA-/-+NP 組小鼠鼻黏膜中b FGF(圖5)、TNF-α(圖6)、IL-6(圖7)、IL-17(圖8)水平升高。然而,與WT+NP 組小鼠相比,CⅡTA-/-+NP 組小鼠鼻黏膜中b FGF、TNF-α、IL-6和IL-17的表達(dá)水平降低。

圖5 各組小鼠鼻腔灌洗液中bFGF濃度之間關(guān)系

圖6 各組小鼠鼻腔灌洗液中TNF-α濃度之間關(guān)系

圖7 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-6濃度之間關(guān)系

圖8 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-17濃度之間關(guān)系

3 討論

目前學(xué)界已達(dá)成共識(shí),CRS是由不同發(fā)病機(jī)制、不同臨床表現(xiàn)、不同預(yù)后的鼻竇炎癥組成的混合體,分為不同的臨床表型和內(nèi)在型。根據(jù)NP存在與否,CRS分為CRSw NP和CRSsNP2種臨床表型。區(qū)分這兩種表型相對(duì)簡(jiǎn)單,通過(guò)鼻內(nèi)窺鏡檢查和CT掃描成像技術(shù)即可完成。雖然治療上兩者采用相同的治療方案,但相比之下,CRSw NP的術(shù)后復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)高于后者。此外,長(zhǎng)期口服糖皮質(zhì)激素受到體重增加、免疫抑制和腎上腺皮質(zhì)功能減退等副作用的限制。為了拓寬新的NP治療方法,我們必須從內(nèi)在型的角度徹底去研究NP的病理生理學(xué)機(jī)制。

CRS內(nèi)在型包括了多層面的病理機(jī)制的研究,既包含鼻黏膜的上皮屏障功能障礙及纖毛運(yùn)動(dòng)功能異常,又包括分泌的上皮源性細(xì)胞因子和上皮下炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)(如嗜酸性粒細(xì)胞或中性粒細(xì)胞),鼻腔鼻竇組織的重塑,固有細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞反應(yīng),T 輔助細(xì)胞(Th1/Th2/Th17/Th22)的免疫學(xué)模式,以及這些細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子、化學(xué)介質(zhì)、抗體和補(bǔ)體等,這些構(gòu)成了龐大的分子生物網(wǎng)絡(luò)[8]。

CⅡTA 是抗原呈遞的主開(kāi)關(guān),在樹(shù)突狀細(xì)胞、成熟的B淋巴細(xì)胞以及活化的巨噬細(xì)胞中合成,并激活MHC-Ⅱ基因的表達(dá),從而引發(fā)免疫應(yīng)答[9]。Holtz等[10]研究發(fā)現(xiàn),滋養(yǎng)層細(xì)胞中缺乏CⅡTA可以保護(hù)胎兒在妊娠期間免受母體免疫系統(tǒng)的影響。Yang等[11]發(fā)現(xiàn)CⅡTA 基因的缺失可有效降低MHC-Ⅱ的表達(dá),從而抑制大鼠雪旺細(xì)胞的免疫原性。多發(fā)性硬化癥是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性、脫髓鞘性和神經(jīng)退行性疾病,抑制CⅡTA 有助于減弱多發(fā)性硬化癥后的炎癥反應(yīng)和癥狀[12]。另有研究顯示,CⅡTA 表達(dá)沉默在降低MHC 抗原復(fù)合物觸發(fā)的同種異體T 細(xì)胞反應(yīng)和同種異體移植排斥方面起著積極的作用。與野生型移植物相比,CⅡTA 缺陷型的心臟同種異體移植物存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)[13]。此前有研究[14]認(rèn)為,炎癥反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增殖和肌成纖維細(xì)胞分化與NP 的形成有關(guān)。數(shù)據(jù)[15]表明,CⅡTA 表達(dá)的下調(diào)是減輕肺成纖維細(xì)胞中膠原蛋白(COL1A2)抑制的原因。本實(shí)驗(yàn)顯示,CⅡTA-/-+NP組黏膜固有層內(nèi)藍(lán)色膠原纖維所占面積百分比少于WT+NP 組,表明CⅡTA 可能通過(guò)影響成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞參與NP鼻黏膜組織重塑過(guò)程,進(jìn)而強(qiáng)化組織的任性,增強(qiáng)對(duì)外界損傷的防御性能。b FGF、TNF-α、IL-6、IL-17作為4 種常見(jiàn)的鼻息肉組織中炎癥細(xì)胞因子,具有重要的免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)纖維化作用。本研究發(fā)現(xiàn),NP 組與非NP 組相比,表現(xiàn)出炎性因子(b FGF、TNF-α、IL-6、IL-17)的明顯增高,結(jié)果與之前類似研究[8]相符,但CⅡTA-/-+NP組小鼠鼻腔灌洗液中炎性因子的表達(dá)量低于WT+NP 組,兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明CⅡTA 參與了CRSw NP的慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程。

綜上所述,小鼠不表達(dá)CⅡTA 可通過(guò)減少黏膜中的膠原纖維沉積和炎性因子表達(dá)延緩NP的發(fā)展。結(jié)合本研究及相關(guān)文獻(xiàn),我們下一步將通過(guò)調(diào)控CⅡTA 轉(zhuǎn)錄上游因子SIRT1的活性,進(jìn)一步探討鼻息肉中膠原纖維沉積和炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制。